ПЦР-метод генотипирования различать дикого типа и декоративных многообразия Императы цилиндрической</em

Краткое содержание

Мы предоставляем экономически эффективного и быстрого молекулярного генотипирования протокол, который использует различные конкретные ПЦР-праймеры, что целевой последовательности ДНК, различия внутри хлоропласта trnL-F Spacer региона различать сорта Императы цилиндрической (Cogongrass), которые не могут быть выделены только по морфологии. Эти сорта включают федерального значения вредных сорняков, cogongrass и тесно связанных, в широком распространении различных декоративных, я. cylindrica Обл. Koenigii (Японская трава крови).

Аннотация

Дикий тип I. cylindrica (когонграсс) входит в десятку худших инвазивных растений в мире, негативно влияя на сельское хозяйство и природные ресурсы в 73 различных странах Африки, Азии, Европы, Новой Зеландии, Океании и Америки^1-2. Когонграсс образует быстро раскидистые монодоминантные насаждения, которые вытесняют большое разнообразие местных видов растений и, в свою очередь, угрожают местным животным, зависящим от вытесненных местных видов растений в качестве корма и укрытия. В дополнение к проблеме, декоративный сорт [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] широко продается под названиями Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron и японской кровавой травой (JBG). Этот сорт предположительно стерилен и неинвазивный и считается желанным декоративным растением из-за его красных листьев. Тем не менее, при правильных условиях, JBG может производить жизнеспособные семена (Carol Holko, личное сообщение 2009 г.) и может вернуться к зеленой инвазивной форме, которая часто неотличима от когонграсса, поскольку она приобретает отличительные характеристики инвазивного сорта дикого типа⁴ (Рисунок 1). Это делает идентификацию с помощью морфологии сложной задачей даже для хорошо подготовленных систематиков растений. Реверсия JBG к агрессивному зеленому фенотипу также не редкое явление. Используя сравнение последовательностей кодирующих и вариабельных областей как в ядерной, так и в хлоропластной ДНК, мы подтвердили, что JBG вернулся к зеленой инвазивности в штатах Мэриленд, Южная Каролина и Миссури. JBG был продан и посажен практически в каждом штате континентальной части США, где нет активного заражения когонграссом. Масштабы проблемы возврата не совсем понятны, потому что восстановленные растения не документированы и часто уничтожаются.

Применение этого молекулярного протокола предоставляет метод идентификации возвратов JBG и может помочь предотвратить совместное возникновение этих разновидностей и, возможно, гибридизацию. Когонграсс является облигатным ауткроссером и при скрещивании с другим генотипом может давать жизнеспособные семена, распространяемые ветром, которые распространяют когонграсс на большие расстояния^5-7. JBG имеет немного другой генотип, чем когонграсс и, возможно, способен образовывать жизнеспособные гибриды с когонграссом. В дополнение к проблеме, JBG более холодо- и теневынослив, чем когонграсс^8-10, и поток генов между этими двумя сортами, вероятно, приведет к созданию гибридов, которые более агрессивны, теневыносливы и холодостойки, чем когонграсс дикого типа. В то время как дикий тип когонграсса в настоящее время заражает более 490 миллионов гектаров по всему миру, на юго-востоке США он заражает более 500 000 гектаров и способен занять большую часть США, поскольку он быстро распространяется на север благодаря своей широкой нише и географическому^{потенциалу}. Потенциал генетического скрещивания является серьезной проблемой для Федеральной программы Недели вредных веществ Министерства сельского хозяйства США и APHIS. В настоящее время USDA-APHIS запрещает JBG в штатах, где есть серьезные заражения когонграссами (например, Флорида, Алабама, Миссисипи). Тем не менее, предотвратить объединение двух сортов может оказаться более сложным, поскольку когонграсс и JBG расширяют свое распространение. Кроме того, распространение возвратов JBG в настоящее время неизвестно, и без возможности идентифицировать эти сорта с помощью морфологии, некоторые заражения когонграссами могут быть результатом возвратов JBG. К сожалению, современные молекулярные методы идентификации обычно основаны на AFLP (полиморфизмах длины амплифицированных фрагментов) и секвенировании ДНК, которые требуют много времени и средств. Здесь мы представляем первый экономически эффективный и надежный метод молекулярного генотипирования на основе ПЦР, позволяющий точно различать когонграсс и возврат JBG.

