Визуализация динамики кальция в волосковых клетках латеральной линии личинок данио-рерио

Аннотация

Источник: Lukasz, D., et al. Визуализация кальция in vivo волосковых клеток латеральной линии у личинок данио-рерио. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео демонстрируется живая визуализация притока кальция в волосковых клетках латеральной линии парализованной трансгенной личинки данио-рерио с помощью конфокального микроскопа. Механическая стимуляция пучков волос с помощью импульсов жидкости индуцирует поступление кальция через каналы механотрансдукции и потенциал-зависимые каналы, что визуализируется в режиме реального времени с помощью флуоресцентных индикаторов. Метод выделяет апикальную и базальную динамику кальция в волосковых клетках невромасты, выясняя их роль в обнаружении движения воды.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Прикрепление и иммобилизация личинки к камере визуализации
   1. Купайте личинку Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) примерно в 1 мл буфера для эмбрионов (E3), содержащего 0,04% MS-222, в течение 1–2 минут на силиконовой поверхности камеры визуализации, пока личинка не станет неподвижной или не перестанет реагировать на прикосновения.
      1. Под стереомикроскопом расположите личинку в центре перфузионной камеры так, чтобы она лежала на боку против силиконового инкапсулятора.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для согласованности всегда устанавливайте личинки на одну и ту же сторону (например, правой стороной вниз, левой стороной вверх) (Рисунок 2B1).
   2. С помощью тонких щипцов проведите штифт диаметром 0,035 мм вниз перпендикулярно личинке и камере. Вставьте штифт между глазом и глазным пузырьком и вниз в инкапсулятор (рисунки 1B1 и 1B2). Используйте второй набор щипцов, чтобы стабилизировать личинку вдоль ее дорсальной или брюшной стороны во время прижигания. Следите за тем, чтобы горизонтальная часть штифта соприкасалась с личинкой и не вдавливалась полностью в герметизацию. Наклоните штифт вентрально (рис. 1B1) или слегка направите его в сторону передней части рыбы, чтобы не мешать последующей инъекции сердца и визуализации волосковых клеток.
      1. Используя щипцы, вставьте хвостовой штифт диаметром 0,025 мм в хорду как можно ближе к концу хвоста (Рисунок 1B1).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не растягивать личинку. Приколите личинку плашмом. Глаза должны быть наложены друг на друга (рисунок 2B1). Это очень важно для облегчения инъекции сердца (рисунок 1B2-B2', шаг 3), облегчения желаемой плоскости визуализации (рисунок 1B1-B2'', шаг 5) и количественной оценки интенсивности стимула струей жидкости (рисунок 3A3, шаг 4).
2. Инъекция α-бунгаротоксина в полость сердца для паралича личинки

ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте перчатки при работе с α-бунгаротоксином.

