Изображениями феромонов зондирования в мышь вомероназального острого Подготовка фрагментов тканей

Краткое содержание

У мышей способность обнаруживать феромоны в основном при посредничестве вомероназального орган (ВНО). Здесь, острый срез подготовки ткани для проведения ВНО кальция изображений описан. Эта физиологическая подход позволяет наблюдений субпопуляций и / или отдельных нейронов в живой ткани и удобен для рецептор-лиганд идентификации.

Аннотация

Питер Карлсон и Мартин Люшер впервые использовали термин феромон в 1959 году¹ для описания химических веществ, используемых для внутривидовой коммуникации. Феромоны представляют собой летучие или нелетучие короткоживущие молекулы², секретируемые и/или содержащиеся в биологических жидкостях^3,4, таких как моча, которая известна как основной источник феромонов³. Феромонная коммуникация задействована в различных ключевых аспектах поведения животных, таких как взаимодействие между родственниками^5,6, иерархическая организация³ и половые взаимодействия^7,8, и, следовательно, напрямую коррелирует с выживанием данного вида^9,10,11. У мышей способность обнаруживать феромоны опосредована главным образом вомероназальным органом (VNO)^10,12 — парной структурой, расположенной у основания носовой полости и заключенной в хрящевую капсулу. Каждый VNO имеет трубчатую форму с просветом^13,14, обеспечивающим контакт с внешней химической средой. Сенсорный нейроэпителий состоит преимущественно из вомероназальных биполярных сенсорных нейронов (VSNs)¹⁵. Каждый VSN имеет один дендрит, выходящий в просвет и заканчивающийся крупным дендритным утолщением с множеством микроворсинок (до 100), участвующих в химическом детектировании¹⁶. Присутствуют многочисленные субпопуляции VSNs. Они различаются по экспрессируемым хеморецепторам и, следовательно, возможно, по распознаваемым лигандам^17,18. Два основных семейства вомероназальных рецепторов, V1Rs и V2Rs^19,20,21,22, состоят соответственно из 240²³ и 120²⁴ членов и экспрессируются в разных слоях нейроэпителия. В VSNs также экспрессируются обонятельные рецепторы (ORs)²⁵ и рецепторы формилпептидов (FPRs)^26,27.

Остается неизвестным, используют ли эти нейронные субпопуляции один и тот же нижележащий сигнальный путь для восприятия феромонов. Несмотря на ведущую роль кальций-проницаемого канала (TRPC2), присутствующего в микроворсинках зрелых нейронов²⁸, были предложены TRPC2-независимые каналы трансдукции^6,29. Из-за большого количества нейронных субпопуляций и своеобразной морфологии органа фармакологические и физиологические исследования сигнальных элементов, присутствующих в VNO, представляют собой сложную задачу.

В данной работе мы представляем метод приготовления острых срезов ткани VNO мыши для проведения исследований методом кальциевого имиджинга. Этот физиологический подход позволяет наблюдать в естественной среде живой ткани общие или отдельные субпопуляции VSN, предварительно нагруженные кальциевым красителем Fura-2AM. Данный метод также удобен для изучения любого феромонного рецептора, меченного GFP, и может быть адаптирован для использования других флуоресцентных кальциевых зондов. В качестве примера мы используем линию мышей VG³⁰, в которой трансляция рецептора феромона V1rb2 связана с экспрессией GFP с помощью полицистронной стратегии.

