$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Мембранные белки (МБ) играют важнейшую роль во многих физиологических процессах, таких как перенос специфических молекул через непроницаемый мембранный бислой, который окружает все клетки и органеллы. Нарушения в функционировании МБ приводят к возникновению многих заболеваний и расстройств у человека, поэтому детальное понимание их структуры остается критически важной задачей биологических исследований. Однако определение структуры МБ по-прежнему представляет собой серьезную проблему, зачастую обусловленную их гидрофобностью.
Мембранные белки (МБ) имеют обширные гидрофобные области, встроенные в бислой. Для сольватации этих белков из бислоя часто используют детергенты, в результате чего образуется мицелла «белок-детергент», которой затем можно манипулировать аналогично растворимым белкам. Традиционно попытки кристаллизации проводятся с использованием смеси белка с детергентом, однако такие образцы часто оказываются устойчивыми к кристаллизации или образуют кристаллы низкого качества. Эти проблемы обусловлены воздействием детергента.′неспособность адекватно имитировать бислой, что приводит к низкой стабильности и гетерогенности. Кроме того, детергент экранирует гидрофобную поверхность мембранного белка (МБ), уменьшая площадь поверхности, доступную для образования кристаллической упаковки. Чтобы обойти эти недостатки, МБ могут кристаллизовать в липидных средах, которые более точно имитируют их эндогенное окружение; в последнее время этот подход стал новым методом кристаллизации МБ.
Липидная кубическая фаза (ЛКФ) представляет собой трехмерный липидный бислой, пронизанный системой взаимосвязанных водных каналов1. Хотя наиболее часто используемым липидом является моноолеин, для создания ЛКФ также применялись родственные липиды, такие как монопальмитолеин и моновакцинин2. МП встраиваются в ЛКФ, где они диффундируют в трех измерениях и питают зародыши кристаллов. Большим преимуществом ЛКФ является то, что белок остается в среде, более близкой к нативной, однако метод имеет ряд технических недостатков, включая высокую вязкость (требующую специального оборудования) и сложности при визуализации и манипуляциях с кристаллами3,4. Из-за этих технических сложностей для кристаллизации мы использовали другую липидную среду — бицеллы5,6 (Рисунок 1). Бицеллы представляют собой смеси липидов и амфифилов, образующиеся при смешивании липида фосфатидилхолина (DMPC) с амфифилом (CHAPSO) или короткоцепочечным липидом (DHPC). Внутри каждого диска бицеллы молекулы липидов формируют бислой, в то время как молекулы амфифила выстраиваются вдоль неполярных краев, обеспечивая полезные свойства как бислоев, так и детергентов. Важно отметить, что ниже температуры перехода смеси белков с бицеллами обладают пониженной вязкостью и позволяют проводить манипуляции аналогично МП, сольбубилизированным детергентами, что делает бицеллы совместимыми с роботами для кристаллизации.
Бицеллы были успешно использованы для кристаллизации нескольких мембранных белков5,7-11 (Таблица 1)Эта растущая коллекция белков демонстрирует универсальность бицелл для кристаллизации мембранных белков как с альфа-спиральной, так и с бета-складчатой структурой из прокариотических и эукариотических источников. Благодаря этим успехам и простоте высокопроизводительного внедрения бицеллы должны стать частью инструментария каждого кристаллографа мембранных белков.′в арсенале. В этом видео мы описываем методику использования бицелл и приводим пошаговый протокол подготовки высокопроизводительных экспериментов по кристаллизации очищенных мембранных белков (МБ) с использованием стандартной робототехники.