1. Центрифугируйте аликвоту α-бунгаротоксина на короткое время перед использованием, чтобы предотвратить засорение иглы для сердечной инъекции.
   1. Залейте 3 мкл раствора α-бунгаротоксина в иглу для инъекции сердца с помощью наконечника пипетки с загрузкой гелем. Равномерно загрузите раствор до кончика без пузырьков.
   2. Вставьте сердечную инъекционную иглу в держатель для пипетки, прикрепленный к ручному микроманипулятору. Под стереомикроскопом расположите иглу так, чтобы она была выровнена перпендикулярно оси A-P прижатых и обезболенных личинок, направленной вниз под углом ~30°.
   3. Подсоедините держатель пипетки к инжектору давления. Примените следующие рекомендуемые настройки: Впрыск = 100 гПа, твпрыск = 0,5 с и Пкомпенсация = 5 гПа. Введите в раствор болюс, чтобы проверить, является ли кончик иглы патентованным.
   4. Ищите, чтобы небольшая затяжка красного раствора (от фенольного красного) покинула кончик иглы. Если красный цвет не виден, очень осторожно соскребите кончик иглы по краю булавки и повторите попытку, пока игла не станет прозрачной. В качестве альтернативы можно вытащить иглу с большим отверстием на кончике.
2. Продвигайте иглу к сердцу до тех пор, пока она не коснется кожи снаружи сердца (рисунок 1B2). Вдавите иглу в личинку и найдите углубление пигментной клетки на коже перед сердцем, чтобы убедиться, что игла расположена в правильной плоскости относительно личинки (рис. 1B2').
   1. Продвигайте иглу дальше, пока она не пронзит кожу и не войдет в сердечную полость. Слегка оттяните иглу назад. Ввести в полость сердца болюс α-бунгаротоксина. Ищите надувание полости сердца или попадание в полость красного красителя.
3. Аккуратно промойте личинку 3 раза 1 мл нейронального буфера (NB), чтобы удалить остатки MS-222. Никогда не удаляйте всю жидкость. Поддерживайте содержание личинки примерно в 1 мл NB в перфузионной камере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что сердцебиение личинок и кровоток остаются устойчивыми после укола и инъекции сердца и на протяжении всего эксперимента по визуализации.
4. Подготовка микроскопа и настройка жидкостной струи
   1. Соберите вертикальный конфокальный микроскоп с использованием компонентов, описанных в таблице материалов: конфокальный микроскоп с лазером 488 нм и соответствующими фильтрами, программное обеспечение для микроскопа для управления и координации визуализации и стимуляции, 10-кратный воздушный объектив, 60-кратный водяной объектив, сканер объектива пьезо-Z (для z-стеков), высокоскоростная камера, круглая камера адаптер, моторизованная сцена и адаптер для вставки сцены.
   2. Соберите струю жидкости, состоящую из 3 основных компонентов: вакуумного и нагнетательного насоса, высокоскоростного зажима давления и напорной ступени (также описанной в таблице материалов). Используйте высокоскоростной зажим давления для управления временем и продолжительностью сброса давления или вакуума из ступени головки в жидкоструйный пипетку.
      1. Подключите выход головного столика к держателю жидкостного пипетки с помощью толстостенной силиконовой трубки.
5. Выравнивание личинки и струи жидкости

ПРИМЕЧАНИЕ: В каждой нейромасте есть 3 плоскости интереса: (1) кончики пучков волос (Рисунок 3A3: киноцилия, используемая для измерения интенсивности стимула); (2) плоскость механотрансдукции (MET) волосяного пучка (рисунок 2B1-B1': основание апикальных волосяных пучков, где обнаруживаются MET-канал-зависимые кальциевые сигналы); и (3) синаптической плоскости (рисунок 2B2-B2': где пресинаптические сигналы кальция обнаруживаются в основании волосковой клетки). Эти плоскости обозначены на рисунке 2А.

