Геном Редактирование с помощью пользовательских CompoZr нуклеаз цинкового пальца (ZFNs)

Краткое содержание

CompoZr пользовательских цинк-Finger нуклеазы (ZFN) Сервис позволяет точного редактирования генома любого организма или клеточной линии в любой локус определяется пользователем. В этой статье описывается процесс проектирования, изготовления, проверки и реализации службы CompoZr пользовательских ZFN.

Аннотация

Редактирование генома представляет собой мощный метод, который может быть использован для выяснения функции генов и генетических основ заболеваний. Традиционные методы редактирования генов, такие как химический мутагенез или случайная интеграция последовательностей ДНК, вносят недискриминационные генетические изменения с общей низкой эффективностью и требуют включения нежелательных синтетических последовательностей или использования аберрантных условий культивирования, что может привести к ошибкам в биологическом исследовании. Напротив, транзиентная экспрессия ZFN в клетке может обеспечить точное, наследуемое редактирование генов с высокой эффективностью без необходимости применения химических веществ или интеграции синтетических трансгенов.

Нуклеазы «цинковые пальцы» (ZFN) представляют собой ферменты, которые связываются со специфическими последовательностями двухцепочечной ДНК (дцДНК) и разрезают их. Функциональный блок CompoZr ZFN состоит из двух отдельных мономерных белков, каждый из которых связывается с «полусайтом» ДНК длиной примерно 15-18 нуклеотидов (см. Рисунок 1). Когда два мономера ZFN «находят» свои соседние сайты-мишени, домены расщепления ДНК димеризуются и создают двухцепочечный разрыв (DSB) в ДНК.¹ Введение DSB в геном с помощью ZFN создает основу для высокоэффективного редактирования генома. Несовершенный ремонт DSB в клетке по пути репарации ДНК посредством негомологичного соединения концов (NHEJ) может привести к возникновению небольших вставок и делеций (инделей). Создание инделей внутри кодирующей последовательности гена клетки может привести к сдвигу рамки считывания и последующему функциональному нокауту генного локуса с высокой эффективностью.² Хотя в данном протоколе описывается использование ZFN для создания нокаута гена, интеграция трансгенов также может быть осуществлена путем гомологично-направленной репарации в месте разреза ZFN.

Сервис по созданию индивидуальных ZFN CompoZr представляет собой систематический, комплексный и хорошо характеризуемый подход к направленному редактированию генов для научного сообщества с использованием технологии ZFN. Специалисты Sigma тесно сотрудничают с исследователями, чтобы 1) провести тщательный анализ, включающий изучение структуры соответствующего гена, его биологии и модельной системы в соответствии с целями проекта, 2) применить эти знания для разработки обоснованной стратегии таргетинга, 3) затем спроектировать, создать и функционально валидировать ZFN для подтверждения их активности в соответствующей клеточной линии. Исследователь получает геномную ДНК положительного контроля и праймеры, а также готовые к использованию реагенты ZFN, представленные как в виде плазмидной ДНК, так и в виде мРНК, синтезированной in-vitro. Затем эти реагенты могут быть введены для транзиентной экспрессии в выбранной исследователем клеточной линии или типе клеток. Затем образцы тестируют на предмет редактирования гена в интересующем локусе стандартными методами молекулярной биологии, включая ПЦР-амплификацию, ферментативное расщепление и электрофорез. После обнаружения положительного сигнала редактирования гена в исходной популяции клетки подвергаются клонированию единичными клетками и генотипированию для идентификации мутантных клонов/аллелей.

