Этот протокол продемонстрирует экстракцию и анализ свободных и этерифицированных биоактивных жирных кислот из клеток. Жирные кислоты точно количественно определяются с помощью разбавления стабильных изотопов, хиральной жидкостной хроматографии, захвата электронов, атмосферной химической ионизации, мониторинга множественных реакций, масс-спектрометрии (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сотовая Добыча липидов для целевой Стабильный изотопного разбавления жидкостной хроматографии-масс-спектрометрического анализа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Метаболизм жирных кислот, таких как арахидоновая кислота (АА) и линолевая кислота (ЛК), приводит к образованию окисленных биоактивных липидов, включая многочисленные стереоизомеры1,2. Эти метаболиты могут образовываться из свободных или этерифицированных жирных кислот. Многие из этих окисленных метаболитов обладают биологической активностью и участвуют в различных заболеваниях, включая сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания, астмуи рак. Окисленные биоактивные липиды могут образовываться ферментативным путем или с помощью активных форм кислорода (АФК). Ферменты, метаболизирующие жирные кислоты, включают циклооксигеназу (ЦОГ), липоксигеназу (ЛО) и цитохромы Р450 (CYPs)1,8. Ферментативный метаболизм приводит к энантиоселективному образованию, в то время как окисление АФК приводит к рацемическому образованию продуктов.
Хотя этот протокол в первую очередь сосредоточен на анализе АА- и некоторых биоактивных метаболитов, полученных из ЛК, он может быть легко применен к метаболитам других жирных кислот. Биоактивные липиды экстрагируются из клеточного лизата или среды с помощью жидкостно-жидкостной (l-l) экстракции. В начале процесса экстракции l-l добавляются внутренние стандарты стабильных изотопов, чтобы учесть ошибки во время подготовки образцов. Разбавление стабильных изотопов (SID) также учитывает любые различия, такие как подавление ионов, которые метаболиты могут испытывать во время анализа масс-спектрометрии (МС)9. После экстракции, дериватизации с помощью реагента для захвата электронов (ЭК) используется пентафторилбензилбромид (ПФБ) для повышения чувствительности детектирования10,11. Мониторинг множественных реакций (MRM) используется для повышения селективности анализа МС. Перед анализом МС липиды разделяются с помощью хиральной нормальной фазы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия ВЭЖХ оптимизированы для разделения энантиомеров и различных стереоизомеров контролируемых липидов12. Этот специфический метод ЛХ-МС контролирует простагландины (ПГ), изопростаны (изоПс), гидроксиэйкозатетраеновые кислоты (ГЭТ), гидроксиоктадекадиеновые кислоты (ОДЭ), оксоэйкосатетраеновые кислоты (оксоЭТы) и оксооктадекадиеновые кислоты (оксоОДы); Тем не менее, параметры ВЭЖХ и МС могут быть оптимизированы для включения любых метаболитов жирных кислот13.
Большинство доступных в настоящее время биоаналитических методов не учитывают отдельное количественное определение энантиомеров. Это чрезвычайно важно при попытке определить, образовались ли метаболиты ферментативным путем или с помощью АФК. Кроме того, соотношения энантиомеров могут свидетельствовать о специфическом ферментативном пути образования. Использование SID позволяет точно количественно оценить метаболиты и учитывает любые потери образца во время подготовки, а также различия, возникающие во время ионизации. Использование реагента захвата электронов PFB увеличивает чувствительность детектирования на два порядка по сравнению с традиционными методами APCI. В целом, этот метод, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, является одним из наиболее чувствительных, селективных и точных методов количественного определения биоактивных липидов.
Протокол
1. Стандартные и внутренние стандартные смеси
- Перед экстракцией липидов необходимо подготовить стандартную смесь (SM) и внутреннюю стандартную смесь (ISM). Для SM эквивалентный объем 1 г каждого стандарта (всего 25), указанного в таблице реагентов ниже, с помощью калиброванного шприца поместить в мерную колбу объемом 10 мл. Нормы высушить под азотом и восстановить в 10 мл ацетонитрила (ACN). Конечная концентрация стандартной смеси составит 100 пг/мкл. Разделите на 1 мл аликвот и храните при температуре -80°C до тех пор, пока не понадобится.