1. Засыпьте 10 μL NB в правильно сломанную иглу с жидкостной струей, используя наконечник для загрузки геля. Равномерно загрузите раствор до кончика без пузырьков. Вставьте иглу в держатель пипетки, прикрепленный к моторизованному микроманипулятору.
2. Поместите перфузионную камеру в адаптер круглой камеры на предметном столике микроскопа. заметка: Для обеспечения согласованности всегда располагайте личинку в одной и той же ориентации (например, камера, содержащая личинку, должна быть обращена к струе жидкости сзади и вентральной стороной к экспериментатору).
   1. Переместите моторизованную сцену так, чтобы личинка оказалась в центре поля зрения. Поверните адаптер круглой камеры так, чтобы переднезадняя ось (A-P) личинки была примерно выровнена с траекторией иглы жидкостной струи.
   2. Используя проходящий свет и дифференциальный интерференционный контраст (DIC), сфокусируйте личинку и центрируйте ее под объективом 10x. Поднимите цель 10x.
3. С помощью моторизованного микроманипулятора опустите жидкостно-струйную иглу вниз в центр поля зрения так, чтобы она освещалась проходящим светом и едва касалась раствора NB.
   1. Уменьшите цель в 10 раз. Сосредоточьтесь на личинке, чтобы подтвердить ее местонахождение. Сосредоточьтесь вверх, чтобы найти иглу для струи жидкости. Перемещайте иглу с жидкостной струей с микроманипулятором по осям x и y до тех пор, пока она не окажется в положении, параллельном спинной стороне рыбы.
   2. Снова сосредоточьтесь на личинке. Опустите иглу вниз по оси z. Расположите иглу вдоль спинной стороны рыбы и на расстоянии ~1 мм от тела (рисунок 3A1).
   3. Осторожно переместите адаптер круглой камеры (при необходимости), чтобы убедиться, что игла для струи жидкости выровнена по средней линии A-P личинки (рис. 3A1).
   4. Переместите моторизованный столик так, чтобы интересующая вас нейромачта оказалась в центре поля зрения. Держите кончик иглы с жидкостной струей вдоль спинной стороны рыбы. Не прикасайтесь кончиком иглы с жидкостной струей к личинке или поверхности камеры.
4. Переключитесь на цель 60x воды. Убедитесь, что цель погружена в решение NB. Используйте тонкую фокусировку для определения местоположения нейромачты с помощью проходящего света и оптики DIC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка предназначена для стимуляции невромастов вдоль первичной задней боковой линии. Волосковые клетки внутри этих невромастов реагируют либо на передний, либо на задний направленный поток жидкости.
   1. Расположите иглу струи жидкости с микроманипулятором так, чтобы она находилась на расстоянии 100 мкм от внешнего края нейромачты (Рисунок 3A2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте нейромасты, которые обеспечивают четкое изображение сверху вниз (Рисунки 2B1'-B2' и Рисунок 3A3), а не под углом (Рисунок 2C1-C2). Четкий вид сверху вниз позволяет одновременно визуализировать все апикальные пучки волос в одной оптической плоскости или визуализировать синаптические области в меньшем количестве оптических плоскостей (рис. 3A3).
   2. Сосредоточьтесь на кончиках апикальных пучков волос (киноцилия) (рис. 1А, рис. 3А2 и 3А3). Нижняя часть иглы с жидкостной струей должна быть в фокусе в этой плоскости.
5. Установите высокоскоростной прижимной зажим из ручного в внешний режим, чтобы получать входные данные от программного обеспечения для обработки изображений.
   1. Обнулите высокоскоростной зажим, нажав кнопку "ноль". Используйте ручку уставки, чтобы установить слегка положительное давление в состоянии покоя (~2 мм рт.ст.). Подтвердите выход высокоскоростного прижимного зажима в состоянии покоя с помощью манометра «фунты на квадратный дюйм» (PSI), прикрепленного к выходу головного столика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установите слегка положительное давление в состоянии покоя, чтобы избежать постепенного поглощения жидкости иглой струи жидкости с течением времени. Если жидкость попадет в трубку, соединенную с гидроструей, и достигнет напорной ступени, это может повредить оборудование.
   2. Определите давление, необходимое для стимуляции пучков волос. Используйте входное напряжение 0,125 и 0,25 В (6,25 и 12,5 мм рт.ст.) в течение 200–500 мс для подачи испытательного стимула (рис. 3A3-A3'').
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высокоскоростной зажим давления преобразует входное напряжение (от программного обеспечения или других устройств, которые подключаются к порту Bayonet Neill–Concelman (BNC) на порту команды высокоскоростного зажима давления) в давление, которое сбрасывается с напорного столика, и, наконец, жидкостно-струйная игла (1,0 В = 50 мм рт.ст., в то время как -1,0 В = -50 мм рт.ст.). В этой конфигурации (см. шаг 4.2) положительное давление (толчок) отклоняет пучки волос к передней части, а отрицательное давление (вытягивание) отклоняет пучки волос к задней части.
   3. Используя проходящий свет и оптику DIC, а также масштабную линейку, измерьте расстояние отклонения по стимулам 6,25 и 12,5 мм рт.ст. кончиков пучков волос, киноцилий (рис. 2А и рис. 3А3-3''). Выберите давление, которое перемещает пучки (как 1 связная единица) на расстояние примерно 5 мкм (рисунок 3A3''). Следите за тем, чтобы кончики киноцилий все время оставались в фокусе.
   4. Переместите струю жидкости ± на 25 мкм вдоль оси A-P личинки, чтобы найти расстояние и давление, которые отклоняют кончики киноцилий на 5 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании GCaMP6 у личинок через 3–7 дней после оплодотворения (dpf) отклонение на 5 мкм должно привести к почти насыщению кальциевых сигналов GCaMP6s и не должно повредить апикальные структуры пучков волос (рис. 3A3''). Меньшие расстояния смещения могут быть использованы для доставки ненасыщающих стимулов (рисунок 3A3'). Расстояния смещения >10 мкм трудно оценить (Рисунок 3A3''') и со временем могут нанести ущерб. Насыщение сигнала зависит от возраста нейромасты (и киноцилиальной высоты), а также от используемого индикатора. Периодически проверяйте проходимость иглы с жидкостной струей в каждом направлении (давление/толчок и вакуум/вытягивание) во время визуализации. Иглы с жидкостной струей легко засоряются и теряют проходимость вакуума, но сохраняют проходимость по остаточному давлению. Используйте оптику DIC и короткий тестовый стимул в каждом направлении, чтобы проверить проходимость струи жидкости.
   5. Сфокусируйте образец в интересующей плоскости (например, у основания апикальных пучков волос или у основания волосковой клетки в синаптической плоскости; Рисунок 2B1-B2').
6. Процедура получения изображений: одноплоскостная съемка