Протокол

1. Нестандартная конструкция ZFN процесс

1. Для ускорения процесса проектирования ZFN, следователь должен обеспечить:
• Информация о гена-мишени, такие как ген имен, видов и генной аннотации / идентификационный номер.
• Четко указано на-все цели эксперимента (например, нокаутом или Knockin)
• Любые конкретные факторы гена-мишени, которые включают атипичные структуры генов, специальные биологии вовлечены в генетический локус, или гомологичными регионами других в геноме.
• Конкретный выбор последовательности ДНК для цинка пальца нуклеазы целевой.
2. Команда Sigma биоинформатики проводит в дизайне кремний ZFN развивать первоначальный сайтов пальцем цинка цели.
3. Начальные участки целевой ZFN предоставляются ZFN научно-технического консультанта. Для более технически сложных проектов, этот ученый Sigma работает со следователями по разработке проекта стратегии.
4. Биоинформатика дает лучшие сайты целевой ZFN к следователю для ознакомления. После утверждения потенциальных объектов целевой ZFN, эта информация содержится в команде Производство ZFN начать ZFN производственного процесса.

2. Пользовательские Производство ZFN

1. Архив Sigma цинка модулей палец используется для сборки утвержденными проектами ZFN.
2. Каждый дизайн ZFN собран и последовательности проверить на высокой платформе клонирование пропускной способности.
3. После производства все проекты ZFN завершится каждый ZFN отправляется на проверку.

3. Проверка пользовательского ZFNs

1. ZFN проектовчеловека, мыши, крысы или СНО видов подтверждены в хорошо изученных клеточных линий для каждого вида дрожжей на основе анализа используется для других организмов или типа клеток.
2. ZFN конструкции поставляются в соответствующей строке ячейки nucleofection и ZFNs выражены.
3. ДНК собирают из пула ZFN трансфицированных клеток и область интересов ПЦР усиливается.
4. Cel-1 тест Затем проводится на ПЦР-продукт. Гель-электрофорез проводится на Cel-1 тест на проверку ZFN деятельности.
5. Самая высокая проектная деятельность ZFN что подтверждается Cel-1 тест затем передается клиенту. ZFNs поставляются в РНК и ДНК плазмиды, а также ПЦР-праймеров для Cel-1 и анализ геномной ДНК в качестве положительного контроля.

4. Доставка Утвержденные ZFNs по Nucleofection

1. Семенной клеток с плотностью 2x10 ⁵ клеток / мл в день до nucleofection.
2. В день nucleofection,вынуть сотовый линии Nucleofector Kit V и пусть прогреть до комнатной температуры.
3. Добавить дополнение к Nucleofection Решение V в соответствии с протоколом производителя.
4. Подсчитайте клеток. Плотность клеток должна быть в пределах 2,5-5x10 ⁵ клеток / мл.
5. Заполнить 6-луночный планшет с 2 мл среды в каждую лунку и предварительно тепло СО ₂ инкубатор при 37 ° С, по крайней мере за 20 минут до nucleofection.
6. Центрифуга 2x10 ⁶ клеток на трансфекции (8x10 всего ⁶⁾ в 200xg течение 5 минут.
7. Промойте клетки в два раза по 20 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS).
8. Подготовка экспериментального труб: (см. таблицу в пользовательских бюллетень ZFN технические)
9. Удалите 6-и пластины, содержащей средства массовой информации, начиная с шага (6.5) из инкубатора.
10. Ресуспендируйте клеток в 400 мкл (100 мкл / реакция) Nucleofection решение В.
11. Одной из реакций на время, добавьте 100 мкл клеток в каждой ДНК или РНК-содержащих трубки. Transfэ смесь до 2 мм электропорации кюветы и nucleofect на Nucleofector с соответствующей программой.
12. Сразу же после nucleofection каждого образца, использовать передачу пипетки добавить ~ 500 мкл подогретую среду от 6-луночный планшет в действии (6.9) в кювете. Затем аккуратно переносить клетки из кювета на оставшиеся подогретую среду в 6-луночного планшета.
13. Завершить все реакции и вернуть 6-луночного планшета для CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° C.

5. Сбор геномной ДНК после доставки ZFNs

1. 6-луночного планшета - не собрать всех объединенных ячеек. Важно сохранить культуру, чтобы иметь клеток одного клона клеток после разведения Вы подтверждаете, что у вас есть Cel-1 пищеварения продукты. От одного до трех дней после nucleofection собирать клетки для подготовки хромосомной ДНК с использованием GenElute млекопитающих геномной ДНК Miniprep Kit.

