Визуализация in vivo транспорта спинномозговой жидкости в мозге мыши с помощью флуоресцентной макроскопии

Аннотация

Источник: Sweeney, A. M., et al. Визуализация in vivo транспорта спинномозговой жидкости через интактный череп мыши с использованием флуоресцентной макроскопии. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует процесс визуализации потока спинномозговой жидкости (СМЖ) в мозге мыши с помощью флуоресцентной визуализации. Флуоресцентный индикатор вводится в большую цистерну (КМ), что позволяет отслеживать ее движение с ликвором через субарахноидальное и периваскулярное пространства. Покадровая съемка фиксирует путь индикатора, подчеркивая его распределение в ткани мозга через артериолы.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка канюли cisterna magna, головной пластины и держателя головки

1. Стерилизуйте все хирургические инструменты и головные пластины перед операцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные индикаторы доставляются непосредственно в спинномозговую жидкость с помощью канюляции cisterna magna.
2. Кратко с помощью игловодителя сломайте кончик иглы размером 30G x 12,7 мм (1/2 дюйма) на 3/4 вниз и поместите тупой конец иглы в один конец трубки из полиэтилена 10 (PE10) (длиной около 45 см). Убедитесь, что из границы трубки PE10 выступает только скос.
3. Отломите 1/4 скошенного конца другой иглы 30G и поместите тупой конец оставшейся иглы в другой конец трубки PE10, не снимая с собой пластиковый замок Люэра.
4. Наполните стеклянный шприц объемом 100 мкл стерильной искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF: 126 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ₂PO₄, 2 мМ MgSO₄, 2 мМ CaCl₂, 10 мМ глюкозы и 26 мМ NaHCO₃).
5. Прикрепите шприц к концу лески и заполните его aCSF до тех пор, пока он не достигнет кончика скошенной иглы. Важно, чтобы шприц был заполнен aCSF, а не воздухом, так как столб воздуха более подвержен переменным объемам инфузии.
6. Для хронических экспериментов оставьте строку, заполненную aCSF, и пропустите Шаг 1.7.
7. Для проведения острых экспериментов поместите шприц на инфузионный насос и наберите примерно 5 мм воздуха, что предотвратит смешивание. После этого извлеките общий объем индикатора (индикаторов), который требуется для эксперимента (рекомендуется на 20% больше из-за потерь в мертвом пространстве).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка PE10 должна быть достаточно длинной, чтобы пузырь воздуха не попадал в пластиковую манжету стеклянного шприца при загрузке индикатора. Для типичного эксперимента в протоколе используется 10 мкл бычьего сывороточного альбумина, конъюгированного с Alexa Fluor 647 (BSA-647), разведенным в aCSF в концентрации 0,5%.
8. Убедитесь, что накладка на головку входит в держатель головки и что она имеет правильный размер для используемой мыши. Анатомические маркеры для этого следующие: верхняя граница окна совпадает с межглазной линией, а задняя граница падает рострально к затылочному гребню.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пластины для головы из нержавеющей стали можно стерилизовать и использовать повторно. Большинство смесей цианоакрилатов можно удалить с помощью раствора ацетона.

