Методическая статья

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

19.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3241

⸱

2 сентября 2011 г.

 , 
1Blood vessels as a target for infection, Paris center for cardiovascular research, INSERM U970

В этой статье

Краткое содержание

Во время инфекционного процесса, что является ключевым шагом является адгезии патогенов с клетками хозяина. В большинстве случаев этот шаг адгезии происходит при наличии механических напряжений порожденных течет жидкость. Мы описываем технику, которая вводит напряжения сдвига в качестве важного параметра для исследования бактериальной адгезии.

Аннотация

При бактериальных инфекциях происходит последовательность взаимодействий между патогеном и его хозяином. Адгезия бактерий к поверхности клеток хозяина часто является начальным и определяющим этапом патогенеза. Хотя экспериментально адгезия в основном изучается в статических условиях, в действительности она происходит в присутствии потока жидкости. Первые контакты между бактериями и их хозяином часто происходят на слизистом уровне: в ротовой полости, легких, кишечнике, глазах и т.д., где слизь течет вдоль поверхности эпителиальных клеток. В дальнейшем при развитии инфекции патогены иногда проникают в кровоток, вызывая опасные для жизни заболевания, такие как септицемия, сепсис и менингит. Определяющей особенностью этих инфекций является способность патогенов взаимодействовать с эндотелиальными клетками в присутствии циркулирующей крови. Наличие потока жидкости, например слизи или крови, определяет адгезию, поскольку создает механическую силу, воздействующую на патоген. Для характеристики эффекта потока жидкости обычно используют понятие напряжения сдвига — тангенциальной силы, прикладываемой на единицу площади жидкостью, движущейся рядом с неподвижной стенкой, выражаемой в dynes/cm2. Интенсивность напряжения сдвига сильно варьирует в зависимости от типа сосудов, их размера, органа, локализации и т.д. (0-100 dynes/cm2). Циркуляция в капиллярах может характеризоваться очень низкими значениями напряжения сдвига и даже временно прекращаться на периоды от нескольких секунд до нескольких минут 1. На другом конце спектра напряжение сдвига в артериолах может достигать 100 dynes/cm2 2. Влияние напряжения сдвига на различные биологические процессы было наглядно продемонстрировано, например, при взаимодействии лейкоцитов с эндотелием 3. Чтобы учесть этот механический параметр в процессе бактериальной адгезии, мы воспользовались экспериментальной процедурой на основе использования одноразовой проточной камеры 4. Клетки хозяина выращивают в проточной камере, а флуоресцентные бактерии вводят в поток с помощью шприцевого насоса. Первоначально мы сосредоточили свои исследования на бактериальном патогене Neisseria meningitidis, грамотрицательной бактерии, вызывающей септицемию и менингит. Описанная здесь процедура позволила нам изучить влияние напряжения сдвига на способность бактерий: прикрепляться к клеткам 1, пролиферировать на поверхности клеток 5 и отделяться для колонизации новых участков 6 (Рисунок 1). Дополнительная техническая информация представлена в источнике 7. Значения напряжения сдвига, приведенные здесь, были выбраны на основе нашего предыдущего опыта1 и данных из литературы. Данный протокол может быть применим к широкому спектру патогенов с определенными корректировками в зависимости от целей исследования.