- Из этой стандартной смеси можно получить 6 стандартных разведений, что в общей сложности составляет 7 калибровочных стандартов (1 пг/мкл, 2 пг/мкл, 5 пг/мкл, 10 пг/мкл, 20 пг/мкл, 50 пг/мкл и 100 пг/мкл). Эти стандарты должны использоваться с каждой партией образцов, подготовленных для разработки калибровочной кривой, используемой в количественном анализе.
- Для ISM аликвотируют эквивалентный объем 1 г каждого ИИ (всего 14), указанного в таблице реагентов ниже, в мерную колбу объемом 10 мл с помощью калиброванного шприца и высушивают под азотом. Восстановите ISM в 10 мл ACN и разделите на 1 мл аликвот. Конечная концентрация ISM должна составлять 100 пг/мкл. ISM достаточно для обработки 1000 образцов.
- Храните SM и ISM при температуре -80°C.
2. Сбор сред и клеточного лизата
- На каждые 10 см пластины адгезивных клеток (~ 1 X 107) соберите 3 мл среды в стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 мл. Далее промойте клетки 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS). Добавьте 1 мл PBS в планшет и соскребите клетки с планшета и пипетируйте во вторую стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 мл. На этом этапе клетки и среды могут быть сохранены, если процедура не будет продолжена в это время. Храните образцы при температуре -80°C для длительного хранения или при температуре -20°C менее одной недели.
3. Извлечение липидов из среды
- Свободные биологически активные липиды содержатся в клеточной среде, и они легко экстрагируются с помощью одноэтапной процедуры экстракции l-l. К собранной среде (2.1) добавьте 10 мкл ISM. В это время 8 дополнительных стеклянных центрифужных пробирок объемом 10 мл должны иметь маркировку #0-7 для калибровочных стандартов. Добавьте по 3 мл PBS в каждую из этих пробирок, а затем добавьте 10 μL соответствующего SM в пробирки 1-7 (1-7 из 1,1).
- Дайте ISM уравновеситься в каждом калибровочном стандарте и образце в течение 10 минут, а затем добавьте 5 мл диэтилового эфира. Затем образцы и калибровочные стандарты помещаются в шейкер на низкой скорости в течение 30 минут при комнатной температуре.
- После встряхивания все калибровочные стандарты и образцы центрифугируются при 1935 x g в течение 10 минут. Затем с помощью пастеровской пипетки перенесите верхнюю фазу (органическую) в новую стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 мл и высушите под азотом.
4. Извлечение липидов из клеточного лизата
- Уменьшите количество образцов клеток в стеклянных центрифужных пробирках при давлении 1935 X g в течение 5 минут. Утилизировать надосадочную жидкость; добавьте по 2 мл PBS в каждую пробирку и быстро сделайте вихрь. Удалите 25 мкл образца для количественного определения белка. Общий белок будет использоваться для нормализации клеточного лизата.
- Затем переложите половину смеси лизат/PBS в отдельную стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 мл. Добавьте еще 2 мл PBS вместе с 10 мкл ISM в каждый образец. Следуйте процессу экстракции l-l, описанному для сред в 3.2 и 3.3. Эта аликвота будет использоваться для измерения свободных липидов в клетках и предотвращения щелочной деградации липидов, таких как простагландины. Эта аликвота не будет проходить шаги 4.3 и 4.4, описанные ниже.
- На первом этапе процесса экстракции l-l этерифицированных липидов необходимо добавить 5 мл CHCl3/MeOH (2:1) в каждый образец. Образцы устанавливают в шейкер на низкую скорость в течение 30 минут. После встряхивания образцы центрифугируют при 1935 x g в течение 10 минут. Затем с помощью пипетки Пастера перенесите нижний (органический) слой экстракции l-l в новую стеклянную центрифужную пробирку объемом 10 мл и высушите образец под азотом.