6. Cel-1 Пробирной р>

1. ПЦР усилить геномной ДНК из ZFN трансфицированных образцы и положительные геномной ДНК контроля, предусмотренных в комплект, с помощью прилагаемого праймеров. ПЦР установлена ​​с соблюдением следующих условий: (см. таблицу в пользовательских бюллетень ZFN технический).
2. Для создания гетеродуплексов от homoduplexes ПЦР принимают по 10 мкл ПЦР-реакции от каждого ZFN рассматривать образец плюс контроль и использовать следующие программы Термоциклер:
   95 ° C, 10 минут
   95 ° C до 85 ° С, -2 ° C / сек
   85 ° C до 25 ° С, -0.1 ° C / сек
   4 ° C, на неопределенное время
3. Добавить 1 мкл усилителя и 1 мкл нуклеазы S (от Transgenomic Номер в каталоге 706025) для каждой реакции и инкубировать при 42 ° С в течение 20-40 минут.
4. Запустите пищеварения на 10% PAGE-КЭ геля с соответствующей маркеров, таких как DirectLoad WideRange ДНК Ladder (Номер в каталоге D7058) (см. результаты в пользовательских бюллетень ZFN технический).
5. Насе позитивный сигнал был обнаружен в ZFN обработанных популяций чел-я пробы, приступить к клональной выделение и характеристика.

7. Клональный Выделение и характеристика

1. Одноклеточный клон ZFN обработанных образцов стандартных методов, включая FACS и разбавления клонирования.
2. Позвольте клонов расширить достаточно, то разделить определенную долю клеток для геномной ДНК урожай, замораживание назад остальное, как в банке материалов.
3. Усиление геномной ДНК из клонов использованием Cel-я грунтовки и анализа ампликонов на Cel-я анализа (с учетом и без WT ДНК шипами в), или же использовать этот ампликона перейти непосредственно к генотипирования.
4. Клоны Генотип кандидата определены как раз редактировалось аллелей по предпочтительным методом.

8. Представитель Результаты

Например всего CompoZr ZFN рабочего процесса представлены на рисунке 2. ZFNs поставляютсяв клетках, где они связываются и прилепится соответствующие последовательности ДНК, которая создает двухцепочечной брейк (DSB). Естественный процесс ремонта, негомологичными конца соединения (NHEJ), ремонт DSB. В некоторых случаях аномальным результатам в NHEJ удаления, вставки или замены нуклеотидов. ПЦР-амплификации собраны результаты геномной ДНК в формировании гетеродуплексной между дикого типа и изменение ампликонов после денатурации / отжига реакции ПЦР. Добавление Cel-1 фермента приводит к расщеплению любой гетеродуплексной молекул. Cel-1 результатов решаются PAGE анализ, чтобы подтвердить ZFN расщепления. На рисунке 3 представлен схематический Cel-1 и анализ ожидаемых результатов.

Представитель Cel-1 результатов, содержащихся в рисунках 4 и 5 Рисунок 4 содержит результаты очень активная пара ZFNs (21%) в клетках К562;. На рисунке 5 представлены результаты с менее активной пары (2,4%) в ZFNsК562. ZFN деятельности подтверждается и цифрами наличие двух фрагментов ПЦР ниже родительского фрагмента ПЦР.

Рисунок 1. Представление связанных нуклеазы пальцем цинка. ZFNs разработаны белки состоят из цинкового пальца ДНК-связывающим доменом слит с расщеплением области рестриктазы FokI. При привязке как гетеродимер, ZFNs создания двухцепочечной перерыв в указанной пользователем последовательности ДНК.

Рисунок 2. Схема пользовательского Workflow Service ZFN. Графическое представление рабочего процесса, чтобы создать генетически модифицированные клетки линии с помощью CompoZr ZFNs.

