Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

Краткое содержание

Простой, быстрый метод определения осахаривания потенциал большого числа образцов растительной биомассы описывается. Автоматизированная платформа для данного анализа заключается в подготовке растительной биомассы для анализа в 96-луночных и последующего выполнения предварительной обработки, гидролиз и количественное определение сахара освобождены.

Аннотация

Полисахариды, входящие в состав завода лигноцеллюлозных биомассы можно разбить, чтобы произвести ряд сахаров, которые впоследствии могут быть использованы в создании переработке биологических веществ. Это сырье будет представлять собой новую производственную площадку, которая одновременно устойчивым и нейтральным уровнем эмиссии углерода, приходящая на смену текущей зависимости от ископаемых видов топлива. Непокорностью к деконструкции наблюдается в лигноцеллюлозных материалов производится несколькими внутренними свойствами стен растительной клетки. Кристаллическая целлюлоза встроен в матрицу полисахариды, такие как xylans и arabinoxylans, и вся конструкция заключена по фенольных полимер лигнин, который также трудно переварить ^1. С целью улучшения усвояемости растительных материалов, мы должны обнаружить основные препятствия для осахаривания клеточных стенок, а также экран мутанта и гнездящихся популяций для оценки изменчивости осахаривания ^2. Эти задачи требуют высокой пропускной способности и подход здесь мы представляем аналитическую платформу, которая может выполнять осахаривания анализа в 96-луночный планшет формата. Эта платформа была разработана для скрининга лигноцеллюлозы усвояемость большой численностью населения от различных видов растений. Мы сократили объемы реакции для щадящей предварительной обработки, частичная ферментативного гидролиза и сахар решимости, чтобы позволить больших количествах, чтобы оценить быстро в автоматизированной системе.

Это автоматизированная платформа работает с миллиграмм количество биомассы, выполняя мяч фрезерные в контролируемых условиях для снижения растительных материалов для стандартизированного размера частиц в воспроизводимым образом. Как только образцы земли, автоматизированный робот, форматирование обходится определены и записаны количество материала в соответствующие лунки по 96 глубоких скважин пластины (рис. 1). Как правило, мы обойтись и тот же материал на 4 скважинах иметь 4 повторяет для анализа. После пластин заполнены растительного материала в нужный макет, они вручную переместить на жидком станции обработки (рис. 2). В этой станции образцы подвергаются предварительной обработке мягкой либо с разбавленной кислотой или щелочной и инкубировали при температуре до 90 ° C. Предварительная обработка решение последовательно удаляется и образцы промывали буфером для их возвращения в подходящий рН для гидролиза. Затем образцы инкубировали с ферментом смеси для переменной времени при температуре 50 ° C. Аликвоту берется из гидролизатов и редуцирующих сахаров, автоматически определяется MBTH колориметрическим методом.

Протокол

1. Подготовка образцов

Мы обычно работаем со стеблями, либо из травянистых или древесных растений. В случае травянистых материалов мы выращиваем растения до погашения, а после развития семян, которую мы собираем сухие стебли раз старения является полным. Стебли нарезанные на 4 сегмента мм и помещен в 2 мл флаконах с тремя шарами фрезерования. В случае древесных материалов, образцы измельчают до грубого опилки с файлом дрова и затем помещается в шаровой мельнице для дальнейшей обработки.

Образцы помещают в стойку внутри шлифования / форматирование станции (рис. 1). Эта станция последовательно измельчает, смешивает, а вес каждого образца. Количество повторений необходимо на один образец устанавливается испытание измельченного материала в серии предварительных экспериментов, где внутренняя изменчивость определенного размера частицы определяется. 2 мл флаконы пронизаны на дне и материалы выдаются на вибрацию флакона по выбранному хорошо. Вибрирующей руке находится под контролем обратной связи от баланса позволяет точное дозирование порошка. Робот распределяет 4 мг / лунку в стандартный анализ и 4 повторений необходимы в большинстве случаев. Это позволяет 20 образцы растений / пластины для анализа.

2. Предварительная обработка

Как только образцы отформатирован, 96-луночных обрабатывается автоматизированной системой обработки жидкости (рис. 2). Здесь мягкий предварительная обработка производится на растительных материалов путем добавления 350 мкл кислоты или щелочи и нагревания пластины на адаптированы блока. Чтобы избежать испарения при анализе 96-луночных уплотнены силиконовым матовым. Температуры и времени предварительной обработки может быть изменена в соответствии с материалами изучается. Максимальная температура, однако, составляет 100 ° C. Альтернативная процедура для тестирования жестких предварительной обработки является для предварительной обработки материалов в автономном режиме и устранения pretreatmet от процесса.

3. Гидролиз

1. После предварительной обработке материалов, робот автоматически удаляет предварительной обработки решение, и моет, все колодцы, 5 раз с 850 мкл 25 мМ ацетатного буфера. Полоскания осуществляется путем добавления буфера для предварительной обработки решение, а затем удаление 50% от общего объема после учета твердых частиц в образце, чтобы обосноваться. Высота стремление устанавливается на половине массы жидкости, чтобы избежать аспирации твердых частиц от дна ямы, есть незначительная потеря твердых тел с помощью этого подхода. После этих моет рН в скважине составляет 4,5 и материал будет готов для ферментативного гидролиза.
2. Фермент смеси, содержащей решение целлюлазы и hemicellulases добавляется робота. В каждую лунку, 850 мкл фермента смесь разливают и пластина перемещается в 50 ° C пожимая инкубатора. Стандартный гидролиза проводят в течение 8 часов, но на этот раз может быть адаптирована к цели эксперимента. Стандартные загрузки фермент используется для трав составляет 7 FPU / г материала.