- Этерифицированные липиды должны быть омылены перед количественным определением. Когда образцы высохнут, добавьте в каждую пробирку 0,5 мл 0,4N KOH с 80% MeOH. Затем образцы инкубируют при температуре 60°C в течение 1 ч. После инкубации добавьте 2 мл PBS. Отрегулируйте pH до 6 с помощью концентрированной кислоты HCl (~30 μL). Добавьте 10 μL ISM в каждый образец. Остальная часть процедуры аналогична экстракции липидов из среды и может быть выполнена в пунктах 3.2 и 3.3.
- Если эти экстракции выполняются одновременно с образцами среды, то для построения калибровочной кривой можно использовать одни и те же калибровочные стандарты; однако, если эти образцы выполняются в другое время, калибровочные стандарты также должны быть обработаны, как описано в 3.1-3.3.
5. Дериватизация пентафторбензилбромида (PFB)
- К высушенным образцам и калибровочным стандартам добавить 100 мкл безводного дихлорметана (CH2Cl2), затем 100 мкл 20% (v/v) N,N-диизопропилэтиламина в безводном CH2Cl2 и, наконец, 100 мкл 20% (v/v) PFB в безводном CH2Cl2.
- После добавления дериватизационных реагентов образцы подвергаются вортексной обработке, инкубации при 60°С в течение 1 ч и сушке в азоте. Образцы и калибровочные стандарты могут храниться при температуре -80°С, если они не были проанализированы немедленно или при -20°С в течение одной недели.
6. Разбавление стабильных изотопов, хиральная жидкостная хроматография, захват электронов, атмосферное давление, химическая ионизационная масс-спектрометрия (SID-LC-ECAPCI-MS)
- Высушенные образцы и калибровочные стандарты восстанавливаются в 100 мкл гексана/этанола (97:3). Затем весь образец можно перенести во флакон с ВЭЖХ с вкладышем. Поместите образцы в охлажденный автосамплер (4°C) и создайте список образцов для анализа.
- Далее настройте методы ВЭЖХ и МС с использованием параметров, описанных в Таблице 1 и Таблице 2 ниже. Таблица 3 содержит конкретную информацию о соединениях, включая MRM-переход и энергию столкновения (CE) для каждого липида, а также расчетное время удержания по результатам анализа Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. CE определяется путем настройки каждого отдельного липида во время разработки метода.
- Для нормального разделения фаз используется колонка Chiralpak AD-H (4,6 X 250 мм, 5 μ), нагретая до 30°C. Начальная подвижная фаза состоит на 98% из гексана и на 2% из метанола/изопропанола (1:1). После разделения ВЭЖХ метанол добавляют в пост-колонку (0,75 мл/мин), чтобы избежать отложения на игле Corona, которое может привести к снижению чувствительности. МС устанавливается в режим отрицательных ионов с помощью источника APCI. Если источник необходимо сменить с ESI на APCI, обязательно вставьте иглу Corona .
- Первым образцом, который следует запустить, всегда является заготовка гексана. Это уравновесит колонну, а также выявит, есть ли на ней какие-либо загрязнения, которые могут помешать калибровочному стандарту и анализу образца.
- Следующие прогоны образцов должны быть калибровочными стандартными образцами порядка 0-7 (возрастающая концентрация SM). Эти стандарты будут использоваться для создания калибровочной кривой, содержащей отношение стандартной площади/площади IS по оси y и стандартной концентрации или массы по оси x. Из уравнения y = mx + b, полученного на этом графике, отношение площади образца к площади IS (y) может быть использовано для определения количества или концентрации образца (x).
- Количество биологически активных липидов, обнаруженных в среде, может быть нормализовано до общего объема среды, а количество липидов, обнаруженных в клеточном лизате, может быть нормализовано либо до общего количества клеток/пластины, либо до общего количества белка/пластины. В пункте 4.1 протокола должны быть приняты меры для обеспечения подсчета клеток или количественного определения белка.
