Визуализация глубоких тканей мозга рыбки данио с помощью трехфотонного флуоресцентного микроскопа

Abstract

Источник: Hontani, Y., et al. Трехфотонная флуоресцентная микроскопия глубоких тканей в интактном мозге мышей и рыбок данио. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется настройка и выполнение трехфотонной визуализации в мозге рыбки данио, находящейся под наркозом. Протокол позволяет визуализировать флуоресцентно меченые нейроны в глубоких тканях, выявляя активность и структуры нейронов в режиме реального времени для исследовательских приложений в области нейронауки.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Прижизненная визуализация в мозге рыбки данио
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы правильно определить местонахождение мозга рыбы под объективом, используется камера вторичного устройства с зарядовой связью (ПЗС) на том же пути, что и возбуждающий свет для широкоугольной визуализации.
   
   1. Настройте микроскоп и откалибруйте мощность.
   2. Поместите на микроскоп объектив с малым увеличением (обычно 4x).
   3. Поместите чашку Петри с рыбой и трубками под микроскоп.
   4. Используйте источник света на светодиодах (LED) для подсветки чашки Петри.
   5. Откройте режим камеры программного обеспечения для получения изображений (рис. 1).
   6. Нажмите «Опубликовать».
   7. Выберите канал А в правой части экрана.
   8. Отрегулируйте настройки гистограммы, чтобы изображение было четко видно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Их необходимо обновлять по мере необходимости.
   9. Установите настройку двигателя на контроллере двигателя в положение Base.
   10. Опустите объектив до тех пор, пока рыбу не станет видно.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что линза объектива не соприкасается с головой.
   11. Поместите центр головы рыбы в центр поля зрения.
   12. Переместите цель вверх и подальше от рыбьей головы.
   13. Замените объектив с малым увеличением на объектив с высокой числовой апертурой (NA) для 3PM (трехфотонной микроскопии).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив с малым увеличением и объектив с высоким NA не обязательно должны быть парфокальными, но должны находиться достаточно близко, чтобы рыба находилась в поле зрения объектива с высоким уровнем NA.
   14. Медленно опустите линзу объектива, следя за тем, чтобы объектив не соприкасался с головой. В программном обеспечении ПЗС-камеры остановите перемещение объектива, когда видна макушка головы. Установите положение z на 0 μm.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что при использовании объектива с погружением в воду под линзой объектива нет пузырьков воздуха.
   15. Выключите светодиодный источник света и закройте темную шторку вокруг системы.
   16. Установите программное обеспечение для получения изображений в режим Multiphoton GG для 3P-изображений и установите мощность под объективом на менее 1 мВт (с частотой повторения импульсов ~1 МГц).
   17. Измените кнопку настройки двигателя с «База» на «Цель» на контроллере двигателя.
   18. Выключите свет в комнате.
   19. Включите фотоумножители (ФЭУ) и откройте затвор источника возбуждения 3PM. Убедитесь, что контур кости появляется в сигнальном канале флуоресценции за счет автофлуоресценции и в сигнальном канале генерации третьей гармоники (THG) за счет THG кости (рис. 1C).
   20. Выполняйте визуализацию на разной глубине за счет увеличения уровня мощности при более глубоком сканировании.

Results

Рисунок 1: Репрезентативные скриншоты для прижизненной визуализации у рыб (раздел протокола 1). (A) Режим просмотра программного обеспечения для получения изображений с 4-кратным объективом. Основные функции программного обе...

Materials