Методическая статья

Колоректального рака на поверхности клеток белков профилировки с Microarray антитела и флуоресценции мультиплексирования

13.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3322

⸱

25 сентября 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Molecular Bioscience, University of Sydney, 2Department of Surgery, Royal Prince Alfred Hospital, 3Department of Anatomical Pathology, Department of Anatomical Pathology, 4Department of Medicine, Concord Repatriation General Hospital

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Мы описали процедуру разбивки колоректального рака (КРР) для получения жизнеспособных отдельных клеток, которые затем захвачен на индивидуальные микрочипов антител признании поверхностных антигенов (DotScan CRC микрочипов). Суб-популяции клеток, связанных с микрочипов можно профилировать по флуоресценции мультиплексирования с использованием моноклональных антител помеченные флуоресцентными красителями.

Аннотация

Современный прогноз и классификация колоректального рака (КРР) основываются на системах стадирования, которые объединяют гистопатологические и клинические данные. Однако в большинстве случаев КРР дисфункция клеток является результатом многочисленных мутаций, которые изменяют экспрессию белков и посттрансляционную модификацию1.

Ряд антигенов клеточной поверхности, включая антигены кластеров дифференцировки (CD), были определены в качестве потенциальных прогностических или метастатических биомаркеров при колоректальном раке (КРР). Эти антигены являются идеальными биомаркерами, так как их экспрессия часто изменяется по мере прогрессирования опухоли или при взаимодействии с другими типами клеток, такими как опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TILs) и опухолеассоциированные макрофаги (TAMs).

Использование иммуногистохимии (ИГХ) для подклассификации и прогнозирования рака хорошо обосновано для некоторых типов опухолей2,3. Однако ни один отдельный «маркер» не продемонстрировал прогностической значимости, превышающей клинико-патологическое стадирование, и не получил широкого признания для использования в рутинных патологоанатомических отчетах по всем случаям колоректального рака (КРР).

Более современный подход к прогностической стратификации фенотипов заболевания основан на анализе профилей поверхностных белков с использованием нескольких «маркеров». Хотя профилирование экспрессии опухолей с помощью протеомных методов, таких как iTRAQ, является мощным инструментом для поиска биомаркеров4, оно не оптимально для повседневного использования в диагностических лабораториях и не позволяет различать разные типы клеток в смешанной популяции. Кроме того, данные методы требуют большого количества опухолевой ткани для профилирования очищенных гликопротеинов плазматической мембраны.

В данном видео мы описали простой метод профилирования поверхностного протеома жизнеспособных клеток из диссоциированных образцов колоректального рака (CRC) с использованием антительного микрочипа DotScan CRC. Микрочип со 122 антителами состоит из стандартной области из 82 антител, распознающих ряд специфических для клеточных линий лейкоцитарных маркеров, адгезивных молекул, рецепторов, а также маркеров воспаления и иммунного ответа5, вместе с сателлитной областью для детекции 40 потенциальных прогностических маркеров CRC. Клетки захватываются только теми антителами, для которых они экспрессируют соответствующий антиген. Плотность клеток на каждое пятно, определяемая путем оптического сканирования, отражает долю клеток, экспрессирующих данный антиген, уровень экспрессии антигена и аффинность антитела6.

Для тканей колоректального рака (КРР) или нормальной слизистой оболочки кишечника оптическое сканирование отражает иммунофенотип смешанных популяций клеток. Затем можно использовать флуоресцентное мультиплексирование для профилирования выбранных субпопуляций интересующих клеток, захваченных на матрице. Например, Alexa 647-антитела к молекуле адгезии эпителиальных клеток (EpCAM; CD326) — панэпителиальному антигену дифференцировки — использовались для обнаружения клеток КРР, а также эпителиальных клеток нормальной слизистой оболочки кишечника, в то время как фикоэритрин-антитела к CD3 использовались для обнаружения инфильтрирующих T-клеток7. Микрочип DotScan CRC должен стать прототипом диагностической альтернативы системе стадирования КРР, основанной на анатомических признаках.

Протокол

Рисунок 1
Рисунок 1. Набор операций для приготовления суспензии живых клеток от хирургического образца о правах ребенка.

1. Клинический пример разбивки

Все образцы были собраны из Королевской больницы Принца Альфреда (Camperdown, Новый Южный Уэльс, Австралия) и Согласия Репатриация больница (Конкорд Запад, Новый Южный Уэльс, Австралия) с информированного согласия соответствии с Протоколом № X08-164.