Протокол

1. Препарирование мышей ВНО

1. Использование взрослых мышей. Как феромона зондирования замешана в multimodalities, тщательное различие между штаммами, генотипы, пола и возраста имеет важное значение и будет влиять на ваши результаты. Здесь, мы решили взрослых мышей В. ³⁰ ранее использовались для идентификации феромон-рецепторов паре (2-heptanone-V1rb2) ³¹ (рис. 1А).
2. Перед началом вскрытия, подготовки свежей холодной искусственной спинномозговой жидкости (ACSF; NaCl 118 мм, NaHCO ₃ 25 мм, D-глюкозы 10 мМ KCl 2 мМ, MgCl _{2 2} мМ NaH ₂ PO ₄ 1,2 мМ CaCl _{2 2} мМ, рН 7,4), насыщенный oxycarbon (95% O _2: 5% CO _2). Для этого смешайте все компоненты, за исключением ACSF CaCl _2. Пропитайте решения, непосредственно восходящей его oxycarbon. В конце добавить CaCl ₂ и отрегулировать с DDH ₂ 0 до желаемого объема. Хранить раствор ACSF на льду, пока укак таковой.
3. Эвтаназия в мышь должна быть преимущественно сделано шейки дислокации или CO ₂ ингаляции перед экспериментом.
4. Вырезать мышь головы. Поместите его под микроскопом рассекает в холодной ACSF непрерывно oxycarbonated.
5. Отрежьте нижнюю челюсть и положение головы для того, чтобы визуализировать неба (рис. 1б).
6. Сделайте разрез горизонтально в верхней части неба (рис. 1б) с микро-ножницы и удалить неба мембраны с микро рассекает щипцами. Гидратов и чистой подвергается полости с ACSF (рис. 1в).
7. Отрежьте верхнюю и нижнюю часть носовой перегородки (рис. 1в). Деликатно экстракт носовой перегородки содержащие ВНО и поместить его прямо в ACSF на льду (рис. 1D).
8. Отдельные вертикально две части ВНО с использованием микро рассекает пинцетом и аккуратно удалить хрящевую капсулу ВНО (Рис. 1E). Убедитесь, что все хрящевые части удаляются.

2. ВНО ткани срез подготовки

Ломтик ВНО подготовки ткани, описанные в данном разделе 2) предназначен в основном для исследования кальция изображений. ВНО ломтиками также может быть использован для immunohistostainings на плавучих ломтиками для проверки структурной целостности тканей (см. раздел 3) из протокола).

1. Подготовка легкоплавких агар (3% в стандартных PBS) и рабочее место. Вам нужно будет ACSF, микротома и поддерживает, микро рассекает щипцы, вложение формы (22 х 22 х 20 мм), точность салфетки, щетки, тарелки культуре тканей, cyanacrylat клей, льда и термометр.
2. Заполните форму вложения с 3% легкоплавких агара. Убедитесь, что температура не выше 41 ° C до размещения вертикально вскоре уничтожены ВНО (рис. 2), чтобы иметь возможность получить корональных ломтиками.
3. Место вложение плесень на льдув течение 1 мин до затвердевания, а затем отделить его от агара блока. Вырезать агар блока в пирамидальную форму и разместить его с клеем на микротома поддержки (рис. 2В).
4. Вырезать корональных ломтиками ВНО с микротома, со скоростью 0,5 мм / с, амплитуда 0,7 мм и толщиной 100 мкм в холодной ACSF и собирать срезах тканей с кистью перед помещением их в пластину культуре ткани заполнены холодной ACSF.
5. Если ваш ломтики содержать эндогенные флуоресценции, как GFP (в ген-целевых нейронов) вы можете выбрать их под люминесцентными стереомикроскопа (рис. 2).

3. Immunohistochemistry на ВНО плавающие ломтики

Целью этой процедуры является проверка целостности ткани ВНО ломтиками, полученные в разделе 2). Ацетилированный-тубулина является микротрубочек / цитоскелета маркер выражается в дендритов и микроворсинки ВНО сенсорных нейронов. Для экспериментов кальция изображений, перейдите направленииTLY раздел 4) протокола. Immunohistostaining метод плавающей ломтиками ВНО может быть адаптирована к оценке выражения какого-либо белка, представляющих интерес. Для этого, мы рекомендуем вам исправить ВНО в течение 1 ч при температуре 4 ° С в фиксирующий раствор (4% параформальдегида в PBS, рН 7,6) после точки 1,7) протокола и использовать с этой точки PBS при рН 7,6, а не ACSF решение.