Протокол

1. Коллекция образцов и охраны

Этот метод был разработан и протестирован с использованием свежих, замороженных, а в последнее высушивают ткани листа.

1. Определить cogongrass и / или JBG тканей с помощью систематик, которая специализируется на идентификации видов трав. Благодаря ярко-красные листья, декоративные JBG легко визуально отличить от дикого типа cogongrass и JBG вернуться, однако cogongrass и JBG вернуться почти неотличимы друг от друга. Cogongrass и JBG вернулся фенотип есть зеленый, листья больше, значительно больше и больше корневища, листья и больше площади, чем JBG ¹² (рис. 1).
2. Свежие ткани листа обеспечивает наиболее распространенных и высокое качество ДНК и может быть собрана из поля или парниковых выросли I. cylindrica растений. Если свежие ткани, которые будут использоваться, извлечение ДНК в течение 3 часов после сбора, чтобы предотвратить деградацию. В противном случае, подготовить ткань для хранения, keepiнг ткани прохладно и от прямых солнечных лучей.
3. Для сохранения тканей для экстракции ДНК на более поздние сроки, наиболее оптимальный метод для замораживания и хранения тканей при температуре -80 ° С сразу. Не допускайте замороженной ткани таять до выделения ДНК. Передача замороженных тканей жидким азотом до шлифовальных шаги экстракции ДНК для предотвращения оттаивания.
4. Если -80 ° C морозильнике нет, сухой тканью сразу. Для сухого хранения, поместите ткань в бумажный конверт и хранить конверт в обезвоженной силикагелем или другим активным осушителем при комнатной температуре. Небольшое количество индикаторов кремния, смешанного с не-указывает кремния будет гарантировать, что кремний является полностью обезвоженный и подходит для сушки растительной ткани.
5. Используйте как минимум в 10 раз больше, чем силикагель свежей ткани листьев по весу. Завод ткань должна высохнуть в течение 24 часов. Качества и количества ДНК снижается за счет сухого хранения в течение долгого времени (как в случае с гербарных образцовс).

2. Экстракции ДНК

Чтобы извлечь ДНК из тканей растений, следуйте DNeasy завод Mini Kit (Qiagen, Валенсия, штат Калифорния, Cat # 69104 или 69106) инструкции изготовителя с одной незначительной модификации. Вместо того чтобы использовать предлагаемые менее 100 мг свежей ткани или менее 20 мг сухой тканью для каждого столбца, молоть больше, чем 100 мг, а затем передать 100 мг из свежих или замороженных тканей (или> 20 мг от сухой тканью) в соответствующие трубы для добычи. Ядерная и пластид ДНК извлекается одновременно.