  1. Сбор свежих колоректального рака (КРР) или аденома образцов, а нормальная слизистая оболочка кишечника не менее 10 см от опухоли. Магазин образцов в сбалансированный солевой раствор Хэнка рН 7,3 (HBSS) при 4 ° С в течение 12 ч после резекции.
  2. Следуйте правилам безопасности для человека микроорганизмов, процесс всех клинических образцов в кабинете биологической безопасности класса II. Рассеките образцов в 2 мм кубов в чашке Петри с помощью двух скальпель лезвий.
  3. Инкубируйте опухоли и нормальной ткани в отдельных труб Эппендорф с редкими нежными смешивания в течение 60 мин при 37 ° С с равным объемом RPMI 1640, содержащей 2% (объем / объем) коллагеназы типа 4 (Уортингтон, Лейквуд, штат Нью-Джерси, США) и 0,1 % (м / о) дезоксирибонуклеазы я из бычьего pancrease (ДНКазы I; Sigma-Aldrich).
  4. Группа полу-переваренной ткани через сито с мелкими отверстиями проволоки использованием плунжера из 10 мл шприца; мыть клетки через с HBSS.
  5. Pass результате клеточной суспензии через 200 мкм и 50 мкм фильтры Filcon (BD Biosciences) для удаления клеточных агрегатов. Большинство ДНК, слизи и клеточных агрегатов удаляются в этой серии фильтрации.
  6. Центрифуга клеточные суспензии, при 400 мкг при 20 ° в течение 5 мин.
  7. Ресуспендируют гранулы ячейку в тепло инактивированной ФТС, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), замораживание медленно криопробирки и хранить при температуре -80 °. Замораживание процесса ведет к снижению слизи в образце и лизирует эритроциты.

2. Подготовка образцов для сотовых захвата

  1. Оттепель из образцов быстро в 37 ° водяной бане и ресуспендирования клеток в 10 мл HBSS промыть ДМСО.
  2. Центрифуга клеточные суспензии, при 410 мкг при 20 ° в течение 5 мин.
  3. Декантируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл HBSS.
  4. Лечить образца с 0,1% (м / о) ДНКазы я в течение 20 мин при комнатной температуре.
  5. Смешать по 10 мкл каждой клеточной суспензии с равным объемом трипанового синий и нагрузка 10 мкл смеси в гемоцитометра. Использование светового микроскопа при 100-кратным увеличением, граф жизнеспособных клеток, которые появляются в связи с ясно трипанового синего исключения, в то время как мертвые клетки занимают красителя. Не менее 4-х 10 6 жизнеспособных клеток требуется для сотовых захвата на микрочипов.
  6. После лечения ДНКазы, ресуспендируют клеточной суспензии в 10 мл HBSS и центрифуге при 410 мкг при 20 ° в течение 5 мин.
  7. Декантируйте супернатанты и ресуспендируйте гранулы ячейку в RPMI 1640 до конечного объема 200 мкл.

3. Антитела микрочипов ячейке захвата

  1. Смочите DotScan микрочипов антител путем погружения нитроцеллюлозы в разделе фосфатным буферным раствором (PBS) в течение примерно 20 секунд Аккуратно протрите стекла края микрочипов со сложенными Kimwipes, избегая касания нитроцеллюлозы разделе.
  2. Добавьте воду в лоток инкубации микрочипов обеспечить влажной камере. Место микрочипов в камеру и пипетки суспензии клеток в RPMI 1640 на влажном разделе нитроцеллюлозы. Внесите капель на каждом углу нитроцеллюлозы для обеспечения равномерного распределения клеток.
  3. Инкубируйте микрочипов при 37 ° С в течение 1 ч. Инкубационный позволяет клеткам для проведения расчетов и вступают в контакт с антителами на микрочипов. Клетки, экспрессирующие поверхностные антигены соответствующих антител, они приземляются на будет в плен.
  4. После инкубации, окуните микрочипов мягко и по вертикали на три желоба содержащих не менее 15 мл PBS, чтобы смыть несвязанных клетки (20 с на мытье).
  5. Подготовка 3,7% (м / о) формальдегида в PBS исправить клетки и антитела путем сшивания. Аккуратно пипеткой примерно 1 мл на покрытие нитроцеллюлозы разделе микрочипов. Инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре.
  6. Следующее падение микрочипов на 3 изменений PBS (15 мл, 30 с каждого), чтобы смыть избыток формальдегида.
  7. Протрите края и задней стекло с Kimwipes и сканирования микрочипов использованием DotScan в то время как сканер, нитроцеллюлозы разделе влажная. Оптического сканирования дает картину экспрессии антигенов смешанной популяции клеток, например, клетки КПР, лейкоцитов и других стромальных клеток опухоли.