7. Репрезентативные результаты:
Хроматограммы на рисунке 1 представляют целевой профиль липидомики. На первой панели (рис. 1А) показаны 13- и 9-HODE вместе с соответствующими 13- и 9-оксоОДами, полученными из линолевой кислоты. Кроме того, 15-оксоЭТЭ, окисленный метаболит 15-HETE, также показан на второй панели. На двух нижних панелях изображены 20-HETE и 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. На рисунке 1B показано разделение и уникальные переходы, определенные для стереоизомеров HETE, которые возникают в результате ферментативного окисления АА или АФК. На рисунке 1C представлены PGs, isoP и LTB4. Некоторые стандарты не имеют дейтерированной ИС, коммерчески доступной; Поэтому для количественной оценки используется ИС, аналогичная по времени хранения. Например, [2H8]-12(S)-HETE используется для количественного определения видов 11-HETE и 8-HETE в дополнение к 12(R)-HETE и 12(S)-HETE.
Из репрезентативных хроматограмм очевидно, что существует небольшой сдвиг в удержании дейтерированного IS по сравнению с немаркированным стандартом. Этот сдвиг на более позднее время удержания является результатом взаимодействия дейтерия с колонкой нормальной фазы. Дейтерий более полярен, чем водород; Поэтому происходит более сильное взаимодействие с нормальной фазой колонны. Если бы это разделение происходило с использованием столбца с обращенными фазами, сдвиг произошел бы на более раннее время удержания, поскольку более полярная часть имела бы более слабое взаимодействие с обращенной фазой.
Рисунок 1. Этот рисунок является репрезентативным примером целевого липидомического анализа. На рисунке 1A показаны общие ионные хроматограммы (TIC) для нескольких окисленных метаболитов LA и AA, включая 13-оксоОД и 9-оксоОД на первой панели, 15-оксоЭТЭ на второй панели, 13-HODE и 9-HODE (панели 3 и 5) и 20-HETE (панель 7). HODE и 20-HETE имеют соответствующую дейтерированную IS на панели ниже (4, 6 и 8). TIC на рисунке 2B показывают разделение и уникальные переходы стереоизомеров HETE, полученных из АА. На рисунке 2C представлены PG, isoP и LT. Энергия столкновения (CE), MRM-переходы и время удержания (RT, мин) были оптимизированы с помощью Waters 2695 LC, соединенного с Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra, и перечислены в таблице 3 для каждого соединения.
| Время (мин) | % А | % В |
| 0 | 98 | 2 |
| 3 | 98 | 2 |
| 11 | 96,4 | 3.6 |
| 15 | 92 | 8 |
| 27 | 92 | 8 |
| 30 | 50 | 50 |
| 38 | 50 | 50 |
| 39 | 98 | 2 |
| 45 | 98 | 2 |
Таблица 1. Условия градиента ВЭЖХ для разделения хиральной нормальной фазы липидомики. Растворитель А на 100% состоит из гексанов, а растворитель В — из метанола/изопропанола (1:1).
| Параметр масс-спектрометрии | оправа |
| источник | ИУППА |
| режим | Отрицательные ионы |
| Длина метода | 40 мин |
| Ширина сканирования MRM | 0,002 м/з |
| Время сканирования MRM | 0.15 сек |
| Ширина пика MRM | 0,70 FWHM |
| Тубусная линза | 164 В |
| Источник CID | 10 эВ |
| Q2 Collision Gas | 1,5 единицы |
| Температура испарителя | 450°C |
| Температура капилляров | 250°C |
| Ток разряда | 0 мкА |
| Давление газов оболочки | 25 единиц |
| Давление развертки ионов | 3 единицы |
| Давление вспомогательного газа | 5 единиц |
Таблица 2. Выше приведены оптимизированные параметры масс-спектрометрии для измерения биоактивных липидов. Эти параметры взяты из принтера Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.
