Высокая пропускная способность кристаллизации мембранных белков, используя метод липидный Bicelle

Summary

Bicelles это липидные / амфифила смесей, которые поддерживают мембранных белков (депутатов) в пределах липидного бислоя, но имеют уникальное поведение фазы, что облегчает высокопроизводительного скрининга путем кристаллизации роботов. Эта методика успешно подготовила ряд с высоким разрешением структур с обеих прокариот и эукариот источников. Это видео описывает протоколы для создания липидной смеси bicelle, включая депутатов в смесь bicelle, создание кристаллизации испытаний (вручную, а также робота) и уборки кристаллов из среды.

Abstract

Мембранные белки (МП) играют важную роль во многих физиологических процессах, таких как перекачка специфических молекул через непроницаемый мембранный бислой, который окружает все клетки и органеллы. Изменения в функции МП приводят ко многим заболеваниям и расстройствам человека; Таким образом, глубокое понимание их структуры остается важнейшей целью биологических исследований. Тем не менее, определение структуры МП остается серьезной проблемой, часто связанной с их гидрофобностью.

МП имеют значительные гидрофобные области, встроенные в бислой. Детергенты часто используются для солюбилизации этих белков из бислоя, генерируя белково-детергентную мицеллу, которой затем можно манипулировать так же, как растворимыми белками. Традиционно испытания кристаллизации проводятся с использованием белково-детергентной смеси, но они часто сопротивляются кристаллизации или дают кристаллы низкого качества. Эти проблемы возникают из-за неспособности моющего средства адекватно имитировать бислой, что приводит к плохой стабильности и неоднородности. Кроме того, моющее средство экранирует гидрофобную поверхность МП, уменьшая площадь поверхности, доступную для контактов кристаллов. Чтобы обойти эти недостатки, МП могут быть кристаллизованы в липидной среде, которая более точно имитирует их эндогенную среду, и в последнее время стала методом de novo для кристаллизации МП.

Липидная кубическая фаза (ЛКП) представляет собой трехмерный липидный бислой, пронизанный взаимосвязанной системой водных каналов¹. Хотя моноолеин является липидом выбора, родственные липиды, такие как монопальмитолеин и моновачценин, также использовались для производства LCP². МР встраиваются в ЛКП, где они диффундируют в трех измерениях и питают кристаллические ядра. Большим преимуществом LCP является то, что белок остается в более естественной среде, но метод имеет ряд технических недостатков, включая высокую вязкость (требующую специализированных аппаратов) и трудности в визуализации кристаллов и манипуляциях с^ними. Из-за этих технических трудностей мы использовали другую липидную среду для кристаллизации — бицеллы^5,6 (рис. 1). Бицеллы представляют собой липидно-амфифильные смеси, образованные путем смешивания фосфатидилхолинового липида (DMPC) с амфифилом (CHAPSO) или короткоцепочечным липидом (DHPC). Внутри каждого бицеллярного диска молекулы липидов образуют бислой, в то время как молекулы амфифилов выстилают аполярные края, обеспечивая полезные свойства как бислоев, так и моющих средств. Важно отметить, что ниже температуры перехода белково-бицеллезные смеси имеют пониженную вязкость и обрабатываются таким же образом, как и моютерно-растворимые МП, что делает бицеллы совместимыми с кристаллизационными роботами.

Бицеллы были успешно использованы для кристаллизации нескольких мембранных белков^5,7-11 (Таблица 1). Эта растущая коллекция белков демонстрирует универсальность бицелл для кристаллизации как альфа-спиральных, так и бета-листовых МР из прокариотических и эукариотических источников. Благодаря этим успехам и простоте высокопроизводительной реализации, бицеллы должны быть частью арсенала каждого кристаллографа мембранных белков. В этом видео мы опишем методологию бицелла и приведем пошаговый протокол для организации высокопроизводительных испытаний кристаллизации очищенных МП с использованием стандартной робототехники.

