Методическая статья

Спонтанная визуализация кальция для компартмент-специфичной динамики в астроцитах

17 июня 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-Targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)

В видео демонстрируется флуоресцентная визуализация для наблюдения за специфической для компартмента динамикой спонтанного кальция в астроцитах путем последовательного мониторинга чувствительных к кальцию белков, локализованных на плазматической мембране и эндоплазматическом ретикулуме.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ca2+ Imaging

  1. Запись спонтанной активности астроцитов, экспрессирующих Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f/
    ПРИМЕЧАНИЕ: Без расщепляющей изображения оптики можно контролировать сигналы Ca2+ на плазматической мембране и вокруг эндоплазматического ретикулума (ER) в одной и той же клетке. В данной работе описывается последовательная запись Lck-RCaMP2 (генетически кодируемого индикатора Ca²⁺ с плазматической мембраной) и OER-GCaMP6f (генетически кодируемого индикатора Ca²⁺ на мембрану наружного эндоплазматического ретикулума) в одних и тех же астроцитах. Для спонтанной активности Ca2+ настоятельно рекомендуется использовать масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой больше 1,3.
    1. Включите микроскоп, камеру, источник света и нагревательную камеру микроскопа как минимум на 30 минут перед записью.
    2. Установите покровное стекло с элементами, трансфицированными Lck-RCaMP2 и OER-GCaMP6f, в записывающую камеру и добавьте 400 мкл носителя изображения. Сверху камеры накройте крышкой.
    3. Выберите набор фильтров для GCaMP6f и источник света (синий возбуждающий свет, например, 470–490 нм; см. Таблицу материалов). Найдите астроциты, экспрессирующие OER-GCaMP6f.
    4. Выберите набор фильтров и источник света для RCaMP2 (зеленый свет возбуждения, например, 510–560 нм; см. Таблицу материалов) и подтвердите, экспрессируется ли Lck-RCaMP2 в тех же астроцитах. Избегайте длительного воздействия источника света, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
    5. Запись цейтраферных изображений Lck-RCaMP2 с частотой 2 Гц в течение 2 мин. Сохранение данных изображения на жестком диске.
    6. Измените набор фильтров на фильтр для GCaMP6f. Запись покадровых изображений ООР-GCaMP6f в том же поле зрения с частотой 2 Гц в течение 2 минут. Сохраните данные на жестком диске.
    7. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения для анализа изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
18-мм диаметр круглые покровные стеклаKarl Hecht "Assistent"#41001118Толщина 1, диаметр 18 мм круглые покровные стекла; можно использовать альтернативные покровные листы.
Камера для записи Для использования были доступны следующие камеры: камера с охлаждением и ПЗС-матрицей (например, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD камера (например, Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) или CMOS-камеры (например, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Программное обеспечение такое как Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH) и TI Workbench14 (изготовленное на заказ)
Носитель изображения и буфер Используйте оптимальную среду или буфер для эксперимента. При использовании среды желательно использовать среду без фенольного красного для снижения фоновой флуоресценции. Добавьте 20 мМ HEPES для поддержания pH вне инкубатора с углекислым газом.
Инвертированный флуоресцентный микроскоп типа IX73 (Olympus) или Eclipse TI (Nikon Instech)
Комплект фильтров микроскопа для визуализации Подходящий фильтр для GFP (возбуждение, 480 ± 10 нм; излучение, 530 ± 20 нм)
Комплект фильтров микроскопа для визуализации Подходящий фильтр для RFP (возбуждение, 535 ± 50 нм; излучение, длительность пропускания 590 нм)
нагрева под микроскопомСистема нагрева для поддержания температуры клеток при температуре 37°C во время визуализации. Чтобы избежать дрейфа, вызванного тепловым расширением, рекомендуется использовать системы нагрева, охватывающие весь микроскоп (например, Tokai Hit, Thermobox).
Микроскоп Источник света для возбуждения Ртутная лампа (100 Вт), Ксеноновая лампа (75 Вт), Светодиодная (LED) система освещения (например, CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-волновый светодиодный источник; Lumencor, световой модуль SPECTRA X). В случае ртутной комовой и ксеноновой лампы используйте нейтральный фильтр для снижения интенсивности возбуждения.
микроскопаПлан-Апохромат масляный иммерсионный объектив с числовой апертурой выше 1,3 настоятельно рекомендуется для регистрации спонтанной активности Ca²⁺ в нейронах и астроцитах.
Записывающая камераElveflowLudin ChamberЭта записывающая камера предназначена для круглых покровных стекол диаметром 18 мм.
Стереомикроскоп Используется для препарирования гиппокампа. Доступны стереомикроскопы Olympus SZ60 или аналогичные.
микроскопических изображений для анализа изображений, GCaMP6f RCaMP2 Система Объектив

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Astrocyte CalciumFluorescence MicroscopyTime Lapse ImagingMembrane Targeted IndicatorsPlasma MembraneEndoplasmic ReticulumCalcium Sensitive Proteins

Похожие статьи