См. см См. мм мм См. мм См. См. См. См. мм См. См. См. См. мм См. См. См. См. мм См. См. мм мм См. См. мм мм мм См. См.| соединение | переход | CE (эВ) | RT (мин) |
| 13-оксоОД | 293.03 → 113.10 | 21 | 9,9 |
| 9-оксоОД | 293.03 → 113.10 | 21 | 17,9 |
| 15-оксоЭТ | 317.05 → 113.18 | 18 | 8,1 |
| 13(R)-HODE | 295.03 → 195.12 | 18 | 12,5 |
| 13(С)-ХОД | 295.03 → 195.12 | 18 | 14,8 |
| [2Ч4]-13(С)-ХОД | 299.03 → 198.12 | 18 | 14,9 |
| 9(R)-ХОД | 295.03 → 171.10 | 18 | 13,7 |
| 9(С)-ХОД | 295.03 → 171.10 | 18 | 21.2 |
| [2Ч4]-9(С)-ХОД | 299.03 → 172.12 | 18 | 21.2 |
| 20-ХЕТЕ | 319.03 → 289.10 | 18 | 12,4 |
| [2Ч6]-20-ХЕТЕ | 325.03 → 295.10 | 18 | 12,4 |
| 5(R)-ХЕТЕ | 319.04 → 115.04 | 16 | 15,7 |
| 5(С)-ХЕТЕ | 319.04 → 115.04 | 16 | 16,2 |
| [2Н8]-5(С)-ХЕТЕ | 327.04 → 116.04 | 16 | 16.4 |
| 12(R)-ХЕТЕ | 319.04 → 179.11 | 14 | 11.7 |
| 12(С)-ХЕТЕ | 319.04 → 179.11 | 14 | 12.3 |
| [2Н8]-12(С)-ХЕТЕ | 327.13 → 184.11 | 14 | 12,5 |
| 15(R)-ХЕТЕ | 319.04 → 219.12 | 13 | 12,4 |
| 15(С)-ХЕТЕ | 319.04 → 219.12 | 13 | 15,9 |
| [2Ч8]-15(С)-ХЕТЕ | 327.03 → 226.12 | 13 | 16.1 |
| 11(R)-ХЕТЕ | 319.04 → 167.11 | 16 | 11.1 |
| 11(С)-ХЕТЕ | 319.04 → 167.11 | 16 | 12,5 |
| 8(R)-ХЕТЕ | 319.04 → 155.09 | 16 | 11.7 |
| 8(С)-ХЕТЕ | 319.04 → 155.09 | 16 | 12,6 |
| ЛТБ4 | 335.03 → 195.10 | 18 | 32,0 |
| [2Ч4]-ЛТБ4 | 339.03 → 197.10 | 18 | 32,0 |
| ПГЭ2 | 351.03 → 271.15 | 18 | 31,2 |
| [2Ч4]-PGE2 | 355.03 → 275.15 | 18 | 31,2 |
| ПГД2 | 351.03 → 271.15 | 25 | 32,5 |
| [2Ч4]-ПГД2 | 355.03 → 275.15 | 25 | 32,5 |
| 8-изо-ПГЕ2 | 351.03 → 271.15 | 18 | 37,4 |
| 11β-ПГФ2 | 353.03 → 193.11 | 25 | 27,6 |
| [2Ч4]-11β-PGF2 | 357.03 → 197.11 | 25 | 27,6 |
| ПГФ2α | 353.03 → 193.11 | 25 | 33,1 |
| [2Ч4]-PGF2α | 357.03 → 197.11 | 25 | 33,1 |
| 8-изо-PGF2α | 353.03 → 193.11 | 25 | 34.4 |
| [2Н4]-8-изо-PGF2α | 357.03 → 197.11 | 25 | 34.4 |
Таблица 3. В этой таблице перечислены соединения, обнаруженные в общем ионном хроматограмме на рисунке 1A-C. Во втором столбце указан переход, используемый для MRM/MS, в третьем столбце указана энергия столкновения (CE, eV), а в последнем столбце указано время удержания (RT, min). Параметры были оптимизированы с помощью разделительного модуля Waters 2695, соединенного с Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Стандарты и внутренние стандарты, используемые в этом протоколе, обеспечивают представление целевого метода липидомики. Для анализа ЖХ-МС использовались сепарирующий модуль Waters 2695 и Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra, а оптимальные настройки параметров можно найти в таблицах 1 и 2. Кроме того, этот протокол экстракции был разработан для адгезивных клеток, но может быть модифицирован для других типов клеток, а также других биологических матриц, включая мочу, кровь и ткани. Многие станда...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не декларируется.