Protocol

Bicelle основан кристаллизации состоит из четырех основных этапов (рис. 2): я) подготовка bicelle формирования липидного: амфифила смеси; II) включение очищенного белка в среду bicelle; III) кристаллизации испытаний (вручную или робота) и IV) визуализации, добычи кристаллов и замораживания. Эти шаги подробно описаны ниже

1. Подготовка Bicelles

Bicelles могут формироваться в различных липидов: амфифила комбинации и в широком диапазоне концентраций. Таким образом, первоначальный состав, основанную на предыдущих успешных условиях, рекомендуется (табл. 1). Самых успешных смесь ДМФХ: CHAPSO bicelle формулировка, которая может либо быть приобретены коммерчески как предварительно смешивают готовые к использованию формулировки (см. таблицу реагентов ниже) или подготовленные в лаборатории, как описано. Для этого упражнения мы будем готовить 1 мл 35% ДМФХ: CHAPSO смеси при молярном соотношении 2,8:1.

1. Bicelle процент может колебаться в пределах 10% -40% с ДМФХ: CHAPSO молярном соотношении от 2.6-3.0:1 (табл. 1).
2. Обратите внимание: чем выше концентрация bicelle труднее распустить липидного приводит к более высокой вязкости раствора. Тем не менее, сосредоточены формулировка bicelle может быть выгодным, когда концентрация белка низка.
3. Растворения липидной для получения гомогенного раствора требует значительных усилий, делая этот шаг, больше всего времени в методе bicelle. Цикл через следующие шаги, пока ДМФХ полностью смешанным:
   1. Теплая смесь до ~ 40 ° С с использованием водяной бане или инкубатора и вихрь в течение ~ 1 минуты.
      • Примечание: Чем больше циклов проводится, нагревая смесь приведет к гелеобразной консогласованность что затрудняет вихря.
   2. Охладите смесь на лед и вихрь в течение нескольких минут. Охлаждение помогает жидкое решение облегчая вихря.
      • Примечание: Чем больше циклов выполняются, смесь мутнеет при охлаждении.
   3. Повторите шаги, описанные выше (1.2.1 и 1.2.2), пока липидного полностью не растворится.
      • Примечание: Этот процесс может занять несколько часов. Bicelle образование обозначается изменением фазового поведения ДМФХ: CHAPSO формулировке. После завершения, смесь будет прозрачный гель при температуре не выше комнатной температуры и вязкой жидкости на льду.
4. Смесь bicelle готов к использованию и может храниться при температуре -20 ° С в течение длительного хранения (до 5 лет). Из-за риска гидролиза руководитель группы фосфолипидов, не рекомендуется хранить bicelles при комнатной температуре в течение длительного периода.

2. Включение белка в bicelles

Большинство МП структур, получаемых от bicelles кристаллизовались в ДМФХ: CHAPSO bicelle концентрации от 2 до 8% с помощью концентрации белка от 8 до 12 мг / мл (табл. 1). Если это возможно, начальные экраны должны использовать эти руководящие принципы и дополнительные концентрации могут быть показаны на стадии оптимизации. По сравнению с методом LCP, белковые включения с bicelles это простой процесс (рис. 3), что должно быть сделано в тот же день, как кристаллизация испытаний.

1. Оттепель ДМФХ: CHAPSO bicelle смесь при комнатной температуре до фазы изменения в прозрачный гель.
   • Примечание: Несколько стоп-тает не повлияет bicelle поведения.
2. Поместите смесь на лед в сжиженном и кратко вихрь, чтобы восстановить однородной фазы bicelle. При помещении на льду смесь мутнеет.
3. FrОМ этого момента, держите bicelle смеси и очищенного белка на льду. Это будет держать bicelle в жидкой фазе, что делает его поддаются пипетки.
4. Добавить bicelle смесь очищенного моющего средства растворяются белка 1:4 (V / V) соотношение.
   • Например: 100 мкл белка bicelle смесь получается путем смешивания 80 мкл белка с 20 мкл bicelle. Если концентрация белка составляет 15 мг / мл и bicelle концентрация составляет 35%, это даст bicelle-включен белковая смесь с концентрацией белка 12 мг / мл и bicelle концентрации 7%.
5. Смешать, осторожно пипеткой содержимого вверх и вниз, пока раствор не становится ясным и однородной.
   • Примечание: Если появятся пузырьки, быстро спина (30-60 секунд, 13000 оборотов в минуту, 4 ° С) с настольной центрифуге может помочь устранить их.
6. Выдержите смесь на льду в течение по крайней мере 30 минут для содействия полной включение белка Intо bicelles. Белок-bicelle смесь готова к кристаллизации испытаний.

