Визуализация глубоких тканей мозга рыбки данио с помощью трехфотонного флуоресцентного микроскопа

Аннотация

Источник: Hontani, Y., et al. Трехфотонная флуоресцентная микроскопия глубоких тканей в интактном мозге мышей и рыбок данио. J. Vis. Exp. (2022)

В этом видео демонстрируется настройка и выполнение трехфотонной визуализации в мозге рыбки данио, находящейся под наркозом. Протокол позволяет визуализировать флуоресцентно меченые нейроны в глубоких тканях, выявляя активность и структуры нейронов в режиме реального времени для исследовательских приложений в области нейронауки.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Прижизненная визуализация в мозге рыбки данио
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы правильно определить местонахождение мозга рыбы под объективом, используется камера вторичного устройства с зарядовой связью (ПЗС) на том же пути, что и возбуждающий свет для широкоугольной визуализации.
   
   1. Настройте микроскоп и откалибруйте мощность.
   2. Поместите на микроскоп объектив с малым увеличением (обычно 4x).
   3. Поместите чашку Петри с рыбой и трубками под микроскоп.
   4. Используйте источник света на светодиодах (LED) для подсветки чашки Петри.
   5. Откройте режим камеры программного обеспечения для получения изображений (рис. 1).
   6. Нажмите «Опубликовать».
   7. Выберите канал А в правой части экрана.
   8. Отрегулируйте настройки гистограммы, чтобы изображение было четко видно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Их необходимо обновлять по мере необходимости.
   9. Установите настройку двигателя на контроллере двигателя в положение Base.
   10. Опустите объектив до тех пор, пока рыбу не станет видно.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что линза объектива не соприкасается с головой.
   11. Поместите центр головы рыбы в центр поля зрения.
   12. Переместите цель вверх и подальше от рыбьей головы.
   13. Замените объектив с малым увеличением на объектив с высокой числовой апертурой (NA) для 3PM (трехфотонной микроскопии).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив с малым увеличением и объектив с высоким NA не обязательно должны быть парфокальными, но должны находиться достаточно близко, чтобы рыба находилась в поле зрения объектива с высоким уровнем NA.
   14. Медленно опустите линзу объектива, следя за тем, чтобы объектив не соприкасался с головой. В программном обеспечении ПЗС-камеры остановите перемещение объектива, когда видна макушка головы. Установите положение z на 0 μm.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что при использовании объектива с погружением в воду под линзой объектива нет пузырьков воздуха.
   15. Выключите светодиодный источник света и закройте темную шторку вокруг системы.
   16. Установите программное обеспечение для получения изображений в режим Multiphoton GG для 3P-изображений и установите мощность под объективом на менее 1 мВт (с частотой повторения импульсов ~1 МГц).
   17. Измените кнопку настройки двигателя с «База» на «Цель» на контроллере двигателя.
   18. Выключите свет в комнате.
   19. Включите фотоумножители (ФЭУ) и откройте затвор источника возбуждения 3PM. Убедитесь, что контур кости появляется в сигнальном канале флуоресценции за счет автофлуоресценции и в сигнальном канале генерации третьей гармоники (THG) за счет THG кости (рис. 1C).
   20. Выполняйте визуализацию на разной глубине за счет увеличения уровня мощности при более глубоком сканировании.

Результаты

Рисунок 1: Репрезентативные скриншоты для прижизненной визуализации у рыб (раздел протокола 1). (A) Режим просмотра программного обеспечения для получения изображений с 4-кратным объективом. Основные функции программного обе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5% Povidone-iodine	Amazon	NDC 67818-155-32	Рецептивная очистка хирургических областей
70% этанол	Thermo Fisher Scientific	CAS 64-17-5	Эстетическая очистка хирургических областей
Agarose	Sigma	A4718-256	Подготовка камеры данио-рерио
Бергамо II	Thorlabs		Микроскоп с многофотонной визуализацией
Bupivacaine	Cornell Veterinary Care
GaAsP Amplified PMT	Thorlabs	PMT2100	детектор ФЭУ
Нагреватель (800 Вт)	Finnex		Аквариумный обогреватель для воды данио-рерио
Kimwipes	Kimtech		Лабораторная ткань для приготовления данио-рерио
Шприц Nanofil (10 мкм) с иглой 36 G	WPI	NANOFIL + NF36BV	Шприц и игла для инъекций бромида панкурония
Перистальтический насос	Elemental Science	ESI MP2	Водяной насос для установки данио-рерио
Полиэтиленовая трубка (внутренний диаметр 0,58 мм., внешний диаметр 0,965 мм.)		Трубка насоса Elemental Science MP2	Трубка, которая идет в рот рыбки данио-рерио
SR400	Стэнфордские исследовательские системы	SR400	Счетчик фотонов
Стандартный фотодиодный датчик мощности	Thorlabs	S122C	Детектор мощности
Тонкая полоска боксерского воска	Corning Rubber Co., Inc.		Удерживающая трубка на месте в камере данио-рерио
ThorImage	Thorlabs		Программное обеспечение для получения изображений
Трикаин (этил-м-аминобензоат, метансульфонатная соль)	MP	103106	Анестезия и эвтаназия рыбок данио-рерио
Трубка Tygon (внутренний диаметр 1/16 дюйма, внешний диаметр 1/8 дюйма)	Трубка Tygon		для потока воды для приготовления рыбок данио-рерио
VaporGuard VetEquip		931401	Для переработки изофлурана
Vetbond тканевый клей	3M	1469SB	Для приклеивания стеклянного окна на череп мыши, а также для склеивания лабораторной ткани при подготовке рыбы.
XLPLN25XWMP2	Специальный объектив для многофотонного возбуждения	Olympus

)