Протокол

1. Человек клетки-хозяина и бактериальной культуры

  1. Культура HUVECs между прохождением 1 и 9 при 37 ° во влажной инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2. Прохождение клеток, когда они приближаются к 80% слияния с трипсин / ЭДТА по содержанию культур на 75 см 2 колбах культуры и экспериментальных культур в одноразовых камерах потока (μ-Слайды VI).
  2. Вывод среды из колб для пассировать, мыть клетки с 10 мл PBS, отозвать и заменить его на 1,5 мл трипсин / ЭДТА. Разрешить клетки отделить в культуре клеток инкубаторе в течение 5 минут при температуре 37 ° C.
  3. Сбор клеток с 10 мл клеточной среде культуры в 15 трубке коллекции мл. Гранул клеток с 5 минут центрифугирования (на 200 г), при комнатной температуре. Приостановить клетки в 4 мл Эндо-SFM с добавлением 10% (объем / объем) FBS и считать их на камеру Malassez, в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Ввести 30 мкл 1x10 6 HUVEC клеток на мл суспензии в канале (3x10 4 общего числа) и позволяют клеткам придерживаться в течение 3 часов при температуре 37 ° во влажной инкубатор атмосфере 5% (объем / объем) CO 2. Добавить дополнительный объем 120 мкл Эндо-SFM для заполнения скважин. Клетки должны стать subconfluent монослоя (рис. 2).
  5. Расти Н. meningitidis выражения GFP (в этом случае напряжение 8013 выражения GFP под контролем IPTG индуцируемый промотор), на GCB пластин агара, содержащего добавки Kellogg и 5 мкг / мл хлорамфеникола при 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% (об. / г) CO 2 в течение 16 часов.

2. Первоначальная адгезия отдельные бактерии к клеткам хозяина

  1. Отрегулируйте концентрацию бактерий, выращенных на пластинах GCB агар для OD600 в 0,05 с подогретого Эндо-SFM, содержащей 10% (объем / объем) FBS и инкубировать в течение 120 минут при температуре 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% (об. / г) CO 2, при легком встряхивании (130 оборотов в минуту). Вызвать GFP выражение добавлением 1 мМ IPTG в питательной среде в течение всего периода инкубации.
  2. Место одноразовые μ-Slide на сцене инвертированный микроскоп оснащен подогревом платформы для поддержания температуры образца при 37 ° C.
  3. Налейте подогретого Эндо-SFM с добавлением 2% (объем / объем) FBS в стерильный стакан стекло и заполняют 50 мл стерильного шприца с этой средой. Прикрепить "вступления" НКТ шприц и заполнить путем введения среды.
  4. Подключить «входа» трубки к μ-Slide, с осторожностью, чтобы избежать введения воздуха в камере. Затем прикрепить "выход" трубки на другом конце и тщательно заполнить канал со средним и примерно 1 см от камеры «выход».
  5. Мера бактериальных OD600 и приспосабливаться к 0.15 в Эндо-SFM, содержащей 2% (объем / объем) FBS. Для того, чтобы смотреть на отдельные бактерии, любые агрегаты должны быть нарушен энергичным вортексе бактериальной образца.
  6. Разместить 100 мкл Эндо-SFM с добавлением 2% (объем / объем) FBS среды в резервуаре и добавить 100 мкл бактериальной решения взяты из верхней части встряхивали решение, чтобы избежать выборки оставшиеся бактериальных агрегатов.
  7. Осторожно ввести 200 мкл в μ-Slide, повернув кран для введения бактерий в камере.
  8. Ввести Эндо-SFM, содержащей 2% (объем / объем) FBS, поддерживается на уровне 37 ° С с подогревом платформы, в камеру при помощи шприца насос с напряжением сдвига совместимы с адгезию 0,044 дин / см 2 в течение 15 минут.

См., например, видео 1 или рисунке 3. После этого шага, либо переехать в разделах 3, 4 или 6.

3. Количественная оценка начальной адгезии отдельные бактерии к клеткам хозяина

  1. После начальной адгезии в течение 15 минут, как получить изображения из десяти полей случайно в то время как жидкость по-прежнему циркулирует.
  2. Анализ полученных изображений использованием программного обеспечения ImageJ 8, чтобы получить доступ к среднему числу adherant бактерий на поле. Это делается следующим образом: во-первых, каждое изображение thresholded использовании "Порог" окно, найденное в "Изображение" меню, чтобы выделить отдельные придерживаясь люминесцентные бактерии, минимизируя при этом фоне из клеток. Затем, каждую бактерию считается, с помощью Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Данные для каждого изображения представлены в таблице Excel и усредняются количественно среднее число бактерий приверженцем на поле.

