Визуализация Caenorhabditis Elegans Кутикулы структур с помощью липофильных Vital краска, DII

Summary

Мы представляем способ визуализировать кутикулы в прямом эфире С. Элеганс Использование красного флуоресцентного красителя липофильных DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат), который обычно используется в С. Элеганс, Чтобы визуализировать экологически подвергаются нейроны. С этой оптимизированный протокол, крылья и кольцевых кутикулярных структур окрашиваются по DII и наблюдать с помощью соединения микроскопии.

Abstract

Кутикула C. Элеганс имеет высокую устойчивость структуры, которая окружает внешности животного ^1-4. Кутикула не только защищает животное от окружающей среды, но и определяет форму тела и играет роль в подвижности ^4-6. Несколько слоев выделяемый клетками эпидермиса составляют кутикулы, в том числе внешний липидный слой ^7.

Окружная хребтов в кутикулу называется узор кольца длиной животных и присутствуют на всех этапах развития ^8. Крылья являются продольные гребни, которые присутствуют во время определенных стадий развития, в том числе L1, Dauer, и взрослых этапах ^2,9. Мутации в генах, которые влияют на кутикулярной организации коллаген может изменить кутикулярные структуры и морфологии тела животного ^5,6,10,11. Хотя кутикулярной визуализации с использованием соединения микроскопии с ДВС оптики возможно, нынешние методы, которые подчеркивают кутикулярные структуры включают флуоресценциипроцента экспрессии трансгена ^12, антитела окрашивания ¹³ и электронной микроскопии ^1. Маркированный агглютинин зародышей пшеницы (WGA) была также использована для визуализации кутикулярной гликопротеины, но ограничен в решении тонких кутикулярных структур ^14. Окрашивание кутикулярной поверхности с помощью флуоресцентного красителя наблюдается, но никогда не характеризуется подробно ^15. Мы представляем способ визуализировать кутикулы в живых C. Элеганс использованием красного флуоресцентного красителя липофильных DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат), который обычно используется в C. Элеганс визуализировать экологически подвергаются нейроны. Этот оптимизированный протокол для окрашивания DII это простой, надежный метод с высоким разрешением флуоресцентные визуализации кольца, крылья, вульвы, мужского хвост, и гермафродитом хвоста всплеск C. Элеганс.

Protocol

1. Подготовка DII пятно

1. Подготовка исходного раствора 20 мг / мл DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) в ДМФ. DII является светочувствительным, поэтому защитить DII от света, завернув в фольгу.
2. Создать рабочую разбавления DII путем добавления 0,6 мкл фондовом DII на 399,4 мкл M9 для каждой группы населения. Это должно дать окончательный рабочий разбавления 30 мкг / мл в DII M9. Это может быть расширены для окрашивания нескольких популяций одновременно. Щит DII от света, окружив трубу (ы) в фольге.

2. Подготовка нематоды

1. Используйте 60 мм пластины, содержащей населения незагрязненных нематод. Мыть животных и....

Discussion

Метод окрашивания DII, представленные здесь позволяет сравнительно быстрый и удобный способ визуализации кутикулы на C. Элеганс. По повторное использование и оптимизации методов, обычно используемых для изображения подвергаются экологически чувствительных нейронов ^15,17, DII может быть использован для флуоресцентной окраски как крылья и кольцевых структур (рис. 1 и 2), а также вульвы, мужского хвост и хвостовой шип гермафродитом (рис. 3). Мы обнаружили, что решение инкубации и времени влиять на спосо.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Реагенты	Синонимы	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
DII	1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлората	Biotium, Inc	60010	Сток разбавления: 20 мг / мл в ДМФА Рабочее разведение: 30 мг / мл
DMF	Диметилформамид	Sigma-Aldrich, Inc	D4551
Тритон X-100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	VWR International, LLC.	ЭМ-9410
M9	22 мм KH 2 PO 4, 42мм Na 2 HPO 4, 86 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4
NGM	Средний рост нематода	ИПМ Научные, Inc	11006-501	Может быть подготовлены следующие NGM агар протокол 18
Агар-агар		EMD Chemicals, Inc	1,01614	4% в воде
Левамизол	Левамизол гидрохлорид	Sigma-Aldrich, Inc	31742	100 мкМ - 1 мм левамизол по мере необходимости
Микроскоп слайды		VWR International, LLC.	16005-106
Стекла микроскопа крышкой		VWR International, LLC.	16004-302
Соединение рамки		Carl Zeiss, Inc	A1M	Используйте цели, чтобы соответствовать потребностям эксперимент
TRITC или других совместимых фильтров	 	Chroma технологий корпорации	49005	ET - DsRed (TRITC/Cy3) распыленных набор фильтров