1. В пластине культуре ткани, исправить ваши ломтики интерес к фиксирующий раствор (4% параформальдегида в PBS, рН 7,6) 1 час при температуре 4 ° C.
2. Блок ваши срезы тканей ночи при 4 ° С в растворе PBS, содержащего NGS (обычный козел сыворотки) 10% и тритона Х-100 на уровне 0,5%.
3. Инкубируйте ломтики с первичными антителами (анти-ацетилированного-тубулина, Мышь, 1:2000) для 16h при комнатной температуре (RT) в растворе PBS, содержащего NGS 5% и Тритон Х-100 на 0,25%.
4. Промыть 3 раза в течение 5 минут с раствором PBS, содержащего NGS 2%.
5. Инкубировать в темноте с SECOndary антител (Cy5-сопряженных антимышиного, 1:200) в растворе PBS, содержащего NGS 2% в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. Промыть 3 раза в течение 5 минут с PBS содержащие NGS 2%, PBS NGS 1% и только PBS.
7. Смонтируйте ломтики в флуоресцентные монтажа СМИ (содержащие или не DAPI), поместив их в центре гидрофобные зоны запятыми (использование гидрофобных ручкой) и сопроводительное ломтики покровные.
8. Провести наблюдения и поглощений с конфокальной микроскопии и программного обеспечения, позволяющего 3D реконструкции (рис. 2D-F).

4. Кальций изображения на кусочки ВНО

1. Следующие процедуры будут проходить в темное время суток. Инкубируйте ВНО ломтики в течение 1 ч при температуре 37 ° С в загрузке раствор, состоящий из холодных ACSF с Фура-2 утра (7 мкМ; маточного раствора 1 мМ в ДМСО) и плуроник 0,1% (м / о; маточного раствора на 20% в DDH ₂ O).
2. Держите загружены ломтики на льду с oxycarbonation до использования. Загружено ломтиками может храниться в течение3-4h.
3. Место загружены ломтики с кистью в перфузионной камере, содержащей ACSF и поддерживать ломтики с якоря ткани срез (рис. 3А).
4. Место перфузии камеры на стадии микроскоп кальция томография (рис. 3В) и постоянно обрызгивать с oxycarbonated ACSF при комнатной температуре. Температура может быть адаптирована с использованием регулятора температуры биполярного.
5. Наблюдения загружены ломтиками ВНО (рис. 3C-E) выполняются с перевернутой флуоресцентного микроскопа, с 25x или 63x объективных и CooL SNAP-HQ камеры. Освещение осуществляется последовательно (340/380 нм) с инструментом полихроматор и записаны со скоростью 5 Гц. Фильтрованный выбросов осуществляется при 510 нм. Внутриклеточного кальция соотношение изменяется (ΔF = 340 nm/380 нм) контролируются с соответствующим программным обеспечением.
6. Chemostimulation должны быть выбраны в соответствии с вашими экспериментальных целях. Здесь перфузии из ACSF содержащие феромоны мIX (изобутиламина, 2-heptanone, 4-heptanone, 2-гептанола, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 ^-6 М), 2-heptanone (10 ^-6 М) или только что собранных мужские и женские (1: 1) мышь мочи (1:100) выполняются ^32. Перфузии АТФ (125 мкМ) используется как жизнеспособность тест в конце эксперимента (рис. 3F) и указать, доля около 80% жизнеспособных нейронов. В этих условиях, кусочки можно использовать до 2-х часов.
7. GFP с метками субпопуляций сенсорные нейроны визуализируются конкретными освещения (здесь V1rb2 выражения нейронов) и может быть проанализирована точно (рис. 3G-I).