2. Хирургическое вмешательство

1. Взвесьте и обезболите мышь (например, кетамин/ксилазин; 100 мг/кг кетамина, 10 мг/кг ксилазин; внутримышечно).
2. Как только мышь перестанет реагировать на пощипывание пальца ноги, смочите шею и голову стерильной водой и побрейте с помощью машинки для стрижки. После того, как область будет выбрита, снова протрите ее спиртовым тампоном, чтобы удалить остатки волос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Увлажнение шерсти перед стрижкой значительно уменьшает количество волос в окне визуализации после разреза.
3. Поместите мышь в стереотаксическую рамку поверх подушечки с регулируемой температурой и нанесите масляную офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы они не высыхали.
4. Очистите открытые участки кожи тампоном с хлоргексидином. Через 2 минуты удалите хлоргексидин спиртовой салфеткой. Наконец, нанесите раствор йода, который можно оставить до полного высыхания.
5. Введите подкожное обезболивание (0,25% Bupivacaine HCl) в верхнюю часть черепа и шею.
6. Начиная с той части шеи, которая покрывает затылочный гребень, сделайте разрез по средней линии в вышележащей коже и продолжайте рострально по направлению к межглазничной линии. Надрежьте латерально до границы, где височная мышца прикрепляется к черепу. Удалите всю кожу веретенообразного разреза, чтобы обнажить лобную и теменную кости.
   ВНИМАНИЕ: Ретроорбитальный синус лежит каудально по отношению к глазам, а большие ветви задней лицевой вены лежат рострально к ушной раковине. Будьте осторожны при выполнении разреза, чтобы не допустить этих структур. Если это произошло, остановите кровотечение, поддерживая гемостаз стерильным ватным тампоном в течение нескольких минут и продолжайте.
7. Орошите череп стерильным физиологическим раствором и очистите поверхность ватными палочками, чтобы на ней не было мусора и волос, так как они могут повлиять на качество изображения. Прозрачность черепа лучше всего сохраняется, если оставить надкостницу и вышележащую фасцию нетронутыми.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если эти структуры случайно удалены, череп со временем может стать сухим и непрозрачным. Повторно увлажните с помощью aCSF или используйте смесь парафинового масла и глицерина для снижения отражательной способности черепа в острых экспериментах.
8. Приступайте к введению большой канюли цистерны.
9. После установки канюли КМ нанесите смесь стоматологического цемента с цианоакрилатным клеем на вентральную сторону головной пластины вокруг границы и поместите ее на череп таким образом, чтобы передняя граница головной пластины совпала с задним кончиком носовой кости, а задняя граница совпала с передней стороной межтеменной кости, следя за тем, чтобы сагиттальный шов (средняя линия) был центрирован и выпрямлен относительно окна (рисунок 1B).
10. Зафиксируйте положение головной пластины с помощью пары капель акселератора клея. Заполните оставшиеся зазоры цементной смесью и отверждите ее с помощью ускорителя.
    ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что цианоакрилат не соприкасается с глазами мыши и не блокирует окно визуализации.
11. Приклейте канюлю CM к пластине головки, чтобы она не отсоединилась во время транспортировки или когда мышь просыпается.
12. Для экспериментов с острыми ситуациями перейдите к шагу 2.16.
13. Для хронических экспериментов нанесите тонкий слой прозрачно высыхающего цианоакрилатного клея на открытый череп, стараясь не создавать пузырьков, так как они будут мешать визуализации. Клей обеспечивает защиту черепа и не будет мешать визуализации. Убедитесь, что клей покрывает открытый череп до самой кожи на границе разреза.
14. С помощью зажима для гемостата удерживайте трубку из полиэтилена 10, заполненную КСФ, на расстоянии 2-3 см от КМ и разрежьте леску с помощью высокотемпературного наконечника для прижигания. После того, как канюля будет отделена, расплющите расплавленную трубку PE10, чтобы запечатать канюлю.
    ВНИМАНИЕ: Не отпускайте зажим до тех пор, пока канюля не будет загерметизирована, и убедитесь, что в трубке нет утечек, чтобы предотвратить образование ликворного свища.
15. Введите карпрофен (5 мг/кг каждые 24 ч в течение 3 дней; внутрибрюшинно [в/в] или подкожно [подкожно]) и верните мышь в клетку с контролируемой температурой и дайте ей восстановиться в течение как минимум 24 ч перед визуализацией. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения за грудиной. Неповрежденные краниальные окна остаются стабильными в течение нескольких недель. ПРИМЕЧАНИЕ: Хронический эксперимент может быть приостановлен здесь.
    ВНИМАНИЕ: Некоторые послеоперационные осложнения: кефалогематомы/подгалеальные гематомы, ликворный свищ и инфекция.
16. Для острых экспериментов поместите мышь в держатель для головы с помощью головной пластины так, чтобы череп находился в неподвижном положении. Обязательно проверьте уровень анестезии и подложите под мышь грелку. Теперь мышь готова к отправке в макроскоп.
    ВНИМАНИЕ: Осторожно транспортируйте мышь вместе с инфузионным насосом на тележке. Если канюляция КМ будет смещена, это вызовет падение внутричерепного давления, и любые утечки ликвора изменят результаты эксперимента.

