Визуализация миграции опухолевых клеток в ткани глиобластомы с помощью покадровой сканирующей конфокальной микроскопии

Аннотация

Источник: Parker, J. J., et al. Органотипическая модель культуры срезов глиобластомы человека для изучения миграции опухолевых клеток и специфических для пациента эффектов антиинвазивных препаратов. J. Vis. Exp. (2017)

В этом видео показана визуализация срезов ткани глиобластомы, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), с помощью конфокальной микроскопии. Изображения с высоким разрешением захватываются через определенные промежутки времени, чтобы отслеживать движение и направление опухолевых клеток.

Протокол

Все процедуры по сбору проб были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.

1. Мечение опухолевых клеток с помощью зеленого флуоресцентного белка, экспрессирующего ретровирус

ПРИМЕЧАНИЕ: Покадровая микроскопия для анализа миграции опухолевых клеток требует стабильного, долгосрочного флуоресцентного мечения клеток в культуре среза. Использование ретровируса рекомендуется потому, что он избирательно инфицирует делящиеся клетки, тем самым обогащая флуоресцентное мечение в популяции опухолевых клеток, в отличие от микроглии или других типов клеток, присутствующих в срезе. Стандартизация инфекции предполагает, что титр вируса в 10-4 КОЕ/мкл приводит к достаточной экспрессии зеленого флуоресцентного белка для отслеживания и анализа миграции клеток. Повышенный титр вируса, использование неселективных вирусов (например, аденовируса, лентивируса) или других средств мечения всех клеток могут препятствовать идентификации четких клеточных границ во время миграции, что затрудняет анализ. Использование альтернативных флуоресцентных маркеров может быть использовано и оптимизировано по мере необходимости.

1. Получите ретровирус для инфицирования срезов опухоли либо по стандартным протоколам5,14, либо из коммерчески доступного источника. Разбавьте вирусный надосадочный слой путем добавления соответствующего объема в необогащенную нейронную среду для достижения титра вируса в 10,4 КОЕ (колониеобразующие единицы)/мкл.
2. В период между 7 - 10 днями культивирования инфицируют представляющие интерес культуры срезов опухоли 5 - 10 мкл вируса (10⁴ КОЕ/мкл). Аккуратно поместите вирус по капле на поверхность каждого среза ткани. Уменьшите добавляемый объем надосадочной жидкости, если ломтик плавает на поверхности вставки. Верните тарелки, содержащие срезы культур, в инкубатор.
3. Оценивайте срезы на наличие меченых опухолевых клеток, начиная через 24 ч после вирусной инфекции. Эта временная задержка будет варьироваться в зависимости от инкорпорации вируса и кинетики экспрессии флуоресцентных генов. Для использования вирусных конструкций потребовалось 72 часа, чтобы наблюдать устойчивый флуоресцентный сигнал с помощью стандартного эпифлуоресцентного микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях срезы демонстрируют преимущественно периферическое распределение вирусно меченых клеток, что может усложнить конфокальную визуализацию. Чтобы избежать этого усложнения, попытайтесь уменьшить толщину среза и изменение толщины по всему срезу. Если культура среза имеет более толстую область вблизи центра, это может препятствовать адекватному проникновению питательных веществ, тем самым ограничивая популяцию активно делящихся опухолевых клеток. Качественным анализом для скрининга этого осложнения является добавление красителя тетразолия (т.е. МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид)) в среду для срезов культуры. Участки среза, которые не становятся синими после добавления реагента, указывают на отсутствие метаболической активности и нарушение здоровья среза.

2. Покадровая однофотонная лазерная сканирующая конфокальная визуализация миграции опухолевых клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: После успешной трансдукции и подтверждения здоровья культуры клетки могут быть визуализированы в контрольных условиях, за которыми следует такой же период визуализации в условиях лечения. С помощью этого протокола клетки были успешно визуализированы и отслеживались в течение 12 часов в каждом состоянии. Тем не менее, более короткие или более длительные периоды визуализации и обработки окружающей среды также могут быть информативными.

