Трансназальная трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из микроглиальных клеток человека, в мозг мыши

Аннотация

Источник: Parajuli, B., et.al. Трансплантация индуцированной плюрипотентной стволовой клетки человека микроглии в мозг иммунокомпетентных мышей неинвазивным трансназальным путем. J. Vis. Exp. (2022).

В этом видео показана трансназальная трансплантация индуцированных клеток микроглии человека (iPSMG), полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, в мозг мыши. Гиалуронидаза наносится на ноздри мышей с истощенной микроглией для повышения проницаемости. Суспензию iPSMG вводят интраназально, и мышь дают восстановиться. Среды, богатые фактором роста, регулярно вводятся для поддержания выживаемости iPSMG в тканях мозга.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были проверены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарной экспертной комиссией JoVE.

1. Приготовление клеточной среды, трансплантатной среды и анестезиологической смеси

1. Подготовьте клеточную среду путем добавления 10% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% пенициллина/стрептомицина в модифицированную среду Dulbecco Eagle (DMEM).
2. Подготовьте среду для трансплантации, добавив в клеточную среду колониестимулирующий фактор человека 1 или hCSF1 (250 нг/мл) и трансформирующий фактор роста человека бета 1 или hTGF-β1 (100 нг/мл).
3. Приготовьте смесь для анестезии для внутрибрюшинного введения, смешав 0,45 мл медетомидина гидрохлорида, 1,2 мл мидазолама и 1,5 мл тартрата буторфанола в 11,8 мл нормального физиологического раствора.

2. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из клеток микроглии человека (iPSMG)

ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженный iPSMG (Таблица материалов) хранился при температуре -80 °C до использования.

1. Быстро разморозьте замерзшие ячейки на водяной бане при температуре 37 °C. Взбивайте образцы, пока весь видимый лед не растает.
2. Добавьте размороженную индуцированную плюрипотентную микроглию человека (iPSMG) в питательную среду, нагретую до 37 °C. Добавьте 1 мл размороженных клеток, содержащих среду (1 ×^{10 6} клеток) к 10 мл питательной среды.
3. Центрифугируйте ячейки при давлении 300 x g в течение 5 минут для получения клеточной гранулы.
4. После центрифугирования удалите всю надосадочную жидкость, не потревожив клеточную гранулу. Полное удаление надосадочной жидкости желательно для снижения разведения концентрации цитокинов в трансплантационной среде.
5. Добавьте среду для трансплантации до получения концентрации клеток 1 x 10⁵ клеток/мкл.
6. Поместите iPSMG на лед и сразу приступайте к трансплантации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка iPSMG к трансплантации проводится на чистом стенде во избежание заражения.

3. Подготовка мыши к трансназальной трансплантации (Tsn)

1. Кормите самцов мышей дикого типа (C57BL/6J, 8 недель) PLX5622-содержащей диетой в течение 7 дней.
2. В конце^7-го дня прекращают рацион PLX и кормят мышей обычным рационом до конца исследования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PLX5622 содержащий рацион готовят путем добавления 1,2 г PLX5622 в 1 кг AIN-93G (Таблица материалов).

4. Трансназальная трансплантация клеток

через

1. 24 ч после прекращения кормления PLX, взвесить мышей и обезболить их с помощью внутрибрюшинного введения анестезиологической смеси (0,2 мл/20 г).
2. После того, как мыши были полностью обезболены в соответствии с отсутствием реакции на рефлекс отмены педали (сильное защемление пальца ноги), введите 2,5 мкл гиалуронидазы в фосфатно-солевом буфере (PBS) (100 Ед/мл) за 1 ч до трансназальной трансплантации iPSMG в каждую ноздрю дважды с использованием наконечника пипетки объемом 10 мкл для увеличения проницаемости слизистой оболочки носа.
3. После применения гиалуронидазы поместите мышей в положение лежа на спине.
4. Повторите шаг 4.2 за 10 минут до трансназальной трансплантации iPSMG.
5. Нанесите 2,5 мкл клеточной суспензии в одну ноздрю мыши с помощью наконечника пипетки объемом 10 мкл.
6. Поместите мышь в положение лежа на спине на 5 минут перед введением клеточной суспензии в другую ноздрю.
7. Повторите шаги 4.5 и 4.6 четыре раза, внося общий объем 20 μл на каждое животное.
8. Поместите мышь в лежачем положении на грелку с температурой 37 °C до восстановления после анестезии.
9. Через 48 ч после прекращения кормления PLX повторите шаги 4.1-4.7 на тех же мышах еще раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что клетки iPSMG помещаются на лед во время трансплантации.

5. Применение цитокинов

1. под наркозом у мышей путем внутрибрюшинного введения анестезиологической смеси (0,2 мл/20 г).
2. Нанесите 2,5 μL среды для трансплантации в одну ноздрю мыши с помощью наконечника пипетки объемом 10 μL.
3. Поместите мышь в положение лежа на спине на 5 минут, прежде чем вводить среду для трансплантации в другую ноздрю.
4. Повторите шаги 5.2 и 5.3 четыре раза, применяя общий объем 20 мкл на животное.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует отметить, что трансназальное введение трансназальной среды для трансплантации (цитокинов человека) требуется каждые 12 ч для обеспечения жизнеспособности трансплантированного iPSMG до конца исследования.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Восточные дрожжи Co
Фетальная бычья сыворотка	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH30070.03
Замороженный iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Лаборатория по разработке лекарств и исследованию болезней
Колониестимулирующий фактор человека 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Гиалуронидаза	Sigma-Aldrich	H-3506
Медетомидина гидрохлорид	Meiji Seika	VETLI5
Мидазолам	Astellas	18005A2
Параформальдегид	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Пенициллин/стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Пипетка	Eppendorf	3120000011
наконечник для пипетки	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical A930097
Трансформирующий фактор роста-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21