4. Флуоресценция мультиплексирования

  1. Удалить микрочипов от сканера и применять 200 мкл блокирующего буфера (2% вес / BSA, 2% тепла человеческого инактивированной сыворотки АВ, PBS, рН 7,3). Выдержите его в лоток микрочипов при комнатной температуре в течение 20 мин.
  2. Подготовка multipлексический раствора в пробирку Эппендорфа покрыта алюминиевой фольгой: 20 мкл фикоэритрин-анти-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, Новый Южный Уэльс, Австралия, # IM12824; 1/7.5 конечное разведение), 10 мкл Alexa Fluor 647-анти-EpCam (Biolegend, Сан - Диего, Калифорния, США; 1 / 15 разбавления), 2 мкл тепла инактивированной человеческой сыворотки АВ (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Австралия) и 118 мкл блокирующего буфера.
  3. Слить избыток блокирующий буфер из микрочипов и пипетки мультиплексирования раствор на нитроцеллюлозные разделе, распространяясь равномерно. Инкубируйте в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре.
  4. Dip микрочипов по вертикали на три желоба 15 мл свежего PBS; (30 с каждого).
  5. Пусть микрочипов сухой в темноте и хранить при 4 ° С в режиме слайд-коробки. Микрочипов может храниться в темноте в течение 3 месяцев без потери флуоресценции.
  6. Сканирование сухой микрочипов использованием Тайфун FLA-9000 сканер (GE Healthcare, Rydalmere, Новый Южный Уэльс, Австралия) с разрешением равным 50 (532 нм, 580 BP30 выбросов фильтр для PE. 633 лазерных нм и 670 BP30 выбросов фильтр для Alexa 647). Микрочипы будут отсканированы с нитроцеллюлозы стороной вниз на лоток стекло сканера.
  7. Сохранить флуоресцентные изображения в виде файлов TIFF и используя набор Photoshop изображение размером до 17 х 25 см и разрешением до 72 точек / см. Импорт изображений в DotScan программное обеспечение анализа для анализа интенсивности точек.
  8. DotReader захватывает цифровое изображение точки обязательным модель и количественная плотность клеточных обязательным для каждого антитела точка на 8 бит серости шкале (1-256 U). Иногда неспецифический изотипа контроль связывание вычитается из обязательного значения для антител с соответствующими изотипов иммуноглобулина. Dot интенсивности флуоресценции для каждого микрочипов были нормализованы против ярких точка установлена ​​на уровне 100% интенсивности. Сигнал / место силы было зафиксировано в. XML-файл (исходные данные) или представлены в виде гистограммы в. PDF-файл (окончательный)
  9. Microarray heatsmaps и иерархической кластеризации были проведены с использованием MultiExperiment Viewer (МэВ) версии 4.4 от ТМ4 Microarray Software Suite ( http://www.tm4.org/mev.html ). Иерархическая кластеризация проводили на фоне скорректированных данных с использованием МэВ с полным анализом связей. Евклидово расстояние было использовано для меры сходства. 2-хвостами Стьюдента-тест с равной дисперсии был использован для определения статистической значимости результатов.

5. Представитель Результаты:

Результаты микрочипов DotScan должен показать последовательное ячейки обязательным моделей между дублировать массивы. Сильное выравнивание точку привязки (CD44/CD29) позволяет сетке находиться над массивом района. На рисунке 2 показан пример оптимального захвата клеток и мультиплексирование. На рисунке 3 приведены некоторые общие проблемы, возникшие в ходе захвата клеток и возможные решения.

Клетка микрочипов обязательные результаты могут быть количественно путем измерения интенсивности точка, высказанные по серости шкале от 1 до 256. На рисунке 4 показаны цифровые данные с 58 хирургических образцов КПР, окрашивали EpCam-Alexa 647 антитела, как Тепловая карта с иерархической кластеризации. Хотя количество образцов ограничено, контрольных сумм из той же стадии, как правило, кластер в одной группе.

Рисунок 2
Рисунок 2. Сотовый обязательной структуре клинических колоректального рака опухоли (Австралийский Клинико-патологические Подмости, ACP этапе B1). () DotScan антител ключевым изображением расположения антитела для левой половины дублировать микрочипов (очерчен). Верхняя часть содержит оригинальные 82 антитела микрочипов лейкемии DotScan. Еще 40 антител, соответствующие конкретным антигенам поверхности оказались до регулируемых в литературе, были добавлены в качестве микрочипов "спутник" КПР. Нижняя секция состоит из изотипа антител управления (б) Оптическое изображение клетки КПР привязки к микрочипов. (С) CD3 флуоресценции изображение, показывающее Т-клеток. (Г) EpCam флуоресценции изображение, показывающее CRC клеток.

Рисунок 3
Рисунок 3. Примеры плохого DotScan результаты и возможные решения. () Низкая ячейки обязательными; Решение: убедитесь, что по крайней мере 4x106 жизнеспособных клеток находятся в массиве (б) Изотип контроль обязательных и необязательных определенной ячейке обязательными; решение: добавить тепла инактивированной человеческой сыворотки АВ образца до инкубации на микрочипов, чтобы минимизировать изотипа контроля обязательными. Иногда небольшое количество неспецифического связывания клеток к нитроцеллюлозы происходит с КПР образцов и не оказывает существенного влияния на результаты. (С) Нитроцеллюлоза высыхания во время инкубации; решение: обеспечить выборка охватывает целый раздел нитроцеллюлозы и микрочипов, инкубируют на плоской поверхности. (Г) высокий артефактов фона; решение: обеспечитьмикрочипов тщательно промывают после инкубации.

