Когерентная антистоксова рамановская спектроскопия для визуализации миелинизированных нейронов в тканях мозга мышей

Аннотация

Источник: McCullagh, E. A., et al. Применение когерентной антистоксовской рамановской спектроскопии (CARS) для визуализации миелинизации в срезах мозга. J. Vis. Exp. (2022)

В видео демонстрируется флуоресцентная и когерентная антистоксова рамановская спектроскопия (CARS) для визуализации нейронной архитектуры в тканях мозга грызунов. Окрашивание Nissl помечает клеточные тела, связываясь с рибосомальной РНК, в то время как визуализация CARS нацелена на богатый липидами миелин с помощью лазер-индуцированных сигналов. Наложение изображений флуоресценции и CARS обеспечивает детальное представление о клеточных телах и миелинизированных аксонах.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Окрашивание Окрашивание

1. свободно плавающих участков по шкале Ниссля, для визуализации клеточных тел (1:100), в средах антител (среда AB: 0,1 М фосфатный буфер (PB: 50 мМ KH2PO4, 150 мМ Na2HPO4), 150 мМ NaCl, 3 мМ Triton-X, 1% бычий сывороточный альбумин (BSA)) в течение 30 минут при комнатной температуре на стандартном лабораторном шейкере.
   1. Защитите участки от света с помощью алюминиевой фольги и/или крышки. Длины волн 550 нм или ниже совместимы с визуализацией CARS (Рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя мы не ожидаем, что Triton-X или другие реагенты окажут влияние на визуализацию липидов с помощью CARS, может быть оправдан дополнительный контроль с использованием определенных сред антител.
2. ТОЧКА ПАУЗЫ: Храните свободно плавающие срезы (защищенные от света) в фосфатно-солевом буфере (PBS) до визуализации. После разреза визуализируйте срезы мозга в течение 2 недель.

2. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная установка CARS содержит волоконный лазер, который обеспечивает тактовую частоту 80 МГц, и лазер OPO (оптический параметрический генератор) с перестраиваемым диапазоном 770-990 нм с лучом Стокса, зафиксированным на длине волны 1031 нм, которые необходимы для сбора сигнала CARS. Имеется одна апертура для обоих лучей.

1. Перед тем, как поднести образцы к микроскопу, включите и прогрейте лазер CARS не менее 1 ч, проведите юстировку лазера CARS, а также диафрагму микроскопа для прямой визуализации CARS.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для правильного функционирования микроскопии CARS.
   1. Для пространственного выравнивания двух лазерных лучей (накачки и стокса) получите доступ к двум внутренним PSD (позиционно-чувствительным детекторам) через CARS laser GUI (графический пользовательский интерфейс).
   2. Достижение временного выравнивания с помощью функции задержки в графическом интерфейсе лазера CARS, которая может помочь перекрыть импульсы двух лазеров (накачки и стокса), которые имеют разную дисперсию из-за разной длины волны. Таким образом, как временное, так и пространственное перекрытие насоса и лучей Стокса выполняется с помощью ввода данных пользователем через графический интерфейс.
   3. Отрегулируйте внешний перископ (последние два зеркала установки) так, чтобы центрировать два пространственно перекрывающихся лазера на зеркалах сканирующей головки микроскопа.
   4. Для наилучшего обнаружения прямого CARS без сканирования убедитесь, что конденсатор выполнен по методу Келера (это означает, что конденсатор центрирован и сфокусирован на диафрагме для достижения равномерного освещения)
2. Для иммунофлуоресцентной конфокальной визуализации и визуализации CARS установите лазер CARS с прямыми и эпи CARS недесканированными детекторами (NDD), включив в себя конфокальный микроскоп, оснащенный видимыми лазерами для флуоресцентной визуализации (рис. 2).
3. Поместите срезы в чашку для культивирования с покровным стеклом (для инвертированной микроскопии), PBS, чтобы избежать высыхания ткани, и стеклянным грузиком, чтобы держать ткань рядом с покровным стеклом.
4. Сделайте z-стеки или одиночные изображения с помощью 60-кратного инфракрасного корректируемого водного объектива с числовой апертурой 1,2, который служит для сбора сигнала CARS в направлении эпи и через конденсатор 0,55 NA в прямом направлении для визуализации областей мозга, таких как медиальное ядро трапециевидного тела (MNTB).
   1. Возьмите изображения CARS примерно на 600 мВт накачке/щупа и 300 мВт Стокса, используя лазерный графический интерфейс CARS. Эти значения мощности лазера измеряются системой изнутри. Мощность обоих лазеров в месте нахождения образца составляет менее 25 мВт и безопасна для образца ткани.
   2. Перекрывайте насос и лучи Стокса в пространственном и временном отношении. Настройте ОПО на 797,2 нм. Это дает длину волны CARS 650 нм. Из-за более высокого уровня энергии, результирующий возврат к основному состоянию является антистоксовым (синим смещением) возбуждения.
   3. Захват сигнала CARS в эпи или прямых детекторах без десканирования с использованием полосовых фильтров (640-680 нм) с последующим последовательным детектированием иммунофлуоресцентной метки (в данном случае флуоресцентно меченной по Нисслю). заметка: Нейрональный маркер сомы Ниссля не улавливается полосовым фильтром CARS 640-680 нм, что позволяет комбинировать флуоресценцию и визуализацию CARS на изображениях, представленных ниже.
   4. CARS и флуоресценция не используют общие ФЭУ. Используйте эти настройки для оптимального липидного сигнала для избирательного изображения миелинизации в области мозга. осторожность: Защитите пользователя от лазерного луча
5. Сохраните изображения в виде файлов .oib, которые можно импортировать в программу анализа изображений для дальнейшей количественной оценки (рис. 3).

Результаты

Рисунок 1: Визуализацию CARS можно комбинировать с иммунофлуоресцентной визуализацией. Из графиков видно, что визуализация CARS происходит в спектре красного сигнала 660/640 нм. Эта длина волны достаточно удалена от зеленого, синего или ульт...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Окрашивание:
AB Среда:			1n 1,000 мл миллипорового H2O
фосфата buffered (PB):
фосфат калия Монооснование	Sigma	P5655
Фосохат	Диосновные Sigma	S7907
BSA (Бычий сывороточный альбумин)	Sigma life science	A2153-100g
Хлорид натрия	Fisher Chemical	S271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500мл
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE picoemerald лазер	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
полосовой фильтр (420-520 нм)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
полосовой фильтр (500-530 нм)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
полосовой фильтр фильтры (640-680 нм)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P Конфокальный
микроскоп	Olympus	FV1000
Cut Transfer pipet	Fisher	13-711-7M
дихроичный длиннопроходный 565 нм	Chroma Technology	565dcxr
дихроичный длиннопроходный 585 нм	Chroma Technology	585dcxr
дихроичный короткопроходный 750 нм	Chroma Technology	T750spxrxt
стеклянный донный тарелка для культивирования	MatTek	P35G-0-10-C
стеклянный вес (10 мм x 10 мм боро стержень)	Allen Scientific Glass Inc
многофотонный короткопроходный эмиссионный фильтр 680 нм	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS

натрия