4. Измерение сопротивления потоку отдельных бактерий приверженцем к клеткам хозяина

  1. Программа шприцевой насос настройки для создания напряжения сдвига в пределах от 3 ​​до 100 дин / см 2 в течение 5 минут.
  2. В конце 5 минут, приобрести десять полей случайно выбранных, как описано в пункте 3.1, но с потоком остановился пр.IOR с приобретением.
  3. Анализ полученных изображений, как описано в пункте 3.2 и количественно среднее число оставшихся бактерий на поле.

5. Измерение роста изолированных приверженцем бактерии микроколония

  1. Ввести Эндо-SFM, содержащей 10% (объем / объем) FBS, поддерживается на уровне 37 ° С с подогревом платформы, в камеру при помощи шприца насос с выбранным напряжением сдвига на несколько часов. Запись изображений для видео в реальном времени микроскопии на один кадр каждые 5 минут.
  2. После видео-микроскопии, остановить касательное напряжение, отключив шприцевой насос, приобретают 2-3 дополнительных изображений, а затем остановить последовательность получения изображения на программное обеспечение. Например бактериального распространения можно увидеть на видео 2.

6. Измерение сопротивления потоку приверженцем бактериальных микроколоний

  1. После формирования крупных микроколоний на клеточной поверхности (step5.2) приобретают 2-3 образы обеих ячейках (по фазового контраста) и бактерий (по GFP-флуоресценции) перед потоком приложения. Для остальной части эксперимента, приобретение протокол будет следить только флуоресценции.
  2. Применение высоких касательное напряжение в течение 5 минут (3-100 дин / см 2) и запись изображений на один кадр каждые 5 секунд.
  3. Стоп напряжения сдвига, отключив шприцевой насос, приобретают 2-3 дополнительных изображений, а затем остановить последовательность получения изображения на программное обеспечение.
  4. Затем удалите "выход" трубы первого и осторожно, чтобы избежать опорожнения канала, а затем добавить подогретого свежей средой для заполнения скважины, прежде чем снимать "вступления" трубок.
  5. Чтобы количественно определить влияние касательное напряжение на бактериальной резистентности, покрытие анализ может быть выполнен следующим образом: собирать оставшиеся средних и мыть μ-Slide в два раза с 120 мкл PBS, который удаляет оставшиеся среды из канала (как моет являются Также собраны).
  6. Отсоедините инфицированных клеток с добавлением 50 мкл трипсин / ЭДТА в течение 5 минут при 37 ° и смешать это отдельный образец с подвеской, собранных в предыдущем шаге.
  7. Выполните серийные разведения в PBS и пластиной 10 мкл долю на тарелки GCB агар, в трех экземплярах, в целях определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на следующий день, после инкубации пластин при 37 ° C в инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2.

Видео 3 и 4 сравнить дикого типа с pilV мутанта.

7. Бактериальные отрыв от микроколоний

  1. Инфицировать клетки в проточную камеру, повторив шаги 2,1 до 2,8 и позволяют инфекции проводили в течение 30 минут.
  2. Удаление несвязанных бактерий за счет увеличения потока до 10 дин / см 2 в течение 2 минут и дайте инфекции продолжаться в течение 2 часов.
  3. Сокращение потока до 0,15 дин / см 2.
  4. Каждый час, собирать капли среду выходит из потока камеры.
  5. Выполните серийные разведения образцов и пластины их на тарелки GCB агара.
  6. Определить количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на следующий день, после инкубации пластин при 37 ° C в инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2.

8. Представитель результаты

Рисунок 1
Рисунок 1: Различные шаги сотовой монослоя, которые можно наблюдать и измерять в присутствии потока в порядке.