1. Загрузка микроскопа
   1. Перед визуализацией поместите 1 мл свежего материала для слайсов в чашку со стеклянным дном.
   2. Дайте среде в чашке со стеклянным дном уравновеситься в инкубаторе в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе растворимые агенты для мечения, такие как флуоресцентно конъюгированные лектины (т.е. изолектин IB4 для мечения микроглии) или лиганд-конъюгированные квантовые точки, могут быть добавлены в среду для срезов для идентификации клеточных субпопуляций во время визуализации.
   3. Перенесите вкладыш для визуализации в чашку со стеклянным дном с помощью стерильных щипцов в колпаке с ламинарным потоком. Перенесите чашку на столик для микроскопа.
   4. Поддерживайте срезы при температуре 37 °C и 5%_CO2 в атмосфере герметичного микроскопа. Используйте стерильное увлажнение инкубационной камеры с помощью H₂O, если это возможно, чтобы предотвратить чрезмерное испарение среды (особенно важно для более длительных экспериментов с визуализацией).
   5. Используйте конфокальный микроскоп с большим рабочим расстоянием, 10-кратным воздушным объективом и лазерным возбуждением для однофотонных и/или многофотонных объективов. заметка: Убедитесь, что объектив микроскопа обеспечивает достаточное рабочее расстояние. В результате увеличения высоты от инкубатора на сцене, чашки со стеклянным дном и вкладыша для культуры тканей критически важны цели с большим рабочим расстоянием.
   6. Закрепите стеклянную нижнюю пластину, снимите пластиковую крышку чашки Петри и накройте газопроницаемой мембраной.
2. Image Acquisition
   1. Используйте микроскоп для визуального осмотра среза и найдите подходящее поле с достаточной плотностью флуоресцентно меченых опухолевых клеток между краем среза и центром. Избегайте полей визуализации на краю среза из-за повышенной восприимчивости к сдвигам тканей во время визуализации. Для ограничения этого сдвига могут быть использованы тканевые арфы.
   2. Используйте программное обеспечение для визуализации в режиме многомерного анализа для установки первой (нижней) и последней (верхней) границ Z-стека таким образом, чтобы все позиции для визуализации содержали видимый флуоресцентный клеточный сигнал. Визуализация через 150 - 200 мкм среза с постоянным Z-шагом 10 мкм, обеспечила адекватное разрешение для отслеживания клеточных путей (это может быть скорректировано в соответствии с индивидуальными потребностями визуализации).
   3. Если микроскоп оснащен моторизованным предметным столиком, убедитесь, что для получения каждого Z-стека достаточно времени. Установите временной интервал между получениями равным времени сканирования на позицию x количество позиций для изображения (т. е. визуализируемых областей опухоли).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для одновременного возбуждения зеленого и красного флуорофоров используйте двухлинейную программу лазерного сканирования линий с одновременным возбуждением 488 нм и 633 нм. Длина волны выбранного лазерного возбуждения будет варьироваться в зависимости от экспрессии отдельных флуоресцентных белков.
   4. Поддерживайте равномерную мощность лазера и настройки конфокальных точечных отверстий между визуализируемыми областями опухоли. Используйте самую низкую необходимую мощность лазера для четкого разграничения тел опухолевых клеток и процессов для ограничения фототоксичности. Конкретные единицы измерения параметров визуализации (т.е. мощность и настройки конфокального отверстия) будут варьироваться в зависимости от характеристик микроскопа и лазерного источника.
   5. Компенсируйте потенциальное испарение среды, добавив 2–3 «буферных» шага Z-стека в фокальных плоскостях, продвигающихся к цели. Это эффективно предотвращает выход ткани из зоны получения Z-стека в вертикальной плоскости.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, минус феноловый красный	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50X), без сыворотки	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Пенициллин-стрептомицин (10,000 ЕД/мл)	Инвитроген (Gibco)	15140-122
Добавка GlutaMAX	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-глютамин (200 мМ)	Инвитроген (Gibco)	25030-081
ГЕПС (1 мес)	Инвитроген (Gibco)	15630-080
Нистатин Суспензия	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10 000 ед/мл в DPBS, асептически обработанная, биореагент, подходит для клеточной культуры
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Плавится при 65,5 С, остается жидким при 37 С и быстро схватывается ниже 25 С.
Изолектин GS-IB4 из Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	Используется в средах для маркировки микроглии/макрофагов
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Концентратор Retro-X	Clonetech	31455	Связывающая смола для неультрацентрифугирования концентрации вирусных надосадочных пластов
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	входит в состав универсальной системы экспрессии ретровирусов Retro-X
GP2-293 Вирусные упаковочные клетки	Clonetech	631530	входит в состав универсальной системы экспрессии ретровирусов Retro-X
Цианоакрилатный клей (суперклей)	Sigma-Aldrich	Z105899	Форма для
встраивания методом отслаивания средней вязкости (квадрат - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Формы для встраивания образца опухоли
Микрошпатели из нержавеющей стали	Fisher	Scientific S50823	Изгиб инструмента под углом 45 градусов на горловине лезвия ложки
Изогнутый Fisherbrand Препарирующие тонкозаостренные щипцы	Fisher Scientific	08-875
Лезвие бритвы с одним лезвием (американские безопасные бритвы)	Fisher Scientific	17-989-001	Толщина кромки лезвия составляет 0,009 дюйма. Гофрированная крышка с тупым краем снимается перед загрузкой на вибратом.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Вставка для гидрофильной клеточной культуры из ПТФЭ	EMD Millipore	PICM0RG50	30 мм, гидрофильный ПТФЭ, 0,4 мкм размер пор
35 мм Стеклянная посуда с дном	MatTek	P35G-1,5-20-C Втулка	стекла 20 мм. Покровное стекло толщиной 1,5
LSM 510 Конфокальный микоскоп	Zeiss	LSM 510	10x Air Objective (c-Apochromat NA 0,45)
PECON Stagetop Incubator	PeCON Germany	(Снято с производства)	Инкубатор PM 2000 RBT - это совместимый продукт, предназначенный для использования с микроскопами Zeiss.

диаметром