$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Подготовка
1. Дразните каждую мышцу небольшими пучками волокон шириной около 1 мм с помощью двух тонких зубчатых щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно очень аккуратно манипулировать мышцами щипцами, без чрезмерной силы, чтобы предотвратить повреждение тканей во время поддразнивания.
1. Диссоциируйте переднюю мышцу большеберцовой кости (TA) на 3 или 4 пучка в зависимости от ее размера.
2. Для икроножной мышцы (ГА) разделите медиальную и латеральную части мышцы, а затем разделите каждую часть на 4-5 пучков в зависимости от их размера.
2. Иммуноокрашивание
1. Продолжайте пермеабилизацию мышечных волокон: Перенесите мышечные пучки в 24-луночные планшеты, содержащие 1% (v/v) Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере (PBS), и держите их при легком перемешивании (50 об/мин) в течение 1 ч при RT или 5 ч при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разделите мышечные пучки между двумя пластинами, чтобы продолжить отдельное окрашивание и свести к минимуму риск путаницы с антителами. Не разделяйте их более чем на две лунки (1 лунка/пластина); в противном случае количество (N) нервно-мышечных соединений (NMJ), которые являются репрезентативными для их общего состояния в анализируемой мышце, может быть недостаточным.
2. Промойте образцы 3 раза в течение 5 минут с PBS at RT и инкубируйте их с блокирующим раствором, состоящим из 4% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS/Triton X-100 1% в течение 4 часов при 4 °C, при слабом перемешивании (50 об/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте аспирационный насос во время промывки, а лучше отсасывайте раствор вручную с помощью пипетки объемом 200 мкл и небольших наконечников (ссылка указана в Таблице материалов).
3. Инкубируйте образцы в течение ночи (O/N) при 4 °C при слабом перемешивании (50 об/мин) с помощью блокирующего раствора, указанного в шаге 2.2, содержащего первичные моноклональные антитела против нейрофиламента M (NF-M, 2H3, разведение 1/200) или синаптического везикулярного гликопротеина 2 (SV2, разведение 1/200) для маркировки пресинаптических окончаний аксонов или активных зон, соответственно.
4. На следующий день промойте мышечные пучки 3 раза в течение 5 минут в PBS при взмешивании (50 оборотов в минуту).
1. Для конфокальной визуализации: Инкубируйте мышечные пучки вторичными антителами против мыши, конъюгированными с красным излучающим флуорофором (F594) (разведение 1/500) и α-бунгаротоксином, конъюгированным с зеленым излучающим флуорофором (α-BTX-F488) (разведение 1/1000) в PBS в течение 2 часов при RT при перемешивании (50 об/мин).
2. Для визуализации с истощением вынужденного излучения (STED): Инкубируйте мышечные пучки с вторичными антителами против мыши, конъюгированными с зеленым излучающим флуорофором (F488) (разведение 1/500) и α-бунгаротоксином, конъюгированным с дальним красным излучающим флуорофором, характеризующимся высокой фотостабильностью (α-BTX-F633) (разведение 1/1000) в PBS в течение 2 часов при RT при перемешивании (50 об/мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте образцы воздействию света во время инкубации, чтобы избежать фотообесцвечивания.
5. Промойте помеченные мышечные пучки 3 раза в течение 5 минут PBS при взмешивании (50 оборотов в минуту) и поместите их на слайд с монтажным средством.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разместите максимум от 4 до 5 мышечных пучков на слайд, чтобы обеспечить запечатывание.
6. Добавьте сверху стеклянный покровный стекло класса #1.5 (или #1.5H) (толщиной 0.17 мм) и разместите цилиндрические магниты с обеих сторон предметного стекла, чтобы оказать давление и сделать мышцы плоскими.
7. Держите слайды защищенными от света O/N при 4°C. Навсегда заклейте слайды лаком для ногтей.
3. Получение изображения
1. Получение данных с помощью конфокального микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были собраны с помощью инвертированного лазерного сканирующего конфокального микроскопа с использованием масляного иммерсионного объектива 63-кратной величины (HCX Plan Apo CS, числовая апертура 1,4 (NA)).
1. Для слепого анализа, пусть человек, не участвующий в анализе, кодирует каждый слайд с заданным числом. Оставайтесь слепыми к экспериментальным группам до тех пор, пока количественная оценка параметров NMJ не будет завершена для всех образцов.
2. Запустите программное обеспечение микроскопа в режиме конфигурации > >machine.xlhw.
3. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и найдите плоскость наблюдения внутри образца, заглянув под широкопольное флуоресцентное освещение DAPI с набором фильтров DAPI.
4.Нажмите на Открыть проект > Новые проекты> и создайте папку для хранения полученных изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Создайте новый проект для каждого NMJ, чтобы ограничить размер папки и предотвратить проблемы с памятью компьютера.
5. Чтобы управлять параметрами съемки, нажмите на вкладку Acquisition и установите конфокальную дыру на единицу Эйри 1.0 и мощность лазера, чтобы оптимизировать уровни усиления и смещения для зеленой/F488 (α-BTX) флуоресценции с использованием лазера 488 нм на торцевой пластине, которую необходимо визуализировать (режим Live ON).
