Биолюминесцентная визуализация in vivo нейронных клеток-предшественников человека в мозге мыши

Аннотация

Источник: Weber, R. Z., et al., Внутримозговая трансплантация и биолюминесцентное отслеживание in vivo нейронных клеток-предшественников человека в мозге мыши. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется метод биолюминесцентной визуализации in vivo генетически модифицированных нейронных клеток-предшественников человека, введенных в мозг мыши. Процесс включает в себя инъекцию люциферина, подготовку к визуализации и обнаружение биолюминесцентных сигналов от трансплантированных клеток в месте инъекции.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

Визуализация in vivo

1. Приготовление люциферина
   1. Разморозьте D-люциферин калийной соли при комнатной температуре (RT) и приготовьте свежий исходный раствор D-люциферина в концентрации 30 мг/мл в PBS.
   2. Стерилизовать исходный раствор через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется немедленное использование рабочего раствора. При необходимости растворенный люциферин можно хранить при температуре -20 °С. Однако длительное хранение может привести к ухудшению качества сигнала. Люциферин является светочувствительным реагентом; По возможности держите его подальше от прямых солнечных лучей. Можно также рассмотреть альтернативные субстраты, например, циклуки, для улучшения предела разрешения.
2. Imaging
   1. Первоначальная настройка
      ПРИМЕЧАНИЕ: Биолюминесцентная визуализация была выполнена с использованием системы визуализации in vivo (см. Таблицу материалов), состоящей из темной камеры и охлаждаемой камеры устройства с зарядовой связью (ПЗС).
      1. Дважды щелкните значок программы Living Image и выберите идентификатор пользователя из раскрывающегося списка.
      2. Нажмите кнопку «Инициализировать» в появившейся панели управления. Как только процесс инициализации будет завершен, температурное поле в панели управления станет зеленым.
      3. На панели управления установите флажки «Люминесцентный» и «Фото» и выберите «Автоэкспозиция» (~60 с). Выберите поле зрения (для этого протокола был выбран D/12,5 см). Введите высоту объекта (1,5 см) и выберите параметр «Использовать фокус высоты объекта». Вручную установите следующие параметры: большой биннинг, f/2, фильтр заблокированного возбуждения и фильтр открытого излучения.
   2. Определите количество D-люциферина для инъекции в концентрации 300 мг/кг массы тела.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная рекомендуемая доза составляет 150 мг/кг D-люциферина. Эта процедура была скорректирована в соответствии с протоколом, сообщающим о более высокой чувствительности при использовании 300 мг/кг.
   3. Введите люциферин внутрибрюшинно (внутримышечно).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если животное нуждается в успокоительном перед инъекцией, имейте в виду, что это может продлить время пиковой экспрессии люциферазы.
   4. Подождите 5 минут, затем обезболите животных непрерывной подачей изофлурана (4,5% в фазе индукции и 1,5-2% в фазе поддержания во время процедуры визуализации).
   5. Нанесите офтальмовизуальную смазку на глаза, затем побрейте усыпленных животных в области головы с помощью обычной бритвы для волос. Поместите животных в камеру визуализации и начните визуализацию через 15 минут после инъекции люциферина, нажав «Получить» на панели управления.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Расходные
Шприцевой фильтр; 0,22 мкм	TPP	99722
Оборудование
Грелка			Продукт выбора
Система визуализации In-Vivo (IVIS Lumina III с программным пакетом Living Imaging 4.2)	Perkin Elmer	CLS136334
Изофлуран Вапорайзер	Provet AG	330724
Фармацевтические препараты и реагенты
D-люциферин Калийная соль	Perkin Elmer	122799
Этанол; 70%			продукт выбора
Изофлуран (Изофлуран (1-хлор-2,2,2-трифторэтил-дифторметиловый эфир) 99,9%)	Provet AG	Все фармацевтические препараты были предоставлены кантональной аптекой, Цюрих, Швейцария
Офтальмологическая смазка (Ретинол пальмитат: 15,000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	Все фармацевтические препараты были предоставлены кантональной аптекой, Цюрих, Швейцария

материалы