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся визуализация, описанная в этом протоколе, выполняется при комнатной температуре (ЛТ).

1. Настройте программное обеспечение для обработки изображений для получения потоковой или непрерывной 80-кадровой съемки с захватом каждые 100 мс для достижения частоты кадров 10 Гц.
2. Установите усиление, апертуру и мощность лазера для оптимизации обнаружения сигнала, но избегайте насыщения, фотообесцвечивания и шума. Примеры настроек для Opterra/SFC следующие: мощность лазера 488 нм: 50 (плоскость MET пучка волос), 75 (синаптическая плоскость); щель 35 мкм; усиление = 2,7; Усиление EM = 3900.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Применяйте 2-кратное биннингование, если сигналы слишком слабые, шумные или имеют чрезмерное фотообесцвечивание. 2-кратное биннингование улучшит обнаружение сигнала за счет пространственного разрешения.
3. Выберите стимул для подачи в течение 80 кадров (8 с) после кадра 30, через 3 с.<бр />ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые примеры стимулов следующие: 200 мс (+ или - 0,25 В) до 2 с (+ или - 0,25 В) шаг в переднем или заднем направлении для определения направленной чувствительности каждой волосковой клетки; 2 с, Прямоугольный сигнал 5 Гц (0,25 В в течение 200 мс, -0,25 В в течение 200 мс, повторяется 5 раз) для стимуляции всех волосковых клеток одновременно. Положительное давление (передний раздражитель) активирует половину волосковых клеток. Отрицательное давление (задний раздражитель) активирует другую половину волосковых клеток. Убедитесь, что программное обеспечение или устройство для возбуждения возвращают зажим давления обратно в положение 0 В после завершения подачи стимула.
4. Измерьте механочувствительные реакции кальция. Сосредоточьтесь на основании апикальных пучков волос (рисунки 2A и 2B1-B1') и начните получение изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если нейромаст хорошо виден сверху вниз (рисунок 2B1-B1'), все пучки апикальных волос могут быть изображены одновременно в одной плоскости.
5. Измерьте пресинаптические реакции кальция. Сосредоточьтесь на основании волосковых клеток (рисунки 2A и 2B2-B2') и начните получение изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если невромаст хорошо видна сверху вниз (рисунок 2B2-B2'), пресинаптические плоскости визуализации всех волосковых клеток могут быть получены в 2-3 плоскостях, расположенных на расстоянии 2 мкм друг от друга. Tg[myo6b:ribeye-mcherry] трансгенные рыбы могут быть использованы для идентификации и локализации пресинаптических лент и мест поступления кальция.