Рисунок 3. Схема Cel-1 и анализ результатов.) ZFN плазмиды о Г мРНК доставляется к клеткам. B) выразил ZFNs связывают и сократить целевой последовательности создания двухцепочечной перерыва (DSB) в части клеток. C) Aberrant ремонт некоторых ДР по негомологичными закончить присоединение приводит к нуклеотидные вставки или удаления. D) геномной ДНК собирают из трансфицированных пула клеток и усиливается в локусе интерес. EF) ПЦР-продукта является денатурированным и повторно отжигали создания гетеродуплексной формирование между дикого типа и изменение ампликонов. G) Cel-1 несоответствия эндонуклеазы результатов анализа в расщеплении гетеродуплексной молекул. H) Cel-1 фермент переваривает решаются PAGE. Наблюдаемое соотношение расщепления продуктов для парентерального группа, определяется ImageJ программного обеспечения, указывает на сокращение доли и эффективности ZFNs.

Рисунок 4. Cel-1 результатов с 21% активных ZFNs ImageJ программное обеспечение доступно.:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.

Рисунок 5. Cel-1 результатов с 2,4% активного ZFNs ImageJ программное обеспечение доступно по адресу:. http://rsbweb.nih.gov/ij/ .

Обсуждение

После ZFN модифицированные клетки выделяют у них постоянные и наследственные ДНК модификации. В результате способность генерировать устойчиво изменение клеточной линии или породы животных с заданными генетическими модификациями, чтобы провести исследования. CompoZr пользовательских ZFNs обеспечивают надежный метод для редактирования генома в самых различных типов клеток. Публикация генома успешного редактирования с ZFNs включает, но не ограничиваясь клеточных линий человека, мыши, крысы, данио, лягушку, свиней и модели СНО исследований. ^{3,4,5,6,7,8,9} возможность создания двухцепочечной перерыв в нужной целевой сайт в указанный тип клеток обеспечивается при ZFNs правильно доставлен в камеру. Кроме того, можно выполнять последовательные изменения пальцем цинка в камеру для того, чтобы иметь более одной генетической модификации в ячейке ^10. Возможность выбора определенной последовательности целей и изменить только данного локуса является основной причиной для возможности создания нескольких модификацийкатионов.

CompoZr пользовательских ZFN сертификат анализа генерируется очень реагенты в комплект таким образом гарантируя, что все компоненты набора были тщательно проверены для успеха клиента. Критические этапы рабочего процесса от начала до конца, представлены ниже:

Сотовые клонирования

Способность изолировать и расширение данной клеточной линии должны быть проверены перед началом любого ZFN экспериментов. Отдельные клетки должны быть изолированы и расширена, чтобы клонально производных населения возможно. Некоторые клетки линии непокорных в этом вопросе, и трюки, такие как обогащение редактировалось клонов, или культуры с условным СМИ могут помочь в преодолении этих проблем.

Доставка эффективность

Оптимизация доставки эффективности является обязательным до сдачи ZFNs. Многие методы могут быть использованы в том числе на основе липидов трансфекции, электропорации, и nucleofectiо. Идеальный метод доставки состоит из одного, что обеспечивает наиболее оптимальное сочетание эффективности доставки и выживаемости клеток. Количественного эти эффективность может быть оценена путем предоставления GFP контрольной плазмиды и количественного путем визуального осмотра или FACS 24-48 часов после родов.

Cel-I анализ

Крайне важно, чтобы Cel-I анализ проводится параллельно с соответствующим контролем, чтобы ПЦР, пищеварение и электрофорез параметров не будет вмешиваться в интерпретации эксперимента ZFN. Каждый комплект включает в себя контроль геномной ДНК, которые используются для создания Cel-I изображение в сертификате анализа. Усиление контроля с ДНК с праймерами при условии последующей Cel-I анализ позволит пользователям сравнить результаты, которые содержатся в сертификате анализа (COFA) изображение, и изолировать любую потенциальную неэффективность в этом плане эксперимента. Соответствующие отрицательного контроля, такие как макет, или GFP обработанной клеткиобразцы также должны быть включены, чтобы выяснение любого не конкретные продукты расщепления.