1. Перед началом этой процедуры убедитесь, что этиловый спирт был добавлен в буфер AP3 / E и AW.
2. Измельчить> 100 мг свежей или замороженной ткани листа (или> 20 мг сухой ткани листа) в мелкий порошок с помощью трех раундов жидкий азот с измельчением в охлажденном ступку и пестик. Недостаточное разрушение исходного материала или недостаточное лизис может также привести к снижению урожайности ДНК. Тщательно растереть Tissие и не перегружайте столбцы со слишком большим количеством ткани.
3. Передача 100 мг порошка из замороженных свежих или замороженных тканей (или 20 мг порошка из сухой ткани) в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 400 мкл буфера AP1 и 4 мкл РНКазы А. Каждая трубка может быть помещена в небольшую стойку на баланс для контроля правильного веса ткани в трубку.
4. Vortex или дрожания образца (ов) перемешать и выдержать в течение 10 мин при 65 ° С, переворачивая трубку (ы) в 2-3 раза во время инкубации.
5. Добавить 130 мкл буфера AP2 для каждого образца. Смешайте путем обращения трубки (ы) в несколько раз, и инкубировать в течение 5 минут на льду.
6. Внесите каждый лизат в отдельном столбце мини спина QIAshredder, и поместить каждого столбца в 2 мл пробирку (входит в комплект). Центрифуга колонке (а) в течение 2 мин при 20000 х г (~ 14 000 оборотов в минуту), а также передавать друг проточной долю в новой трубкой (не входит в комплект), не нарушая любые формируются гранулы.
7. Добавить 1,5 объема буфера AP3 /E, и перемешать с помощью пипетки.
8. Передача 650 мкл смеси в DNeasy Мини колонки спина в 2 пробирки мл. Центрифуга колонке (а) в течение 1 мин при 6000 мкг (~ 8000 оборотов в минуту), и отказаться от проточных. Повторите этот шаг с остальной смеси для каждого образца.
9. Поместите спина колонке (а) в новой 2 мл пробирку (ы), и добавить 500 мкл буфера AW в верхней части каждой колонки. Центрифуга колонке (а) в течение 1 мин при 6000 мкг (~ 8000 оборотов в минуту), а также отказаться от проточных.
10. Добавьте еще 500 мкл буфера AW в верхней части каждой колонки. Центрифуга в течение 2 мин при 20000 х г (~ 14 000 оборотов в минуту). Этот шаг будет сухой колонны, таким образом удаляя остаточный этиловый спирт, содержащийся в буфер, который может подавлять ПЦР.
11. Передача каждого спина колонку на новую трубу 1,5 мл образца микроцентрифужных. Добавить 100 мкл буфера AE в верхней части каждой колонке для элюирования и инкубировать колонке (а) в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга колонке (а) в течение 1 мин при 6000 мкг (~ 8000 оборотов в минуту), чтобы собрать ДНК.
12. Повторите эти шаги элюирования один раз, элюируя ДНК в те же 1,5 мл микроцентрифужных трубки для получения 200 мкл образца. Храните образцы ДНК при температуре -20 ° C до использования. ДНК концентрации зависит от типа ткани и условий хранения. Оптимальные урожаи получены при элюирования ДНК в общей сложности 200 мкл буфера AE, однако концентрация может быть увеличена, если элюирования объемы снижаются до всего лишь 50 мкл.

3. Проверка качества и количества ДНК

1. Проверка качества и количества добываемых ДНК до установки с помощью ПЦР-спектрофотометр или флуорометр и гель-электрофореза. Это поможет обеспечить успех последующих шагов.
2. С помощью спектрофотометра, тест ДНК качество и количество. Хорошие урожаи ДНК должна быть между 50 и 150 нг / мкл 260/280 и 230/280 соотношение близко к 2.0. В качестве примера, на рисунке 2 показывает хорошие результаты качества, используя спектрофотометр NanoDrop (ThermoScientific, Уилмингтон, Делавэр).
3. Проведение электрофореза с использованием стандартного 1% агарозном геле. Проверьте наличие относительно больших групп (> 10 Kb), не для маленьких штрихов от загрязнения РНК (рис. 3).
4. Если концентрация ДНК высокий, разбавленных образцов ДНК до 70 нг / мкл для последующих шагов.

4. ПЦР праймеры

ПЦР-праймеры, используемые в настоящем протоколе основывается на последовательности различия между пластид trnL-F Spacer области cogongrass и JBG генотипов. Эти различия возникают в виде полиморфизмов (Single нуклеотидные полиморфизмы) и индели (вставка и удаление), что позволило развитие эстрадно-специфических праймеров путем размещения грунтовки в местах уникальных последовательностей (рис. 4).

1. Качество грунтовки может оказать существенное влияние на результаты ПЦР. Заказ грунтовки от уважаемой компании. Мы заказываем нашим грунтовки от Oblique Bio, Inc (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "целевых =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Хантсвилле, Алабама), требуя только стандартные процедуры опреснения.
2. trnL-F положительный грунтовки управления: Этот учебник набор усиливает пластид trnL-F Spacer области наиболее травы таксонов ^11-13 и служит хорошим положительным контролем (в результате чего группа 890 б.п.).
   

   Имя	Последовательность
   TRNF (ГАА)-F	5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 '
   trnL (5 'экзонов)-C	5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 '

3. Дикого типа cogongrass праймеров: Этот учебник набор специфичных для cogongrass и не усиливать trnL-F области JBG генотипов. Набор результатов в группе, что составляет 595 базисных пунктов.
   

   Имя	Sequence
   trnLF-C-F1	5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 '
   trnLF-C-R1	5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 '

4. JBG и JBG Вернуться праймеров: Этот учебник набор специфичных для JBG генотип и не усиливать trnL-F области cogongrass. Набор результатов в группе, то есть 594 базисных пунктов.
   