Рисунок 4
Рисунок 4. DotScan программного обеспечения для анализа порожденных гистограммы представляющие ячейку обязательным плотностей на серость шкале от 1 до 256. Цифры на оси ссылаются на CD антигенов. Другие сокращения TCR, Т-клеточного рецептора; κ, λ, легких цепей иммуноглобулинов; SIG, поверхностных иммуноглобулинов; DCC, удаленные в колоректального рака белка, EGFR, рецептор эпидермального фактора роста, ФАП, белок фибробластов активации; HLA-A, B, С HLA-DR, антигены лейкоцитов человека и DR, B, C соответственно; ММВА, MHC класса I цепь связанных белков, MMP-14, матрица metallopeptidase 14; PIGR, полимерные рецепторов иммуноглобулинов; TSP-1, тромбоспондин-1; Мабтера, гуманизированные анти-CD20. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом видео показано, как DotScan микрочипов антитела могут быть использованы в простых, полуколичественный способ изучения профилей поверхностного антигена для популяции клеток из ткани КПР.

Получение жизнеспособных суспензии отдельных клеток из ткани имеет решающее значение для успеха эксперимента, так как энергия-зависимые процессы (например, антиген укупорки и / или псевдоподии образования) представляется, необходимых для прочное связывание целых клеток в антитело точками во время инкуб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников Анатомические лаборатории патологии Королевский Принца Альфреда и Согласия Репатриация Больницы для сбора свежих образцов КПР и нормальной слизистой оболочки кишечника. Работа финансировалась института рака Нового Южного Уэльса Поступательное Программа грантов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагентов или оборудования Компания Номер в каталоге Комментарии
Сбалансированный солевой Хэнкса решение Sigma-Aldrich H6136-10X1L Буферизацией с 25 мМ Hepes (Sigma # H3375)
Airpure биологической безопасности II класса кабинет Westinghouse 1687-2340/612
Хирургические лезвия Ливингстон 090609 Упаковка из 100
RPMI 1640 с 2 мМ Hepes Sigma-Aldrich R4130-10X1L
Коллагеназы типа 4 Уортингтон 4188
Дезоксирибонуклеазы 1 Sigma-Aldrich DN25-1G
Terumo шприц (10 мл) Terumo SS +10 L Комплект из 100
Filcon фильтр (200 мкм) BD Biosciences 340615
Filcon фильтр (50 мкм) Filcon фильтр (50 мкм) Filcon фильтр (50 мкм) Filcon фильтр (50 мкм) 340603
Фетальной телячьей сыворотки Gibco / Invitrogen 10099-141
Центрифуга 5810 R Эппендорф 7017
Диметилсульфоксид Sigma-Aldrich D2650
Трипановый синий Sigma-Aldrich T8154
Hemocymeter Technocolor Neubar Hirschmann недоступный
Оптический микроскоп Nikon Nikon TMS
Cyrovial труб Greiner Bio-One 121278
Криогенная заморозка contrainer Nalgene 5100-0001
DotScan антител микрочипов комплект Medsaic недоступный
DotScan микрочипов мыть лоток Medsaic недоступный
KimWipes Kimberly-Clark 4103
Формальдегид 37% Sigma-Aldrich F1635-500ML
DotReaderTM Medsaic недоступный
Бычий сывороточный альбумин Sigma-Aldrich A9418-10G
Тепло-инактивированной сывороткой AB 2% Invitrogen 34005100
Фикоэритрин-сопряженных CD3 Beckman Coulter ET386
AlexaFluor647-сопряженных EpCam BioLegend 324212
Тайфун FLA-9000 GE Healthcare 28-9558-08 532 нм, 580 BP30 выбросов фильтр для PE. 633 лазерных нм и 670 BP30 выбросов фильтр для Alexa647
MultiExperiment просмотра v4.4 ТМ4 Microarray Software Suite Открыть - программное обеспечение (Ссылка 11)

Ссылки

  1. Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).
  2. Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979(2001).
  3. Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, Fourth, (2008).
  4. Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
  5. Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184(2006).
  6. Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147(2003).
  7. Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
  8. Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791(2006).
  9. Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A. Rheology of mucin. Methods Mol. Biol. 125, 99(2000).
  10. Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15(2002).
  11. Al Saeed,, et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Исправление


Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 7/03/2015. Citeable Link.

The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:

j.zhou@uws.edu.au

from:

jzho7551@mail.usyd.edu.au

Теги

CD

Похожие статьи