3. Подготовка мыши к визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол варьируется в зависимости от того, будет ли эксперимент по визуализации проводиться на мыши, находящейся под наркозом (начните с шага 3.1) или бодрствующей (начните с шага 3.2) мыши.

1. Мыши
   1. Поместите держатель головки на столик макроскопа, убедившись, что линия от шприцевого насоса к канюле CM не имеет перегибов и что она не натянута, так как это может повлиять на инфузию индикатора.
   2. Наблюдайте за частотой дыхания и розовой окраской слизистых оболочек, что свидетельствует о хорошем насыщении кислородом. При необходимости введите физиологический раствор подкожно, чтобы обеспечить уровень гидратации. Убедитесь, что животное достаточно обезболило, и при необходимости повторите дозу.
   3. Включите камеру макроскопа и светодиод (LED) и запустите режим LIVE.
   4. Подтвердите увеличение поля визуализации таким образом, чтобы можно было четко визуализировать нософронтальный шов в верхней части поля и лямбдоидный шов в нижней части, при этом сагиттальный шов должен быть параллельен и центрирован к середине изображения (рис. 1C). После установки закрепите держатель головки на столике макроскопа с помощью ленты.
   5. Сфокусируйте макроскоп на обнаженном черепе. Несмотря на то, что макроскопы имеют относительно большую глубину резкости, кривизна черепа мыши позволяет фокусироваться только на определенной области. Наилучшие результаты достигаются, когда фокальная плоскость расположена на боковых сторонах теменных костей позади коронарных швов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это расположение средних мозговых артерий (МКА), где происходит наибольший приток спинномозговой жидкости (рис. 1D, E).
2. Awake Mice
   1. Перед сеансом визуализации дайте животным восстановиться в течение как минимум 24 часов после операции на головной пластине. Также рекомендуются более длительные периоды восстановления (5-7 дней). В течение этого времени тренируйте мышь фиксировать голову на предметном столике в удерживающей трубке в течение 0,5-1 часа в день в течение всего периода восстановления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Привыкание позволяет прикреплять мышь к держателю головы без анестезии и снижает стресс и беспокойство во время реального эксперимента. Если это невозможно и анестезия не мешает эксперименту, можно использовать индукционную дозу ингаляционного анестетика (например, изофлурана 2% при скорости потока O2 1-2 л/мин) для быстрого прикрепления мыши к головному столику.
   2. После того как мышь будет закреплена на держателе для головы и в удерживающей трубке, выполните шаги 3.1.1-3.1.5.

4. Инфузия флуоресцентных индикаторов спинномозговой жидкости

1. Acute CM Cannulation
   1. Поскольку индикатор уже был загружен в канюлю перед помещением в цистерну на шаге 1.6, установите инфузионный насос на желаемую скорость и объем. Обычно используются парадигмы инфузии 5-10 мкл со скоростью 1-2 мкл/мин, но эти параметры могут быть скорректированы в зависимости от конкретного эксперимента, а также размера и возраста животного.
2. Chronic CM Cannulation
   1. Перед началом сеанса визуализации следуйте шагам 1.2-1.7 для острых экспериментов, чтобы подготовить инфузионную линию для доставки индикаторов.
   2. После того, как линия подготовлена, с помощью хомута с помощью гемостата разрежьте запечатанный конец хронической канюли КМ. Возьмите иглу из линии, подготовленной в Шаге 4.2.1, и аккуратно введите ее в канюлю. Отпустите зажим и с помощью шприцевого насоса продвигайте индикатор спинномозговой жидкости с желаемой скоростью инфузии (например, 2 мкл/мин) для эксперимента до тех пор, пока индикатор не достигнет имплантированной иглы в CM.
      ВНИМАНИЕ: Если игла прокалывает трубку при подключении магистрали, извлеките иглу, разрежьте проколотый сегмент и повторите этот шаг. Любой разрыв трубки PE10 приведет к утечке и повлияет на результаты эксперимента.