   Имя	Последовательность
   trnLF-R-F2	5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 '
   trnLF-R-R2	5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 '

5. Ресуспендируйте каждого праймера в достаточном объеме нуклеазы без DDH ₂ O для получения 100 мМ растворы, которые могут храниться при температуре -20 ° C, в долгосрочной перспективе.
6. Развести каждого праймера акции до 12 мм до шага установки ПЦР.

5. ПЦР-установки

ДНК извлечения усиливаются с помощью каждого из указанных наборов праймеров в ПЦР. Включите положительный контроль, чтобы все ПЦР реагентов работают хорошо и может генерировать группы. Включите отрицательный контроль, чтобы ни один из реагентов загрязненных нежелательных ДНК. Отрицательного контроля не содержит шаблон и должно привести к отсутствию группы продукции.

1. Подготовьте все реакции в тонкостенных труб ПЦР для улучшения теплообмена между блоком Термоциклер и образцом. Мы рекомендуем использовать коммерчески доступные аэрозоль без пипетки советов, которые помогут избежать заражения.
2. Для каждого изолированного образца ДНК, созданная 50 мкл реакции ПЦР с использованием каждого из указанных наборов грунт в 0,2 мл тонкостенных труб ПЦР, добавив следующие реагенты на ICE в указанном ниже порядке. Если несколько образцов готовятся, сделать коктейль, содержащий все реагенты, за исключениемДНК шаблон для установления единых условий между всеми реакциями.
   

   ПЦР реагентов	Объем использовано	Окончательный Concetration
   Нуклеазы без DDH 2 O	40,5 мкл
   10X Преимущество 2 ПЦР буфер (Clonetech, CA)	5,0 мкл	10% (объем / объем)
   Преимущество сверхчистых ПЦР дНТФ Mix (10 мм каждая, Clonetech, CA)	1,0 мкл	0,2 мМ
   Пример # 1 (12 мкм в DDH 2 O)	1,0 мкл	0,24 мкм
   Праймер 2 (12 мкм в DDH 2 O)	1,0 мкл	0,24 мкм
   Преимущество 2 полимеразной Mix (Clonetech, CA)	0,5 мкл	1% (объем / объем)
   Экстракции ДНК(70 нг / реакция; настроить DDH 2 O объем по мере необходимости)	1,0 мкл	1,4 нг / мкл
   	Всего: 50.0 мкл

3. Чтобы убедиться, что все ПЦР реагентов работают хорошо, установить положительные управления с помощью положительный грунтовки управления. Этот учебник набор одинаково хорошо работает на cogongrass, JBG, JBG вернуться и других трав и приведет в группе, 890 базисных пунктов.
4. Установка отрицательного контроля с использованием тех же грунтовка контроль установлен в качестве положительного контроля, используя DDH ₂ O, а не ДНК. Если все реагенты не содержат ДНК загрязняет, эта реакция может привести к не группа.
5. Если концентрация ДНК низкий, более ДНК могут быть добавлены к каждой реакции, регулируя количество нуклеазы без DDH ₂ O используется для приведения объема реакции до 50 мкл. Не используйте более 5 мкл ДНК (10% от от общего объема) за тeaction, как возможных примесей, содержащихся в образцах ДНК может ингибировать ПЦР.

6. ПЦР Велоспорт

1. Проведение ПЦР-амплификации в Термоциклер оснащены подогревом крышкой, используя следующие параметры велосипедных ПЦР. Мы используем Mastercycle про S Термоциклер (Eppendorf, Hauppauge, NY) настроен для работы со стандартными условиями линейного изменения температуры. Любое качество Термоциклер должны выполнить хорошо.
   

   Цикл	Денатурация Отжиг	Полимеризация
   1	2 мин при 95 ° C
   2	30 сек при 95 ° C	30 сек при 61 ° С, 90 сек при 68 ° C 35 циклов
   3		5 минут при 68 ° C
   Держите при температуре 4 ° С до образца удаляется

2. Оптимизация условий для ПЦР (включая грунтовку температуры отжига, расширение раза, а число циклов) по мере необходимости в зависимости от качества ДНК, праймеры, Taq полимераза или типа Термоциклер используется. Мы рекомендуем использовать градиент способны Термоциклер при определении оптимальной температуры отжига.
3. Если Термоциклер используется не нагретой крышкой, добавьте 1 каплю минерального масла в верхней части каждого образца для предотвращения испарения во время велосипедных ПЦР.