Рисунок 2
Рисунок 2: Эндотелиальная монослоя ячейку в проточную камеру в начале эксперимента (отсутствие напряжения сдвига). Около 50 эндотелиальных клеток организованы в суб-сливающийся монослой.

Рисунок 3
Рисунок 3: Графическое представление начальную адгезию бактерий на клеточной поверхности. Значения для трех полей указаны, чтобы дать представление о поле до изменения поля, которые, как ожидается, (0044 дин / см 2).

Видео 1. Визуализация начальную адгезию бактерий на клеточном монослое как функция времени (0044 дин / см 2). GFP-экспрессирующих бактерии следующие направления текущей среде. Фильм ускоряется в 60 раз, реальная длительность видео составляет 10 минут.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.

Видео 2. После начальной адгезии бактерий было позволено распространяться на клеточной поверхности в течение 7 часов (ускоренное 1000-кратное).
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.

Видео 3. После распространения на клеточной поверхности механикдр. сопротивление микроколоний была проверена путем увеличения сдвига уровня напряжения до 10 дин / см 2 в течение 5 минут, но дикие микроколоний типа устойчивы ускоренной в 60 раз.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.

Видео 4. Микроколонии образована pilV мутант нарушается потоком увеличение (10 дин / см 2). Этот мутант не может вызвать реконструкция плазматической мембраны под микроколоний и, следовательно, более высокую чувствительность к увеличению напряжения сдвига (видео ускоряется в 60 раз) 5.
Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.

Обсуждение

Значение напряжения сдвига и, как правило механических аспектов в биологии получает все большее признание. Например высоко адаптирована адгезивные свойства селектина семейство белков в процессе адгезии лимфоцитов и катались по сосудистой стенки был признан введения напряжения сдвига в процессе. Описанная выше процедура была применена к грам-отрицательные бактерии Neisseria meningitidis, но должны быть применимы к широкому спектру патогенных микроорганизмов. Значение напряжения сдвига было показано и для других патогенных микроорганизмов и других сайтах инфекции. Бактериальная адгезия обусловлена ​​напряжения сдвига было описано изучение FimH адгезина найти на уропатогенных кишечная палочка (УПЭК) 9. Как и в селектины, взаимодействие между FimH и его хозяина клеточного рецептора было показано, что подкрепляется сдвига вызванного механическими силами 9 и CfaE адгезина из энтеротоксигенной E.coli Сообщалось также посредничать адгезией к кишечных эпителиальных клеток с помощью сдвига зависит от механизм 10. Мы сообщали, с использованием ламинарного потока камера анализа протокол, описанный в этой главе, Streptococcus agalactiae пили имеют важное значение для соблюдения этого возбудителя к эпителиальным клеткам в проточных условиях 11. Такие исследования подтверждают, что наши проточную камеру анализ является полезным инструментом для исследования клетки-хозяина и возбудителем взаимодействия в условиях напряжение сдвига.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Эмили Mairey и Эммануэль Донадье для первоначального создания процедуры.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге
μ-Slide VI 0,4 поток комплект IBIDI 80606
Шприц Plastipak 50 мл Луер-Лок Becton Dickinson 300865
Tygon труб R3603 3,2 х 4,8 мм Fisher-научного R3603
3-полосная кран, 2 женщин и мужчин Луер Луер Bio-Rad 7328103
Шприцевой насос Гарвардский аппарата PHD 2000
Перевернутый Микроскоп, Nikon Nikon Затмение Т я
ПЗС-камера Hamamatsu ORCA 285 ПЗС или ORCA 3-CCD
ImageJ программного обеспечения NIH Freeware
( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )

Ссылки

  1. Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
  2. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
  4. Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
  5. Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
  6. Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
  7. Soyer, M., Dumínil, G. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). Christodoulides, M. , Humana Press Inc. New York. (2011).
  8. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  9. Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
  10. Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
  11. Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).

Перепечатки и разрешения

Теги

Neisseria meningitidisGFP
Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.