5. Представитель Результаты:

Для создания функционального анализа для исследования несколько путей трансдукции, происходящие в ВНО мыши, или для выявления новых феромон-рецепторов пар, мы воспользуемся В. Г. мыши линии (рис. 1А (рис. 1E), мы готовим острые ломтики ВНО (рис. 2). Зафиксируем часть из них, с тем чтобы проверить и подтвердить тканевой целостности подготовки, выполняя immunohistostainings против ацетилированного-тубулина белка (рис. 2D-F). Другая часть из ломтиков используется для экспериментов кальция изображений. Для этого ломтики загружаются с Фура-2 утра (рис. 3C-E) и внутриклеточного уровня кальция каждого нейрона контролируется как отношение ΔF (рис. 3F). Жизнеспособность нейронов оценивается перфузии АТФ (125 мкМ), после чего быстрое и кратковременное повышение отношения ΔF ожидается (рис. 3F). Моча будучи основным источником феромонов, перфузии свежейЛи собрал мыши мочи (1:100) используется в качестве эндогенного контроля. Это вызывает кальция переходных процессов в примерно 50% от записанного нейронов (ячейка 1 и 2, рис. 3F). Под GFP освещения, V1Rb2 положительные нейронов наблюдаются и перфузии ее известных феромонов лиганд, 2-heptanone, инициирует активации клеток (ячейка 1, рис. 3I). Интересно, что нейронные активаций также наблюдается в доле нейронов, которые не выражают V1Rb2 рецепторов (GFP отрицательный нейроны) (ячейка 2, рис. 3I), демонстрируя сложность кодирования феромонов в ВНО.

Рисунок 1. Препарирование орган мыши вомероназального. (A) мышь от линии VG. (B) После эвтаназии мыши, полный голова находится под бинокулярным микроскопом и нижней челюсти удаляется для того, чтобы визуализировать неба. Небольшой горизонтальный разрез делается(Черная пунктирная линия). (C) После удаления неба, носовой перегородки выстланы ВНО разрезается в верхней и нижней части (белый пунктир) для облегчения ВНО добычи. (D) ВНО находится в растворе ACSF и отделены (вставить: высшая сила зрения двух частей). (E) хрящевая капсула ВНО является деликатно удаляют и ВНО без хрящевой капсулы используется для остальной части экспериментов. Шкала бары: BE, 1 мм.

Рисунок 2. Мышь вомероназального острых подготовки нарезать и тканевой целостности. (А) ВНО мыши вертикально встроенных в агар 3% раствора. Температура агара должна быть ниже 41 ° C. (B) агар блок режут на пирамидальную форму и 100 мкм ВНО разделах (черный пунктир) генерируются в ACSF. (C) ВНО ломтиками может быть выбран под флуоресцентным стереомикроскопа для визуализации конкретныхНаселение меченых сенсорных нейронов. (DF) тканевой целостности можно оценить по immunohistostainings против ацетилированного-тубулина белка, увеличению мощности зрения V1rb2 гена ориентированных нейроны демонстрируют идеальное сохранение подготовки. Нейроны с длинными дендритов, достигающего поверхности просвета (E), а также выражение структурного белка в дендритные ручки и микроворсинок можно наблюдать (F). Шкала бары: В, 5 мм; С, 60 мкм, D, 40 мкм, EF, 20 мкм.

Рисунок 3. Изображений Кальций и феромонов обнаружения в вомероназального острые ломтики тканей. () После Фура-2 утра загрузочной фазы, ВНО ломтиков помещают в перфузионной камере и поддерживаются с адаптированной якорь (высокий зрения власти). (Б) Эксперименты проводятся в темное и ВНО ломтиками постоянно озарен ACSF при комнатной температуре с вакуумной системой. Температура может быть Chosан с помощью системы регулятор температуры составленный элемент Пельтье и биполярного тепловой датчик. Данный эксперимент проводился при комнатной температуре. (CE), ВНО ломтики наблюдаемых под Хоффман фазового контраста (С, Hv) или 380 нм Фура освещения перед (D) и во время активации нейронов (E, здесь с АТФ). (F) нейронов жизнеспособность оценивается с перфузии АТФ (125 мкМ). Здесь chemostimulation осуществляется с мочой (моча, 1:100) или смесью мыши феромоны (смесь тел., 10 ^-6 М) с постоянной скоростью потока 165 мл / ч. Внутриклеточного уровня кальция (ΔF) могут быть записаны отдельно для каждой ячейки (Cell с 1 по 3). (G) нейрона V1Rb2 визуализируется при освещении GFP (1). (H) загрузку этого нейрона (1), а также не-V1rb2 выражения нейрона (2), показано на рисунке. (I) нейрона V1rb2 в состоянии ответить на 2-heptanone с увеличением внутриклеточного кальция. Это особенно не-V1rb2 выражения нейрон реагирует также на 2-heptanone (клетка 2). Шкала бары: CE, 20 мкм; GH,15 мкм; ΔF = 340 нм / 380 нм. (F и I) Продолжительность стимулом приложения указывается баров под каждым следа. Произвольном масштабе цвет соответствует интенсивности флуоресценции.