7. Гель электрофореза ПЦР продуктов

Для визуализации результатов анализа отдельных продуктов ПЦР на 1% агарозном геле с использованием стандартных электрофореза.

1. Смешайте 2 мкл стандартного буфера загрузки ДНК (обычно 5 или 6 раз раствором) с 5 мкл продукта ПЦР усиливается.
2. Загрузка образцов на 1% агарозном геле, содержащем EtBr (бромистый этидий ДНК окрашивания) с еither TAE или SB (борат натрия) буфера системы ^16. Мы используем 1 мкл 10 мг / мл EtBr маточного раствора на 100 мл 1% агарозном (0,1 мкг / мл).
3. Запуск образца при ~ 120В до красителя перед достигает ¾ от общей длины геля.
4. В ультрафиолетовом свете (например, короткие волны ультрафиолетового света окна), в результате осмотра полосы, чтобы увидеть, если соответствующий фрагмент усиливается.
5. Документ гель и в результате диапазонах доступных фото-документации системы или камеры.

8. Представитель Результаты

При визуализации продуктов ПЦР, cogongrass имеет уникальный рисунок полос по сравнению с JBG или вернулись JBG (рис. 5). Для каждого образца ДНК, trnL-F положительным набором праймеров управление должно привести к одной высокой интенсивности полосы ~ 890 базисных пунктов. Это подтверждает, что все ПЦР реагентов работают хорошо. Кроме того, отрицательный контроль (без шаблона) реакция не должна содержать полосы для любого грунтовка си др. используются. Это подтверждает, что ни один из реагентов были заражены.

Если образец ДНК происходит от дикого типа cogongrass, реакция ПЦР, используя cogongrass-специфического праймера набора приведет к одной полосы при ~ 595 б.п., а JBG-специфических праймеров приведет не группа. Кроме того, если образец ДНК происходит от JBG или вернулись JBG, реакция ПЦР, используя JBG-специфического праймера набора приведет к одной полосы при ~ 594 б.п., а cogongrass-специфических праймеров приведет не группа. Потому что JBG и вернулся JBG имеют одинаковые последовательности нуклеиновых кислот, то они будут, следовательно, имеют одинаковые полосы узоров. Если многие образцы для сравнения на геле в то же время, мы рекомендуем запускать все образцы, полученные от каждого праймера установить рядом друг с другом, тем самым облегчая поиск образцов для положительного результата.

Морфологические различия между JBG и JBG возвращается достаточно очевидны (например, красный цвет листьев и меньше ростом от JB G по сравнению с зеленой окраской, большим ростом и агрессивный рост JBG вернуться), так что пока результатов ПЦР будет таким же, JBG сорта легко отличить использованием морфологии растений.

Рисунок 1. Сравнение парниковых выросли императы цилиндрической обл. Koenigii (японская трава крови), Восстановлено I. cylindrica обл. koenigii (JBG Восстановить) и И. cylindrica (дикого типа cogongrass).

Рисунок 2. Пример образцы ДНК проверены с помощью NanoDrop спектрофотометр. Обратите внимание, что независимо от того, спектрофотометр используется, 260/280 соотношение должно быть близко к 1,8 и 260/230 соотношение должно близко к 2.0.

Отправить по почте ">
Образцы Рисунок 3. ДНК проверены с использованием стандартных гель-электрофореза в 1% агарозном геле. Коммерческие маркер ДНК была использована для анализа размера. Lane № 4 является примером плохой образец ДНК качества, показывая, размытие и некоторые загрязнения РНК.

Рисунок 4. Последовательность выравнивания trnL-F регионов императы цилиндрической обл. Koenigii (японская трава крови), Восстановлено I. cylindrica обл. koenigii (JBG Восстановить) и И. cylindrica (дикого типа cogongrass). Вертикальные черные стрелки указывают на различия в последовательности, в результате ОНП и индели. Горизонтальная зеленые стрелки указывают на положение дикого типа грунтовки cogongrass для cogongrass-ПЦР. Горизонтальная красные стрелки указывают Ропереходы из JBG и JBG Вернуться праймеров для JBG-ПЦР.