Качественный / Количественный анализ одно-клеточных клонов

После ZFN лечения и одного клонирования клетки, популяции клеток могут быть показаны для редактирования в локусе интерес целый ряд методов. Cel-я анализ может быть проведен на геномной ДНК из клонов с целью выявления кандидатов клоны для дальнейшего генотипирования. Важно, чтобы шип WT ПЦР ампликона в образец ампликонов в соотношении 1:1 перед выполнением Cel-я переварить как гомозиготных мутантных клонов будет содержать однородные молекулы, и, следовательно, передать отрицательное Cel-я анализа результатов. Альтернативный метод для скрининга этих кандидатов клонов проектировать одну ПЦР праймер посадку прямо на сайте целевой ZFN. Используется в сочетании с одной из управляющих грунтовки, отрицательный результат теста указывает потеря WT последовательности. Гетерозиготных клон, содержащий хотя бы одну WT аллели у,ield ПЦР сигнал, но могут быть полностью отделены от WT клонов выполнения ПЦР в контексте SYBR КПЦР.

Как только кандидат клонов были определены эти методы, они могут быть генотипировали стандартными пиросеквенирования, глубокое секвенирование, или другие методы секвенирования. Для всех методов секвенирования, ампликона создан из клональной геномной ДНК должны быть получены. Для традиционных аллелей пиросеквенирования могут быть отделены от TA-клонирования продуктов ПЦР и секвенирования отдельных колоний. Для таких методов, как глубоко последовательности этот шаг не является необходимым.

Гомология Режиссер Ремонт (HDR)

Этот протокол обеспечивает метод ZFN опосредованное нокаут гена через NHEJ. Интеграция трансгенов может быть проведено путем введения доноров плазмиды с оружием, что гомологии фланге сайт ZFN разреза. ¹¹ В этом сценарии, созданные ZFN двухцепочечной разрыв ремонт HDR вместо NHEJ. HDR направленных яntegration трансгенов может быть подтверждена с помощью подобных методов к процедурам, предусмотренным в настоящем протоколе.

Поиск и устранение неисправностей

Доставка ZFNs

Доставка ZFN и выражения доставки можно управлять для поставкой GFP или другие подобные плазмиды для визуализации и / или количественный. Низкий выражение в связи с несовместимостью с промоутером типа клеток интерес может быть преодолена путем доставки ZFNs в мРНК формате. Кроме того, методом холодного шока могут быть использованы для дальнейшего повышения эффективности ZFNs в клетках. ¹² Если мРНК используется крайне важно, чтобы клетки промывают до родов, чтобы обеспечить все сыворотки производных РНКазы были удалены. Разумно также таять мРНК на льду, и добавить его к клеткам в самый последний момент, чтобы свести к минимуму любую возможность для деградации.

Cel-I анализ

Основой Cel-я ассау есть конкретные и достаточно усиления локус интерес. Если не конкретные продукты усиление наблюдается использовать стандартные ПЦР устранения неисправностей увеличения специфичности, таких как оптимизация количества шаблонов, грунтовки концентрации, и езда на велосипеде параметров. Выполните PAGE анализ в отличие от стандартных электрофореза в агарозном как последний метод не обеспечивает адекватного разрешения и чувствительности. Cel-я дайджест условия могут быть оптимизированы, если не переваривается продукт или чрезмерное размытие не наблюдается. Титрование суммы Cel-1 нуклеазы и / или длина пищеварения время можно титровать, чтобы улучшить эти аспекты.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Нуклеазы S (Cel-1 ферментов)	Transgenomic	706025
Развернуть High Fidelity PCR System	Roche	03 300 242 001
Сотовые линии Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003
GenElute HP эндотоксина-Free Плазмиды Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400