Благодарности
Большинство современных биоаналитических методов, доступных для измерения биоактивных липидов, не так обширны, поскольку они не включают хиральную нормально-фазовую хроматографию или SID. Хиральная нормальная фаза LC имеет решающее значение для разделения энантиомеров и для способности различать фермент- или АФК-опосредованный метаболизм. Использование SID гарантирует, что человеческая ошибка или осложнения, возникающие во время экстракции или анализа, будут учтены во время количественной оценки. Эти добавленные компоненты вместе с ECAPCI-MRM делают этот метод наиболее чувствительным и селективным для анализа биоактивных липидов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 5-оксо-6Е, 8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеноновый-6,8,9,11,12,14,15-d7 кислота | Cayman Chemical | 334250 | [2H7]-5-ox–TE Внутренний стандарт |
| 5S-гидрокси-6E,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеновая кислота-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 кислота | Cayman Chemical | 334230 | [2H8]-5(S)-HETE Внутренний стандарт |
| 12S-гидрокси-5Z,8Z,10E,14Z-эйкозатетраеноиново-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 кислота | Cayman Chemical | 334570 | [2H8]-12(S)-HETE Internal Standard |
| 15S-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-эйкозатетраеноновая кислота-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 кислота | Cayman Chemical | 334720 | [2H8]-15(S)-HETE Внутренний стандарт |
| 20-гидрокси-5Z,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеноновая кислота-16,16,17,17,18,18-d6 кислота | Cayman Chemical | 390030 | [2H6]-20-HETE Внутренний стандарт |
| 9S-гидрокси-10E,12Z-октадекадиеновая-9,10,12,13-d4 кислота | Cayman Chemical | 338410 | [2H4]-9(S)-HODE Внутренний стандарт |
| 13S-гидрокси-9Z,11E-октадекадиеновая-9,10,12,13-d4 кислота | Cayman Chemical | 338610 | [2H4]-13(S)-HODE Internal Standard |
| 9α,11α,15S-тригидрокси-проста-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 кислота | Cayman Chemical | 316010 | [2H4]-PGF2α Внутренний стандарт |
| 9α,11α,15S-тригидрокси-(8β)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 кислота | Cayman Chemical | 316350 | [2H4]-8-iso-PGF2a Внутренний стандарт |
| 9α,11β.,15S-тригидрокси-проста-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 кислота | Cayman Chemical | 10008989 | [2H4]-11β-PGF2 Внутренний стандарт |
| 9α,15S-дигидрокси-11-оксо-проста-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20,20-d4 кислота | Cayman Chemical | 312010 | [2H4]-PGD2 внутренний стандарт |
| 9-oxo-11α,15S-дигидрокси-проста-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,20,20,20-d4 кислота | Cayman Chemical | 314010 | [2H4]-PGE< sub>2 Внутренний стандарт |
| 5S,12R-дигидрокси-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 кислота | Cayman Chemical | 320110 | [2H4]-LTB4 Внутренний стандарт |
| 9α,11,15S-тригидрокси-тромба-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 кислота | Cayman Chemical | 319030 | [2H4]-TxB2 Внутренний стандарт |
| 5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34250 | 5-ox–TE Стандарт |
| 12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34580 | 12-ox–TE Стандарт |
| 15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34730 | 15-ox–TE Standard |
| 5R-гидрокси-6E,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34225 | 5(R)-HETE Standard |
| 5S-гидрокси-6E,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34230 | 5(S)-HETE Standard |
| 8R-гидрокси-5Z,9E,11Z, 14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34350 | 8(R)-Стандарт HETE |
| 8S-гидрокси-5Z,9E,11Z,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34360 | 8(S)-Стандарт HETE |