Рисунок 5. Представитель результате гель-электрофореза продуктов ПЦР, полученных от cogongrass, JBG и JBG вернуться образцы ДНК в сочетании с cogongrass и JBG-специфических праймеров, а также trnL-F положительного контроля и не шаблон отрицательного контроля.

Обсуждение

Питомник США и пейзаж промышленности процветать на выращивании и продаже экзотических и новых видов растений. Это, в сочетании с растущей глобализацией торговли, увеличивает вероятность того, что инвазивных видов растений войдет, создание и распространение в США, возможность регулирования федерального таких растений основывается на информации, которая зачастую отсутствует, в том числе могут стать инвазивными , правильный таксономии, и генетические отличия от родных и натурализованный таксонов. Потому что наши знания о инвазивных растений часто ограничены, импортные растения со скрытыми инвазивные характеристики были добровольно введены только узнать позже, что они вторгаются в нашу сельского хозяйства и природных ресурсов. Этот протокол направлен на решение таких проблем, связанных с I. cylindrica сортов, обеспечивая первый упрощенный молекулярный метод, который может точно различать дикого типа cogongrass и вернулась форма его коллега декоративных JBG.

jove_content "> Для развития этого протокола, дикого типа cogongrass была собрана из натурализованных населения на пруду Крик лесной группы в округе Санта-Роза у Джея, штат Флорида, в июне 2008 года. JBG было закуплено из коммерческих питомников (Bluebird Детский сад, Inc ..) в июне 2008 года, а также из собрания домовладельцев в Колумбии, штат Миссури JBG возвращается были получены из двора Кэмпбелл Геологический музей в Clemson University, штат Южная Каролина в июне 2008 года, из University Park в Riverdale, MA в июне 2009 года, и с передней дворе домовладельцев в Колумбии, штат Миссури в 2009 году (определенных Леланд Cseke). Все растения были сохранены в теплице находится в университете штата Алабама в Хантсвилле (Huntsville, AL).

Генетическое секвенирование ДНК, собранных из этих растений, занесенных в глубине сравнения 9 независимых областей ДНК широко используется для штрих-кода растений ^2. Во всех случаях, последовательности JBG были 100% бонус до тех JBG вернуться, тем самым помогаяубедиться, что JBG действительно вернуться к зеленым, инвазивные формы. Только ядерный ЕЕ и хлоропластов trnL-F регионах различия, которые могут быть использованы для генетически различия между cogongrass и JBG. Регион ЕГО имеет в общей сложности 3 ОНП (единичные нуклеотидные полиморфизмы) между cogongrass и JBG, а trnL-F регион имеет 2 ОНП и 2 индели (вставка и удаление). Эти генетические различия позволили эстрадно-ПЦР праймеры, которые будут разработаны, что может отличить дикого типа cogongrass и JBG возвращается. Наиболее надежные результаты пришли из праймеров происходит от пластид trnL-F региона. Таким образом, этот протокол на основе последовательности различия между trnL-F регионов геном хлоропластов cogongrass, JBG и вернулся JBG (рис. 4).

Для создания грунтовки, более характерные для сорта идет речь, и, чтобы избежать ложных срабатываний от близкородственных видов, др.л известно trnL-F последовательности I. cylindrica сорта по сравнению с trnL-F последовательностей из родственных видов трав (43 независимых последовательностей из 29 видов, например, Cymbopogon citratus, Sorghastrum incompletum, Coix Lacryma-Jobi, Miscanthus Sinensis, сахар officinarum, сорго halepense). Хотя, мы рассмотрели различные конкретные первичной последовательности через 29 видов трав, специфику эстрадно-специфических праймеров не был всесторонне рассмотрен на его способность усиливать ДНК от большинства других видов трав. Таким образом, ткани, используемые для экстракции ДНК должны быть тщательно определены, как и я cylindrica до начала этого протокола. Если трава не могут быть определены либо как cogongrass или JBG, то мы предлагаем секвенирование ПЦР-продукта, чтобы убедиться, что последовательности точно соответствует cogongrass или JBG. В настоящее время наиболее точный метод для проверки подлинности данного трава образец для выполнения ПЦР и на тРНБ-F и ее регионов, а затем последовательность проверки продуктов ПЦР и сравнения последовательностей известных последовательностей точно определить таксонов. ДНК может быть усилен контроль использования праймеров, описанных в этом протоколе (для trnL-F области) или других праймеров, которые доступны в других публикациях ^13-15. Последовательность гораздо больше труда и дорогостоящие, чем при использовании нашей упрощенной процедуре.