Обсуждение

Метод визуализации кальция, представленные здесь позволяет записывать, в остром подготовки ломтик, феромонов ответы нейронов мыши ВНО. При таком подходе, рассечение от животного к вомероназального нейронов, с некоторой практикой, легко достижимо и дает долгоживущих подготовки ткани. Он позволяет много времени эксперименты, как фармакологические исследования или изучения феромонов кодирования. При этом физиологические техники, большой численностью населения, а также точный нейронных субпопуляций могут быть проанализированы в частности. Кроме того, этот метод может быть легко адаптирована к иммуногистохимического подходы или экспериментов, основанных на других красителей кальция. Использование этих комбинированных методик, безусловно, позволяют выявлению новых феромонов лигандами для многих хеморецепторы сирот выражается в орган мыши вомероназального.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Аденозин-5'-трифосфат динатрия солевой раствор (АТФ)	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO
Агар	Sigma-Aldrich	A7002-100G	Предпочтительно для иммуногистохимии
Агар (легкоплавкие)	Sigma-Aldrich	A0701-25G	Предпочтительно для кальция изображений
CL-100 Биполярный регулятора температуры	Warner инструменты	W64-0352
Конфокальной микроскопии	Leica Microsystems	SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure антимышиного IgG	Джексон ImmunoResearch	115-175-071	В защищенном от света
ДМСО (диметилсульфоксид)	Merck	317 275-100мл
Вложение пресс-форм, Пил-A-Way	Polysciences	18646A-1	22 х 22 х 20 мм
Флуоресцентные монтажа СМИ (Vectashield с DAPI, 10 мл)	Rectolab	H-1200
Фура-2 утра	Teflabs	0103	В защищенном от света
Glisseal N (вакуумной смазки, 60 г)	Борер Chemie	Glisseal N
Большая камера Запись ванны (RC-26G)	Warner инструменты	64-0235
MetaFluor (программное обеспечение для визуализации кальция; v.7.6.5.0)	Visitron системы
Моноклональные Анти-тубулина, acetylateг мышиного антитела	Sigma-Aldrich	T6793-.2ML
Нормальный козел сыворотки (NGS, 10 мл)	Interchim	UP379030
Платформа для камер (P-1)	Warner инструменты	64-0277
Pluronic F-127, 2 г	Invitrogen	P-6867
Roti Колл (дозирования бутылку, 10 г)	Карл Рот	0258,1
SC-20 Dual In-линия Решение обогреватель / охладитель	Warner инструменты	W64-0353
Фрагмент якорь (SHD-26GKIT)	Warner инструменты	64-0266
Stereofluorescence микроскопом	Leica Microsystems	MZ16FA
Супер PAP PEN (гидрофобныеручкой)	Pelco Международного	22309
Тритон Х-100	Fluka	93 420-250мл
Вибрационный лезвие микротома VT 1200S	Leica Microsystems	14048142066
VisiChrome системы высокой скорости полихроматор	Visitron системы
3D Визуализация данных (Imaris; v.6.3.1)	Bitplane Научно Software