3. Настройка кристаллизации испытаний

Другие липидного кристаллизации таких методов, как LCP требует специального оборудования из-за высокой вязкости среды, но уникальное поведение фазы bicelles позволяет осуществлять практически в любом стандартном формате кристаллизации в том числе робототехнику (рис. 3). Кристаллизация испытания могут проводиться в любом повешение или сидя падение с использованием стандартных форматов коммерчески доступных экранов.

1. Независимо от создания лотки вручную или с помощью кристаллизации робота, поддерживать белок-bicelle смеси на льду. Это позволит сохранить белка bicelle смесь холодной и убедитесь, что вязкость раствора минимален.
2. Руководство Испытания Кристаллизация - Использование стандартной пипетки, белка-bicelle смесь может быть смешана с резервуаром решение таким же образом, как это обычно выполняютред для растворимых или моющим средством, растворяются белки мембраны.
   • Примечание: Следует белка bicelle смеси на льду во время испытаний.
3. Испытания робота Кристаллизация - У нас есть с учетом этих испытаний для Mosquito робот кристаллизации, но в принципе (по той же меры предосторожности) техника должна быть совместимой со всеми кристаллизации роботов. Следующие советы будет гарантировать, что белок-bicelle смесь остается холодной и точно пипеткой на робота:
   1. Предварительно охлаждать Пластина удержания белка bicelle смеси, разместив его на лед.
   2. Внесите белка bicelle смесь в тарелку и продолжать держать пластину на льду. Эта пластинка должна быть последним пунктом идти на роботу, прежде чем начать работать.
   3. Настройка лотка резервуара и кристаллизации крышки на платформе 3 и 5 соответственно, комаров робота.
   4. Место пластины, содержащей белок-bicelle смесь на платформе 4от комаров робота. Это гарантирует, белка-bicelle смесь в последнюю очередь подобрал роботом, и это немедленно освобожден.
   5. Для предотвращения нагрева и повышенной вязкостью, не следует смешивать резервуар с белком bicelle смеси.
   6. При выполнении нескольких экранах, немедленно вернуться bicelle-белковые пластину лед для охлаждения, как только работа будет завершена.
4. Объем падения и отношения (белка: водохранилища) может быть выбрана, как для обычного испытания кристаллизации. Например, начальные испытания кристалл использования Mosquito робот может быть настроен с помощью 0,25 мкл белка: bicelle смесь плюс 0,25 мкл водохранилище.
5. Инкубируйте кристалл испытаний в камере при температуре 20 ° C. Температура является хорошим отбора и оптимизации параметров, поскольку фазовое поведение bicelles зависит от температуры.
   • Более высокие температуры вызывают ламеллярной фазы ¹² (рис. 1), который имеет то преимущество, предварительно организациибелка в слоях. Температура ниже 20 ° C могут быть проверены, но вы не должны опускаться ниже 4 ° С, так как это может привести к липидов для осаждения в течение длительных периодов времени.
6. Таким же образом, как традиционные испытания кристаллизации, bicelle испытаний должны быть проверены на регулярной основе для кристально появления и роста. Мы рекомендуем проверить лотки по ^1-й и ^3-й день после установки следуют еженедельные инспекции.
7. Кристалл оптимизация может быть проведена с использованием методов обычно используются для моющих средств основано кристаллов, включая сетку скрининга, добавка скрининга, изменение температуры и т. д. Кроме того, bicelle процента и белка: bicelle соотношение может меняться. Кроме того, bicelles может быть, легированных специфические липиды, которые могут быть необходимы для стабильности белка или функции.

4. Визуализация, добыче хрусталя и замораживания

Так как кристалл испытания с белком bicelle смеси имеют вязкость похожи на белок-моющих средств капель, визуализации и добычи кристаллов является обычным и осуществляется как традиционный набор окон.

1. Визуализация: В отличие от LCP СМИ, что часто требуется высококачественное освещение при нормальных и поляризованном свете для обнаружения кристаллов, визуализации не мешают bicelles. Цветные, а также бесцветные капли белковых кристаллов можно легко проанализировать с использованием стандартных микроскопов и никакого специального оборудования не требуется.
2. Bicelles, как и другие липидные средства массовой информации, как правило, производят высокий процент ложных срабатываний. УФ микроскоп очень помогает в дифференциации белка из кристаллов соли (рис. 4).
3. Добыча и замораживания: Crystal добычи и замораживания относительно проста и не требует роспуска окружающей среды bicelle. Кроме того, фаза bicelle сама предоставляет некоторые умеренные крио-защиту.