Результаты

Рисунок 1: Камера визуализации, процедуры крепления рыбок данио-рерио и сердечных инъекций, а также иглы. (А) На рисунке изображена камера визуализации с личинкой (обведена пунктирным прямоугольником), прикрепленной к центру поверх силиконово...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Для паралича личинок перед визуализацией
Камера визуализации	Siskiyou	PC-R	Платформа для установки личинок для визуализации
No 1.5 Покровные стекла квадратные, 22*22 мм	VWR	48366-227	Для герметизации камеры визуализации
Высоковакуумная силиконовая смазка	Fischer Scientific	14-635-5D	Для крепления покровного стекла к камере визуализации
Силиконовый герметик прозрачный 0,5 г набор	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5 КГ	Для заполнения камеры визуализации для создания поверхности для прикалывания рыбы
Стереомикроскоп	Carl Zeiss Микроскопия	Stemi 2000 с подсветкой проходящим светом	Для подсветки проволоки, щипцов и ножниц для изготовления булавок
Тонкие щипцы	Fine Science Tools	Dumont #5 (0,05 x 0,02 мм) Артикул No 11295-10	Для изготовления булавок
Тонкие ножницы	Cole-Palmer	5,5", EW-10818-00	Для резки вольфрамовой проволоки для изготовления булавок
Вольфрамовая проволока, 0,035 мм	Goodfellow	W005131	Для головных булавок для обездвиживания личинок
Вольфрамовая проволока, 0,025 мм	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Для хвостовых штифтов для иммобилизации личинок
Капилляры из боросиликатного стекла без нити	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Стекло для втягивания в иглы с жидкостной струей для стимуляции волосковых клеток
Тонкие щипцы	Fine Science Tools	Dumont #5 (0,05 x 0,02 мм) Артикул No 11295-10	Для прикалывания личинок
Гель	Наконечники для загрузки Eppendorf	5242956003	Для обратной засыпки игл для инъекций сердца
Стереомикроскоп	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 с подсветкой в проходящем свете	Для подсветки личинок во время укола и инъекции в сердце
Стеклянный капилляр/иглодержатель	WPI	MPH315	Для удержания игл с жидкостной струей
Ручной микроманипулятор	Narishige	M-152	Для удержания и позиционирования иглодержателя для введения α-бунгаротоксина
Магнитная стойка	Narishige	GJ-1	Для удержания ручного микроманипулятора для инъекции α-бунгаротоксина
Напорный инжектор	Eppendorf	Femtojet 4x	Для доставки α-бунгаротоксина
Конфокальный микроскоп	Bruker	Swept field/Конфокальный микроскоп	OpterraНеподвижный, вертикальный микроскоп с DIC оптикой и лазером 488 нм с соответствующими фильтрами
Программное обеспечение микроскопа	Bruker	Prairieview 5.3	Для координации и управления микроскопом, лазерами, столиком, пьезо-z, камерами и жидкостной струей
10-кратным воздушным объективом	Nikon	MRH00101	Малое увеличение для позиционирования личинок и жидкостной струей
60-кратным водным объективом	Nikon	MRF07620	Водный иммерционный объектив с высоким NA (1,0) и достаточным рабочим расстоянием (2,0 мм)
Сканер объектива Piezo-Z с контроллером/драйвером	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Высокоскоростное сканирование Z-стека с точностью 0,025 мкм
EMCCD камера	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD камера	с малым размером пикселя, которая может получать до 100 кадров в секунду
Адаптер	круглой камерыSiskiyou	PC-A	Для удержания и вращения камеры визуализации на предметном столике для микроскопа
Моторизованный предметный столик Z-дек	Приорный научный	ZDN12MP	Столик для микроскопа, который может удерживать и перемещать образец и микроманипулятор с жидкостной иглой вместе
Адаптер для вставки Z-деки	NIH Механический цех Механический цех	на заказ	Для установки адаптера круглой камеры на столик Z-деки
Жидкостно-струйный аппарат	Научные инструменты ALA	HSPC-1 Высокоскоростной зажим с PV-PUMP	Для управления и подачи жидкостного стимула
Masterflex Силиконовая трубка с пероксидным отверждением (1 фут)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Для подключения иглодержателя с жидкостной струей к нагнетательному насосу
Моторизованный микроманипулятор	Sutter Instrument Company	MP-225	Для удержания и позиционирования иглодержателя для жидкости Контроллер струйного
микроманипулятора	Sutter Instrument Company	MPC-200	Для управления жидкостно-струйным игольчатым манипулятором
Гелевые насадки	Eppendorf	5242956003	Для обратной засыпки жидкостно-струйных игл
Стеклянный капилляр/иглодержатель	WPI	MPH315	Для удержания жидкостно-струйных игл
Манометр PSI	Sper Scientific	840081	Для измерения выход
зажима давления Prism7	Graphpad	Prism7	Программное обеспечение для построения графиков изменения
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/	Программное обеспечение для обработки изображений и создания пространственно-временных карт сигналов
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Плагин для регистрации последовательностей изображений GCaMP6 в FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Плагин для регистрации последовательностей изображений GCaMP6 в FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Плагин для создания нескольких ROI для измерения изменений интенсивности GCaMP6

интенсивности GCaMP6