6. Затем оптимизируйте сбор флуоресценции red/F594 (NF-M или SV2) с помощью лазера, адаптированного к наблюдению F594. В данном исследовании использовался лазер с длиной волны 552 нм (Live mode ON). Задайте спектр излучения красителя со следующими диапазонами для каждого лазера: лазер 405 (DAPI) от 414 до 483 нм, лазер 488 (F488-α-BTX) от 506-531 нм, и лазер 552 (NFM/SV2) от 622-650 нм.
7. Соберите стеки изображений нервно-мышечных соединений в каждой экспериментальной группе с одинаковыми настройками: размер изображения 1024 x 1024 пикселей (73,7 x 73,7 мкм) при частоте дискретизации 400 Гц, двунаправленный X ON, коэффициент масштабирования 2,5, размер Z-шага 0,5 мкм в режиме Z-Wide.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого NMJ устанавливается количество срезов, чтобы получить весь перекресток. Описанные выше настройки сбора данных удовлетворяют теореме Найквиста-Шэнона о выборке. Тем не менее, пользователь может нажать кнопку «Оптимизировать формат», присутствующую во всех последних конфокальных операционных программах, чтобы убедиться, что размер пикселя и Z-шаг соответствуют идеальной частоте дискретизации Найквиста. Это действие позволит избежать избыточной или недостаточной дискретизации изображений, что приведет к потере точности измерений объема.
8. Сохраните исходный файл (.lif) или изображения Z-стека (.tif) в папку с именем, которое включает кодовое имя слайда, тип окрашивания и номер торцевой пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Собирайте последовательно (не одновременно) сканы с помощью лазеров 488 нм и 552 нм (F488 и F594), чтобы избежать перекрестных помех флуоресценции F488 в канал F594 и наоборот (просвечивание). Путь луча можно настроить с помощью Dye Assistant в программном обеспечении микроскопа.
9. Перейдите к следующему закодированному слайду и повторите шаги 3.1.3-3.1.8 для каждого NMJ.
10. В конце сеанса нажмите на кнопку "Открыть в 3D-просмотрщике" и выберите представителя NMJ экспериментальной группы для визуализации 3D-маркировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот режим просмотра поможет проверить, что параметры сбора были правильными.
11. Закройте программное обеспечение микроскопа, очистите объективы с помощью салфеток для линз, а затем выключите систему.
2. Получение данных с помощью микро<скопии STED
style='margin-left:40px;'>
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были собраны с помощью инвертированного лазерного сканирующего конфокального микроскопа, оснащенного Gated STED с длиной волны 775 нм, с использованием 100-кратного масляного иммерсионного объектива (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. Для слепого анализа, пусть человек, не участвующий в анализе, кодирует каждый слайд с заданным числом. Оставайтесь слепыми к экспериментальным группам до тех пор, пока количественная оценка параметров NMJ не будет завершена для всех образцов.
2. Запустите программное обеспечение микроскопа в режиме конфигурации > machine.xlhw и STED ON.
3. Нажмите на Открыть проект > Новые проекты, чтобы создать папку для хранения полученных изображений.
>ПРИМЕЧАНИЕ: Создайте новую папку для каждого слайда, чтобы ограничить размер папки и предотвратить проблемы с памятью компьютера.
4. Поместите предметное стекло на предметный столик микроскопа и просмотрите его под широкоугольным флуоресцентным освещением с помощью лазера 488 нм, чтобы найти плоскость наблюдения внутри образца.
5. Ищите NMJ, помеченный нейрофиламентом M (NFM) или окрашиванием SV2, используя лазер 488 нм со спектральным детектированием от 506-531 нм.
6. Когда NMJ будет идентифицирован, нажмите на Активировать STED и начните получение изображений в области, содержащей несколько соединительных складок, используя лазер с длиной волны 635 нм со спектральным детектированием от 640-750 нм.
>ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны к таблице поиска насыщенности во время получения изображения и нажмите кнопку Quick LUT, чтобы избежать передержки (серые значения >255; для 8 бит).
7. Соберите изображения каждой экспериментальной группы с одинаковыми настройками: размер изображения 2048 x 2048 пикселей (38,75 x 38,75 μm) при частоте дискретизации 400 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность истощающего лазера (STED) установлена на 65%.
8. Сохраните изображения с именем файла, которое включает код слайда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно нажать на Оптимизированный формат XY: Установить формат, чтобы получить наилучшую настройку сбора данных с помощью изображений STED.
9. Перейдите на следующий закодированный слайд и повторите шаги 3.2.3-3.2.8. Повторите эту процедуру для всех слайдов.
10. В конце сеанса микроскопии STED перенесите файлы изображений на другой компьютер и сохраните исходные файлы (.lif) на внешнем диске или сервере.
11. Выключите программное обеспечение микроскопа, очистите объективы с помощью салфеток для линз, а затем выключите систему.