Это метод для визуализации адгезии лейкоцитов к эндотелию в заготовленных под давлением. Техника позволяет изучать сосудистой адгезии при сдвиге потоков с различными внутрипросветного давления до 200 мм рт.ст. Таким образом имитировать-ING патофизиологических условиях высокого кровяного давления.
Методическая статья
Изображений адгезии лейкоцитов к эндотелия сосудов при высоких внутрипросветного давления
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
По всему миру гипертензия наблюдается примерно у четверти населения и является ведущим биомедицинским фактором риска смертности в глобальном масштабе. В сосудистой системе гипертензия связана с эндотелиальной дисфункцией и усилением воспаления, что приводит к развитию атеросклероза и различных патологических состояний, таких как хроническая болезнь почек.2, инсульт3 и сердечная недостаточность4Начальным этапом сосудистого воспаления, приводящего к атерогенезу, является адгезионный каскад, который включает в себя роллинг, тетеринг, адгезию и последующую трансмиграцию лейкоцитов через эндотелий. Рекрутирование и накопление лейкоцитов в эндотелии опосредованы повышением экспрессии молекул адгезии, таких как молекула адгезии сосудистых клеток-1 (VCAM-1), внутриклеточная молекула адгезии-1 (ICAM-1) и E-селектин, а также увеличением высвобождения цитокинов и хемокинов и повышением уровня активных форм кислорода.5. In vitro Такие методы, как анализы статической адгезии, помогают определить механизмы, участвующие в межклеточной адгезии, а также провести анализ молекул клеточной адгезии. Методы, применявшиеся в предыдущих in vitro исследования показали, что острое повышение давления на эндотелий может привести к адгезии моноцитов, усилению экспрессии молекул адгезии и воспалительных маркеров6 однако, как и во многих in vitro анализах; данные результаты не были получены в режиме реального времени в условиях физиологического кровотока, а также с использованием цельной крови. Таким образом, in vivo Данные анализы все чаще используются на моделях животных для демонстрации сосудистого воспаления и развития бляшек. Интравитальная микроскопия в настоящее время широко применяется для оценки адгезии, роллинга, миграции и трансмиграции лейкоцитов.7-9При объединении эффектов давления на адгезию лейкоцитов к эндотелию... in vivo исследования носят менее масштабный характер. В одном из таких исследований изучается влияние потока и сдвига на рост и ремоделирование артерий в режиме реального времени, однако оценка маркеров воспаления проводилась только с помощью иммуногистохимического анализа10Здесь мы представляем модель для регистрации адгезии лейкоцитов в режиме реального времени в интактных сосудах под давлением с использованием перфузии цельной крови. Данная методика является модификацией... ex vivo модель перфузии камер сосудов9 что позволяет проводить анализ адгезивных взаимодействий лейкоцитов с эндотелием в режиме реального времени в интактных сосудах. Наша модификация позволяет регулировать внутрипросветное давление до 200 мм рт ст, что дает возможность проводить исследования не только в условиях физиологического кровотока, но и при различных значениях давления. Ранее системы датчиков давления (pressure myography) использовались для наблюдения за стенкой сосудов и диаметром их просвета11 Помимо сокращения сосудов, в данной работе впервые в режиме реального времени демонстрируются лейкоцитарно-эндотелиальные взаимодействия. Здесь мы представляем метод с использованием сонных артерий, полученных от крыс и канюлированных в изготовленную на заказ проточную камеру, соединенную с флуоресцентным микроскопом. Камера с сосудом оснащена большим нижним покровным стеклом, что позволяет использовать объектив с большим диаметром и коротким рабочим расстоянием для визуализации сосуда. Кроме того, для дальнейшего изучения механизмов, контролирующих адгезию клеток, могут быть использованы определенные агонисты и/или антагонисты. Преимущества данного метода перед интравитальной микроскопией заключаются в отсутствии необходимости проведения инвазивной хирургической операции, что позволяет достичь более высокой пропускной способности. Данный метод также обеспечивает возможность локального применения ингибиторов к нужному сосуду, в то время как интравитальная микроскопия позволяет проводить только системное введение ингибиторов.
Протокол
1. Изоляция сонных артерий
- Euthanase10 неделя Sprague Dawley крыс с помощью CO 2 / O 2 удушья.
- Акцизный левой и правой общей сонной артерии с аорты и сердца обеспечения минимального растяжения сосудов.
- В ледяном холодном буфера Кребса отдельных сонных артерий от аорты и сердца и выполнять близкие рассечение.
- Имейте в изолированных сосудов Кребса на льду перед монтажом.
Приблизительный время = 45 минут
2. Грунтовка судно камеры
- В проксимальных и дистальных разъемы судно камеры заподлицо Кребса буфера поддерживаться при физиологических рН вливая карбогена газа (95% O 2, 5% СО 2) в буфере при 37 ° C.
- Обеспечить труб и канюли сбрасываются полностью и приведены в соответствие.