5. Представитель Результаты:

п "> Как правило, занимает 2-3 дня для кристаллов появляться и около недели или больше, пока они вырастут, чтобы их максимальный размер. Это был случай для бактериородопсина и мышь напряжение зависит от аниона канала 1 (mVDAC1) кристаллов ^4,8 . Для других мембранных белков может потребоваться несколько недель для роста кристаллов, поэтому важно продолжать мониторинг кристалл испытаний далеко за пределами первой недели.

Как и в других липидных СМИ, bicelles склонны к образованию форм, которые могут оказаться кристаллическими. Было также отмечено, что они приводят к более высокий процент соли и моющих средств кристаллов. УФ-микроскоп, который обнаруживает триптофан флуоресценции может значительно помочь устранить такие небелковые ложных срабатываний. Рисунок 4 показывает липидных форм, соль и белковых кристаллов, если смотреть в видимом и УФ-света, чтобы помочь отличить разные результаты, которые могут быть соблюдены.

83fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Bicelle схемы. Bicelles состоят из двухслойной липидной формирования молекулы, такие как ДМФХ (синий) и амфифила таких как CHAPSO (зеленый), который защищает гидрофобные края бислоя. Когда температура повышается, дискообразных bicelles пройти этап превращения в перфорированной пластинчатые ¹² листов.

Рисунок 2. Блок-схема для bicelle методом кристаллизации изложением четырех основных шагов.

Рисунок 3. Кристалл испытаний настройки схемы. Очищенная моюще-солюбилизированного мембранных белков может быть непосредственно смешанные с bicelles на льду просто пипетки содержимое вместе. После инкубации белка / bicelle смеси на льду в течение ~ 30 минут, судебные процессы кристаллизацииможет быть настроено с помощью любого стандартного формата, включая робототехнику.

Рисунок 4. Визуализация кристаллической испытаний. Видимое изображение (верхняя панель) и УФ-изображения (нижняя панель) (А) игольчатые кристаллы наблюдаются в соль-единственное условие. Нет флуоресценции можно обнаружить по кристаллов, указание ложных срабатываний. (B) палочковидные кристалла, образованного в MPD состоянии. Кристалл fluoresced слабо, но оказалось небелковые с помощью рентгеновской дифракции. (C) Кристалл наблюдается примерно через четыре недели после установки испытаний. Сильная флуоресценция в УФ-свете подтверждает это белковых кристаллов.

Нет.	Белок	Источник	Разработка Bicelle	Белки Concentratiна	Моющее средство 1	Разрешение (Å)	Ссылка
1	Бактериородопсин 2	Halobacterium salinarum	8% ДМФХ: CHAPSO (2,8:1)	8 мг / мл		2,0	Faham и Боуи, 2002
			8% DTPC: CHAPSO (3:1)	8 мг / мл		1,8	Faham и соавт., 2005
2	β2-адренергических рецепторов / Fab комплекс	Человек разумный	8,3% ДМФХ: CHAPSO (3:1)	10 мг / мл	DDM	3.4/3.7	Расмуссен и соавт., 2007
3	Напряжение зависит от аниона канала 1	Муз мышцы	7% ДМФХ: CHAPSO (2,8:1)	12 мг / мл	LDAO	2,3	Ujwal и соавт., 2008
4	Xanthorhodopsin	Salinibacter Ruber	4,2% ДМФХ, 5% Н.М.	4 мг / мл	DDM	1,9	Luecke и соавт., 2009
5	Ромбовидной протеазы	Кишечная палочка	2% ДМФХ: CHAPSO (2.6:1)	9 мг / мл	Нонил глюкозид	1,7	Vinothkumar, 2011

1 Моющее средство для очистки мембранных белков
2 Родные липидов из пурпурных мембран может осуществляться наряду во время очистки

Таблица 1. Резюме условий кристаллизации для структур мембранных белков решена с помощью bicelles.

Discussion

Bicelles являются уникальными липидный средств массовой информации, которые предлагают родной бислой-среде в то время как себя так, будто растворяются на моющие средства. Это свойство дает bicelles явное преимущество перед другими на основе липидов методы кристаллизации, так как нет обучения или специализированного оборудования, необходимого для этой техники. После bicelles имеются в наличии, либо коммерческой или подготовленные в лаборатории, они могут быть непосредственно смешивается с очищенным белком и с этого момен...