| 11R-гидрокси-5Z,8Z,12E,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34505 | 11(R)-Стандарт HETE |
| 11S-гидрокси-5Z,8Z,12E, 14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34510 | 11(S)-HETE Standard |
| 12R-гидрокси-5Z,8Z,10E,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34560 | 12(R)-HETE Standard |
| 12S-гидрокси-5Z,8Z,10E,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34570 | 12(S)-HETE Standard |
| 15R-гидрокси-5Z,8Z,11Z, 13E-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34710 | 15(R)-HETE Standard |
| 15S-гидрокси-5Z,8Z,11Z,13E-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 34720 | 15(S)-HETE Standard |
| 20-гидрокси-5Z,8Z,11Z,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 90030 | 20-HETE Standard |
| 9R-гидрокси-10E,12Z-октадекадиеновая кислота | Cayman Chemical | 38405 | 9(R)-HODE Стандарт |
| 9S-гидрокси-10E,12Z-октадекадиеновая кислота | Cayman Chemical | 38410 | 9(S)-HODE Стандарт |
| 13R-гидрокси-9Z,11E-октадекадиеновая кислота | Cayman Chemical | 38605 | 13(R)-HODE Стандарт |
| 13S-гидрокси-9Z,11E-октадекадиеновая кислота | Cayman Chemical | 38610 | 13(S)-HODE Standard |
| 9α,11α,15S-тригидрокси-проста-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 16010 | PGF2α Стандарт |
| 9α,11α,15S-тригидрокси-(8β)-проста-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 16350 | 8-iso-PGF2α Стандарт |
| 9α,11β,15S-тригидрокси-проста-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 16520 | 11β-PGF2 Стандарт |
| 9α,15S-дигидрокси-11-оксо-проста-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 12010 | PGD2 Стандарт |
| 9-oxo-11α,15S-дигидрокси-(8β)-проста-5Z,13E-диен-1-ойевая кислота | Cayman Chemical | 14350 | 8-iso-PGE2 Стандарт |
| 9-oxo-11α,15S-дигидрокси-проста-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 14010 | PGE2 Стандарт |
| 5S,12R-дигидрокси-6Z,8E,10E,14Z-эйкозатетраеновая кислота | Cayman Chemical | 20110 | LTB4 Стандарт |
| 9α,11,15S-тригидрокситромба-5Z,13E-dien-1-oic acid | Cayman Chemical | 19030 | TxB2 Стандартный |
| фосфатный буферный раствор | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Диэтиловый эфир | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| дихлорметан | Acros Organics | 61030-1000 | безводный |
| N,N-диизопропилэтиламин | Sigma-Aldrich | 387649 | |
| пентафторбензилбромид | Sigma-Aldrich | 101052 | |
| соляная кислота | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| гидроксид калия | Fluka | 00650 | |
| Ацетонитрил | Fisher Scientific | A996-4 | |
| Метанол | Fisher Scientific | A454-4 | |
| Хлороформ | Fisher Scientific | 366927 | |
| Гексан | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Изопропанол | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Этанол | Decon Laboratories | 2716 | |
| Water | Fisher Scientific | W7-4 | |
| Пастер Пипец | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 мл | Kimble Chase | 73785-10 | Винтовая крышка |
| Фенольные винтовые крышки | Kimble Chase | 73802-13415 | |
| Хиралсель ADH Колонка | Хиральные технологии | 19325 | |
| Флаконы с ВЭЖХ | Воды | 60000751CV | |
| Вставки для ВЭЖХ | Воды | WAT094171 |
Ссылки
- Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
- Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
- Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
- Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
- Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
- Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
- Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
- Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
- Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
- Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
- Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
- Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