- Флеш Кребса буфера через P1 (проксимальный) и P2 (дистальный) преобразователей. Закрыть краны, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в преобразователями.
- Подключение датчиков к соответствующим разъемам и снова заподлицо более Кребса буфера гарантируя, что ни пузырьков воздуха. Закрыть краны на камеру.
Приблизительный время = 15 минут
3. Давления в камере судна
- Включите оборудование под давлением: давление серворуль, датчик давления, перистальтического насоса (рис. 1).
- С перистальтического насоса от давления и давления сервопривода на автоматических буфера запустить Кребса через трубы на 20 мм рт.ст. (наберите в 1), гарантируя, что ни пузырьков воздуха.
- Подключите трубку к закрытым датчик P2. Давление станет стабильным.
- Открытый P2 нажмите, чтобы судно камеры, чтобы избавиться от любых пузыри затем закрыть.
- Заполните ванну с буфером Кребса (5 - 7 мл).
Приблизительный время = 10 минут
4. Монтаж судно
- Под микроскопом рассекает место черные галстуки полиэстера на каждый канюли (рис. 2).
- Перемещение канюли и канюли держателей друг от друга и горе ¼ судна (дуга аорты конца) на P1 канюли. Обеспечить, чтобы не разорвать сосуд.
- Использование шприц с буфером Кребса мягко флеш избыток крови из сосуда через P1 преобразователя. Близко от Р1 к камере.
- Безопасность судна P1 канюли с полиэфирной галстук.
- Перемещение канюли / канюли держателей ближе для монтажа на P2 канюли.
- Горы дистального конца сосуда (~ ¼ длины) на дистальных канюли. Крепится с помощью полиэфирной галстук.
Приблизительный время = 20 минут
5. Поддержания давления судно
- Отрегулируйте канюли держателей чтобы убедиться в отсутствии согнуть или растянуть в сосуде.
- С P1 и P2 закрыта для камеры переключатель давления сервопривода с автоматического на ручной. Проверьте давление сервопривода нет постоянного уменьшения давления в течение 10 секунд. Если есть, то утечка происходит и соединения и датчики должны быть закреплены в месте.
- Отрегулируйте давление сервопривода в автоматический затем открыть Р2 к камере. Под микроскопом наблюдать судно расширяются, когда кран открыт для камеры.
- Переключатель давления сервопривода в ручной режим. Снова проверка для постоянного снижения давления в течение 10 секунд. Если есть утечка, то система не является жесткой и давление там, вероятно, будет отверстие в сосуде.
- Вернитесь к автоматической открытой Р1 к камере. На ручной настройки убедитесь, что давление остается стабильным.
- Если нет утечки, на ручную набрать увеличение параметра 2 (40 мм рт.ст.).
- Настройка автоматической и наблюдать судно под микроскопом. Если необходимо, отрегулируйте держатель канюли чтобы убедиться в отсутствии изгиба vessel.Check на предмет утечек на ручную настройку.
- Повторите действия 5,6 - 5,7 увеличение набора на 3 (60 мм рт.ст.), 4 (80 мм рт.ст.) и так далее, пока желаемое давление достигнуто.
Приблизительный время = 15 - 30 минут
6. Инкубация давлением судно
- Подключите заданной температуры контроллер до 37 ° C.
- Со вторым перистальтического насоса заливать Кребса буфера (1 мл / мин) в ванну камере судна.
- Подключите аспиратор в камеру обеспечения только верхний слой баню удаляют.
- Инкубируйте давлением судна при 37 ° С в течение 1 часа с давлением задан автоматически.
- Проверьте давление не протекает (переход на ручное) периодически.
- Влияние различных фармакологических вмешательств можно наблюдать, просто добавляя соединения к ванне во время инкубации.
Приблизительный время = 1 час
7. Перфузии под давлением сосуд с цельной крови
- Во время инкубации получить не менее 7,5 мл цельной крови человека / судно внутреннего плавания, собранных в 40 U гепарина / мл крови. Инкубируйте в 50 мл сокола при температуре 37 ° C.
- За 10 минут до конца тон инкубации этикетке крови VybrantDil (1:1000) в течение 10 минут при температуре 37 ° С в темноте.
- Через 10 минут сбора крови в шприце стирать все пузырьки и приложите на шприцевой насос с тепловой куртке установлена на уровне 37 ° C.
- Близко от P1 датчик на камеру / судно внутреннего плавания и соединить шприц и сточных труб.
- Чистка крови в 1000 мкл / мин через отходов трубы, чтобы удалить пузырьки.
- Открытое Р1 к камере. Давление серво будет регулироваться автоматически для поддержания требуемого давления.
- Заливать кровью при 100 мкл / мин.
- Использование флуоресцентного микроскопа связан с цифровой камерой запись двух областях перфузии судно в течение 15 секунд на 1, 3, 5, 7,5 и 10 минут.