4. Определение редуцирующих сахаров

Определение редуцирующих сахаров освобожден после гидролиза проводили с использованием модифицированной 3-метил-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) метод ^3. MBTH был выбран как наиболее подходящий метод, потому что это был самый легкий для автоматизации и наименее чувствительны к помехам от соединения, такие как белки. Мы изменили это очень чувствительный метод для использования на платформе робота, чтобы он мог точно количественно сахара в концентрациях присутствует в биомассе гидролизатов, в конечном объеме 250 мкл, которая пригодна для стандартных оптических 96 ячейках. Все действия выполняются автоматически и три независимых определения редуцирующих сахаров проводились для каждой осахаривания реакции.

1. 30 мкл гидролизата было взято из глубокого колодца пластины и смешивают с 45 мкл 25 мМ буферного раствора ацетата натрия в обогнул ПЦР 96-луночного планшета.
2. 25 мкл 1 н NaOH и 50 мкл раствора, содержащего 0,43 мг / мл MBTH и 0,14 мг / мл DTT были добавлены.
3. После смешивания пластины ПЦР нагревали при 60 ° С в течение 20 мин в амплификаторе или аналогичного устройства, которое обеспечивает именно такое же количество тепла, чтобы все 96 лунок.
4. Полученную реакционную был переведен в оптическом пластины.
5. Добавить 100 мкл окислительного реагента (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% сульфаминовой кислоты и 0,1% HCl). Хорошо перемешать и оставить развиваться, по крайней мере, 1 ч.
6. Каждая пластина должна также содержать стандартных реакций из 50 нмоль, 100 и 150 нмоль нмоль глюкозы. Оптические пластины читаются при 620 нм.

5. Представитель Результаты:

Примеры различных видов анализа представлены на рисунке 3 и 4. Все результаты были получены с помощью автоматизированной платформы. Рисунок 3 повторнопредставляет увеличения редуцирующих сахаров выпущен на 8 ч инкубации с земли тополя с увеличением количества целлюлолитических ферментов. На рисунке 4 представлена ​​последствий кислых и щелочных предварительной обработки на тополь образцов. Предварительная обработка NaOH является более эффективным, что разбавленный H2SO4 предварительной обработки для облегчения выпуска сахара в процессе гидролиза. Количество сахара измеряется после гидролиза уменьшается при предварительной обработке осуществляется с помощью NaOH концентрациях выше 1М.

Рисунок 1. Роботизированная станция для шлифования и 96 также форматирование биомассы

Рисунок 2. Жидкие станции обработки для анализа Высокая пропускная осахаривания

Рисунок 3. Влияние различных нагрузках фермента об освобождении снижения сахара эквивалентов от тополя образцы

Рисунок 4. Влияние различных предварительной обработки на осахаривания тополя образцов. А. Сахаров освобожден после pretreament с различными процент H2SO4 при 90 ° С в течение 30 минут. Б. Сахаров освобожден после предварительной обработки NaOH при той же температуре и времени, чем кислоты предварительной обработки .

Обсуждение

Вариации стандартного протокола осахаривания могут быть использованы в одной и той же платформе для определения активности целлюлолитических ферментов (т.е. путем варьирования концентраций ферментов, используемых в планшете, а также с использованием бумаги в качестве субстрата); сравнение эффективности нескольких ферментных смесей на конкретном материале; временной ход для осахаривания; и так далее.

Стандартный протокол осахаривания для сравнения потенциала осахаривания в различных растительных материалах включает в себя восьмичасовой гидролиз (рисунки 3 и 4). Для большинства проанализированных растительных материалов требуется четыре репликации. При таких условиях платформа может обрабатывать 80 образцов в день. Этот анализ используется для скрининга больших популяций ячменя, кукурузы и брахиподиума с целью установления изменчивости потенциала осахаривания и генов, участвующих в его определении⁴.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Шлифовальные и весом робот	Labman Автоматизация
2 мл микро трубку с колпачками	Sarstedt ООО	72,694
5 мм шарики из нержавеющей стали	Qiagen ООО	69989
1.2ml Abgene квадратных пластин и хранения	Fisher Scientific Ltd	TUL-050-050C
Ватман шапка коврик для 96 квадратных луночных	Fisher Scientific Ltd	7704-0104
Жидкие робот hanling	Tecan Группа ООО	Свобода Evo 200
Серная кислота	Fisher Scientific Ltd	S/9231/PB17
Едкий натр	Fisher Scientific Ltd	BPE359-500
Ацетат натрия	Sigma-Aldrich	S8750-500G
Уксусная кислота	Fisher Scientific Ltd	A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1.5L	Novozyme	CCN03122
96-PCR полной пластин юбки	Sarstedt ООО	72.1980.202
D-глюкозы	Fisher Scientific Ltd	G/0450/53
3-метил-2-benzothiazolinone гидразона гидрохлорид гидрат	Sigma-Aldrich	129 739-25G
DL-дитиотреитол	Sigma-Aldrich	D9163-1G
Corning планшет 96 лунок плоским дном	Fisher Scientific Ltd	ТКТ-521-050H
Аммоний железо (III) сульфат dodecahydrate	Sigma-Aldrich	F1668-250G
Сульфаминовая кислота	Sigma-Aldrich	242772-500G
Соляная кислота	Fisher Scientific Ltd	12462-0026