Качество праймеров для ПЦР имеет решающее значение для успеха процедуры. Мы сделали грунтовки для этой процедуры можно получить Oblique Bio, Inc ( http://www.obliquebio.com/web/ , Хантсвилле, Алабама). Преимущество заказа праймеров из Oblique Bio является то, что они хранят большое количество порции каждого праймера с одинаковым серийное производство образца праймеров мы использовали для оптимизации в нашей лаборатории. Следовательно, грунтовки не только в той же последовательности, но тэй приходят с того же серийного производства, которая была использована в данном протоколе. Использование праймера от той же партии, может помочь избежать посторонних переменных в процедуре, которая может быть следствием различий в качестве праймеров ПЦР. Кроме того, в то время как другие полимеразы Taq должно работать нормально для ПЦР, качество Taq полимеразы использовать окажет влияние на качество результатов ПЦР. Для обеспечения лучшей согласованности в ПЦР реагентов, мы оптимизировали протокол с использованием реагентов из Clontech. Преимущество 2 полимеразы (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 или 639202) представляет собой смесь из надежных, горячего старта Taq-полимеразы и корректура фермент, который помогает обеспечить высокую специфичность и более точные уточнениями.

Поскольку этот протокол основывается на хлоропластов ДНК, которая наследуется по материнской линии в травах, гибридизация между событиями cogongrass и JBG генотипов не могут быть захвачены с нашими молекулярно процедуру идентификации. В случаях, когда это hypridization suspeИДКТК, мы рекомендуем использовать ядерное регионов, которые наследуются от обоих родителей. Наиболее часто используемые, не пластид переменная региона рассмотреть на заводе генотипирования является ядерной рибосомальной регионе ЕЕ ^13-15,17. В настоящее время мы добиваемся прогресса в направлении усиления мультиплексирования хлоропласта trnL-F региона с ядерной области ИТС в то же ПЦР-пробирку. Мультиплексирование пластид с ядерной области ДНК потенциально обойти ограничения использования как в одиночку, однако, такие методы требуют оптимизации и дополнительной оценки с целью определения возможности в каждом конкретном случае. Использование количественного ПЦР в реальном времени (КПЦР) и новых технологий, таких как молекулярные маячки (флуоресцентных зондов грунтовка), также оценивается как аварийные и точные методы генотипирования растений.

Протокол, представленные здесь обеспечивает быстрый и надежный способ отличить JBG вернуться из этого дикого cogongrass. Мы рекомендуем использоватьRS этого протокола связаться с нами, чтобы сообщить результаты, полученные с использованием этого протокола. Такой обмен информацией поможет предоставить информацию о распределении JBG возвращается. Это также поможет регуляторов USDA принимать обоснованные решения о действиях, которые могут быть нужны, чтобы обойти распространения и потенциального гибридизации сортов высоко инвазивный cogongrass.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
DNeasy завод Mini Kit	Qiagen, Валенсия, штат Калифорния	69104 или 69106	Любой уважающий себя геномной ДНК растений комплект, который дает хорошее качество ДНК должны работать нормально для этих процедур.
TRNF (ГАА)-F	Oblique Bio, Inc	3-0578	Вперед положительного контроля грунтовка
trnL (5 'экзонов)-C	Oblique Bio, Inc	3-0579	Обратный праймер положительный контроль
trnLF-C-F1	Oblique Bio, Inc	3-0864	Вперед дикого типа cogongrass грунтовка
trnLF-C-R1	Oblique Bio, Inc	3-0865	Обратныйдикого типа cogongrass грунтовка
trnLF-R-F2	Oblique Bio, Inc	3-0866	Вперед JBG и JBG вернуться грунтовка
trnLF-R-R2	Oblique Bio, Inc	3-0867	Обратный JBG и JBG вернуться грунтовка
Преимущество сверхчистых ПЦР дНТФ Mix	Clontech, Mountain View, CA	639125
Преимущество 2 полимеразной	Clontech, Mountain View, CA	639201 или 639202	Хорошая корректура, горячего старта Taq полимеразы