- Сообщение перфузии эндотелиальных целостности и функции могут быть оценены с помощью фармакологических методов, таких как myograph и выражения молекул адгезии можно определить по иммуногистохимии для дальнейшей проверки воспалительной реакции.
Приблизительный время = 15 минут
8. Представитель Результаты:
Схема установки камеры давления показана на рисунке 1. С цифровой камерой соединен с флуоресцентным микроскопом результаты могут быть визуализированы мгновенно через живые записи видео. Представитель изображения видео показано на рисунке 3, где лейкоцитов считается приверженцем эндотелия, если они оставались неподвижными в течение 10 секунд. С видео-записи на непрерывном цикле придерживался клетки может быть расценено как средняя на поле. Хотя и низкой (рис. 3А) и высокой (рис. 3В) давление вызовет некоторое количество адгезии существенное увеличение адгезии лейкоцитов в высших внутрипросветного давления видел, и это также продемонстрировало количественно (рис. 4).
Рисунок 1. Под давлением естественных бывший судно камеры схеме. Канюлированные судна подключены к проксимальным (P1) датчика и дистального (Р2) преобразователи, что позволяет кровяное давление, чтобы манипулировать внутри судна. Перфузии через датчик P1 и давление поддерживается с помощью P2 преобразователя.
Рисунок 2. Cannuala со связями. Черного связей полиэстера прилагаются к каждому канюли.
Рисунок 3. Представитель видеоизображения. Динамическое клеточной адгезии (красная стрелка) при флуоресценции при 80 мм рт.ст. () и 120 мм рт.ст. (В) после 10 минут перфузии.
Рисунок 4. Адгезии лейкоцитов в Sprague Dawley сонных артерий через 1 час инкубации при низкой (80 мм рт.ст.) и высокого давления (120 мм рт.ст.). *** Р <0,001, как проанализированы 2-полосная повторных измерений ANOVA использованием Бонферрони постфактум тест.
Обсуждение
Это модифицированный метод изучения адгезии лейкоцитов к эндотелию в интактных изолированных кровеносных сосудов под давлением условиях в реальном времени. Перфузии судна камеры только позволяет быстро проверки провоспалительных штаммов больших мышей и крыс судов. Включение давление манипуляции обеспечивает динамическое взаимодействие ячейки, которые должны соблюдаться от низких до очень высоких внутрипросветного давления, тем самым лучше имитировать ING-физиологических и патофизиологических условиях. Диаметр суда также может быть измерена с помощью достаточного клеточной визуализации программы и, следовательно, сдвигового течения и скорость может быть определена и, следовательно, манипулировать.
С его возможностями myograph, фармакологических вмешательств помещен в ванну добавить новое измерение в экспериментальных условиях возможно с этой модели позволяют исследовать механистического и сигнальных путей. Хотя эндотелиальные сохранения не могут быть подтверждены в ходе манипуляции давления, реакции на АХ и PE может быть проведена после перфузии 9.
Следует отметить, что эта установка демонстрирует последствия внутрипросветного давления на клетки к межклеточных взаимодействий не эффект пульсирующего потока крови, ни систолического и диастолического давления. Кроме того, в то время как резкие изменения давления на адгезии лейкоцитов наблюдалось, эта установка может быть также использована, чтобы смотреть на хроническое воздействие давления (т.е. увеличение времени инкубации и использовании модели хронического животных давления). Sprague Dawley общей сонной артерии, продемонстрированный в этом созданы, но и другие штаммы и виды могут быть использованы с соответствующей корректировки размера канюли. В самом деле, важно отметить, что возраст и вес животных влияет на размер судна и, таким образом, что создали должно быть индивидуальным для каждого судна. Закрыть и тщательного вскрытия соединительной ткани может улучшить визуализацию лейкоцитов безмерно.
Раскрытие информации
Протокол исследования был одобрен Альфред медицинских исследований и образования участковых животных Комитет по этике и Альфред больнице Комитета по этике.
Благодарности
Это исследование было поддержано частично OIS викторианской правительством программы, национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии программ и проектов, грантов (ССПМ Чин-Удаление пыли) и аспирантов стипендии (D Мичелл).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента / оборудование | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Микроскоп | Carl Zeiss, Inc | STEREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 шприцевой насос | Гарвардский аппарата | 70-2016 | |
| Цифровая камера и контроллер | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
| Флуоресценция Системы освещения | Динамика Lumen | X-Cite 120 | |
| Судно палаты | Живые системы Инструментарий | CH/1/SH | |
| Регулятор давления сервопривода и перистальтические насосы | Живые системы Инструментарий | PS - 200 | |
| Монитор перфузионного давления | Живые системы Инструментарий | PM - 4 | |
| 2 х Датчик давления | Живые системы Инструментарий | PT - F | |
| Регулятор температуры | Живые системы Инструментарий | ТС-01 | |
| Перистальтический насос | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil клеточной маркировке решение | Invitrogen | V-22 885 | Используйте 1:1000 |
Ссылки
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
Перепечатки и разрешения