5. Настройка сеанса визуализации

1. На основе вводимого флуоресцентного индикатора определите длину волны возбуждения и время экспозиции для каждого канала. Выберите кратчайшее время экспозиции, необходимое для визуализации трассера, чтобы максимизировать временное разрешение покадровой съемки. Это время воздействия будет использоваться для всех последующих экспериментов, направленных на сравнение переноса ликвора между различными животными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один из советов заключается в использовании индикатора в линии CM для регулировки времени воздействия. Хотя это полезный первый подход, со временем его следует оптимизировать.
2. Выберите продолжительность эксперимента и интервалы, через которые будут получены изображения. Эксперименты обычно длятся от 30 до 60 минут в зависимости от того, какая фаза глимфатического транспорта представляет интерес. Для большинства экспериментов достаточно частоты кадров 1 кадр/мин и выше.
3. Задайте имя файла и директорию сохранения.
4. Если изображения будут собираться в дополнение к одновременному сбору других переменных (например, электрокардиограммы, артериального давления, электрофизиологии), макроскоп и насос могут быть запрограммированы на запуск с помощью программного обеспечения для сбора данных. Прежде чем переходить к следующему шагу, убедитесь, что функция запуска на макроскопе выполнена правильно.

6. Эксперимент по транскраниальной оптической визуализации

:

1. Начните инфузию индикатора и визуализацию одновременно.
2. Регулярно проверяйте канюлю CM и трубку PE10 на наличие признаков утечки. Если в КМ происходит утечка индикатора, результаты этого эксперимента должны быть исключены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если индикатор начинает накапливаться в мозжечке и не проходит глимфатический путь средних мозговых артерий (МКА), вполне вероятно, что канюля КМ была введена в мозжечок. Эти данные не должны включаться.
3. Для острых экспериментов после завершения эксперимента извлеките мышь из микроскопа и убедитесь, что она все еще адекватно обезболивается. Быстро обезглавьте мышь и соберите мозговую ткань. Зафиксируйте мозг погружением в 4% параформальдегид (PFA) на ночь при 4 °C.
   1. Для хронических экспериментов, как только визуализация будет завершена, удалите линию КМ из канюли, промойте стерильным аКСФ и снова запечатайте канюлю КМ с помощью высокотемпературного наконечника для прижигания. Снимите мышь с подставки для головы и верните ее в клетку. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не отпадет необходимость в дополнительной визуализации, а затем выполните шаг 6.3.

Результаты

Рисунок 1. Транскраниальная макроскопическая визуализация. (А) Схема установки макроскопической визуализации. (B) Дорсальный вид положения головной пластины на черепе. Видна межтеменная кость, а также носова...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 μL Газоплотный шприц Модель 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Стоматологический цементный порошок	Научный	NC9991371
Фишера Карпрофен			Университет Рочестера Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS Camera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Головная пластина	Университет Рочестера	Нет каталога #	Custom made at the machine shop at University of Rochester
Высокотемпературный прижигание	Bovie Medical Corporation	AA01
Ускоритель Insta-set	Bob Smith Industries	BSI-151
Изофлуран - Fluriso	Vet One	502017	Университете Рочестера Виварий
Кетамин			Стронг Мемориал Госпиталь
Аптека Крейзи Клей	Elmer's Products, Inc	Каталога нет #, смотрите ссылку в комментариях	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Микропоровая хирургическая лента	Fisher Scientific	19-027-761
Параформальдегид	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Полиэтилен .011" x .024" на фут., 100 футов непрерывный	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Помпа 11 Elite Infusion Only Двойной шприц	Harvard Apparatus	70-4501
PURALUBE VET МАЗЬ	Dechra
Puritan PurSwab Палочки для чистки с ватным наконечником	Fisher Scientific	22-029-553
Исследовательский микроскоп Macro Zoom	Olympus	MVX10
Простая пластина-держатель головки (для мышей)	Narishige International США Inc	MAG-1
Иглы одноразового использования, BD Medical	VWR	BD305106
Стерильные спиртовые прокладки для приготовления	Fisher Scientific	22-363-750
Настраиваемый светодиод	PRIOR Lumen 1600-LED
Ксилазин			Университет Рочестера Виварий

алкоголя