Мониторинг киназы и фосфатазы деятельности путем клеточного цикла Логометрический FRET

Краткое содержание

FRET основе репортеры все чаще используются для контроля киназы и фосфатазы деятельность в живых клетках. Здесь мы опишем метод, как использовать FRET основе журналистам для оценки клеточного цикла зависит от изменений в целевую фосфорилирования.

Аннотация

Ферстер резонанс переноса энергии (FRET)-основанной журналистам ¹ позволяют оценка эндогенной киназы и фосфатазы деятельность в живых клетках. Такие зонды обычно состоят из вариантов CFP и YFP, вмешался phosphorylatable последовательности и фосфорно-связывающий домен. После фосфорилирования, конформации зонд изменения, что приводит к изменению расстояния или ориентации между CFP и YFP, что приводит к изменению FRET эффективности (рис. 1). Несколько зондов были опубликованы в течение последнего десятилетия, мониторинг активности баланс нескольких киназ и фосфатаз, в том числе журналисты ПКА ^2, ПКБ ^3, РКС ^4, PKD ^{5, 6} ERK, JNK ^7, Cdk ^18, Aurora B ⁹ и ⁹ Plk1 . С учетом модульной конструкции, дополнительными зондами, будут возникать и в ближайшем будущем ^10.

Прогрессия через клеточный цикл влияет стресс signaliнг пути ^11. Примечательно, что клеточный цикл регулируется по-разному в невозмущенной рост по сравнению с когда клетки восстанавливается после стресса ^12. Покадровый изображений клеток через клеточный цикл, следовательно, требует особой осторожности. Это становится проблемой, особенно при использовании логометрических изображений, так как два изображения с высоким отношением сигнал-шум должны правильно интерпретировать результаты. Логометрический FRET изображений клеточного цикла зависимые изменения в киназы и фосфатазы деятельность имеет преимущественно ограничивалась подразделы клеточного цикла ^8,9,13,14.

Здесь мы рассмотрим метод мониторинга FRET основе использования зондов логометрических изображения по всему человеческому клеточного цикла. Метод основан на оборудование, которое доступно для многих исследователей в области биологических наук и не требует специальных знаний микроскопии или обработки изображений.

Протокол

1. Введение зонда в клетки

1. Сотрудничество трансфекции клеток с FRET основе зонда и плазмиды присвоении сопротивления. Выберите трансфекции метод, который эффективен в вашей камерного типа, представляющих интерес. Для ячеек U2OS, стандартные методы фосфатом кальция трансфекции дают адекватные результаты ^15.
2. Выделите ячейки в соответствующий антибиотик, по крайней мере за семь дней. Это обогащает количество клеток, экспрессирующих зонда и ограничивает количество клеток с токсичного уровня выражения или выражения уровней, которые серьезно влияют на клеточный цикл.
3. (Не обязательно) Выберете для стабильного клонов.
4. Использование фиксированных или живых клеток, убедитесь, что оба CFP и YFP присутствуют во всех клетках примерно на том же соотношении.
5. В случае, если некоторые клетки содержат только CFP или YFP, рекомбинации, скорее всего, произошло. Рекомбинация может происходить как во время роста бактерий или после трансфекции зонда и может, в последнем случае зависит от плазмиды качества. Повторите плазмиды рвозмещение ущерба и линеаризуем плазмиды перед трансфекцией, если проблема не устранена.

2. Мониторинг логометрических FRET

1. Семенной клеток на стеклянным дном посуды, и не закрывайте скользит для монтажа в камере. Убедитесь, что посуда / крышка не скользит 1.5 (170 мкм).
2. Горы клеток в питательной среде без фенола красного на моторном epifluorescence микроскоп с контролем температуры установлен в 37 ° C. Обеспечить рН регулирование средств массовой информации, либо по CO ₂ или с помощью СО _{2-независимые} средства массовой информации, таких как Liebowitz-15.
3. Сосредоточьтесь на клетки с использованием проходящего света. Не смотрите на клетки с помощью флуоресцентного света.
4. Начнем с приобретения 12 или 16 бит изображения с помощью YFP возбуждения (YFPex) и YFP выбросов (YFPem) фильтры и подходящие дихроичных зеркал. Используйте максимальное биннинга доступны, что позволяет еще требуется субклеточных разрешения. Использование высоких биннинга уменьшить время экспозиции или интенсивности имеет решающее значение для предотвращения фототоксичности.
5. Мнеуверяем или оценить интенсивность фона и приблизительный шума путем измерения или оценки грубые средние, минимальные и максимальные значения пиксела в области лишенный клеток. Изменить время экспозиции и фильтры нейтральной плотности, так что средняя сигнала в клетке примерно интенсивности фона плюс пять-десять раз разница между макс и мин интенсивности фона.
6. Убедитесь, что изображения не близка к насыщенной. Максимальная интенсивность на изображении должно быть не менее половины динамического диапазона (например, максимальное 2000 года в 12-битное изображение), чтобы учесть интенсивность различия, когда клетки вступают в митоз.
7. Повторите шаг 2,4 до 2,6 использованием возбуждения CFP и фильтры YFP выбросов и подходящие дихроичных зеркал.
8. Выберите несколько регионов с трансфекции клеток, за исключением зон, используемых для точки 2,4 до 2,7, и гарантировать, что максимальная интенсивность составляет менее половины динамического диапазона во всех клетках.
9. Начало покадровой эксперимент приобретении два изображения каждые 45 мин с использованием YFPex - YFPem и CFPex - YFPem наборы фильтров.

3. Проверка и оптимизация условий

1. Открытое полученные изображения и монитора время клеточного цикла от митоза к митоза для клеток, которые выражают трансфицированных зонда.
2. Сравнить измеренное время клеточного цикла опубликованным данным для типа клеток используются. Кроме того, фильм untransfected клетки захватывает один образ проходящем свете только (например, DIC или фазового контраста) каждый час, чтобы получить ссылку раз клеточного цикла.
3. В случае, если время от митоза к митозу соответствует ссылкой таймингов клеточного цикла, перейдите к шагу 4. Кроме того, повторно приобрести изображения с помощью труднее экспозиции, больше времени, точки или нескольких Z-уровней и повторите шаг 3.
4. В случае, если время от митоза к митозу не соответствует ссылкой таймингов клеточного цикла, кино трансфицированных клеток, приобретая одно изображение проходящем свете только (например, DIC или фазового контраста) каждый час следуют одно изображение в концеэксперимента для выявления трансфекции клеток.
5. Если трансфекции клетки по-прежнему показывают больше клетка время цикла, повторите шаг 1, но меньше трансфекции зонда или выбрать для стабильных клонов, которые содержат очень небольшое количество зонда.
6. Если трансфекции клетки показывают обычное время клеточного цикла при отсутствии дневного света, повторите шаг 2, но меньше воздействия, изменяя биннинга, фильтры нейтральной плотности, время экспозиции, а время между изображениями.

4. Анализ FRET

1. Анализ может быть выполнен по большей части программного обеспечения посвященный микроскопии. Здесь мы опишем, как выполнять анализ с использованием бесплатной ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij ) с использованием плагина Отношение Plus ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . HTML ).
2. Откройте изображение в ImageJ. В случае, если ваши изображения в формате НТКК многоцветнаяк (например Deltavision), отдельные индивидуальные каналы сначала преобразовать их в HyperStack: Image-HyperStack-стек для HyperStack, а затем разделить их на один канал, используя стеки: Image-HyperStack-уменьшить размерность
3. Умножить YFPex - YFPem стека с использованием 3: Process-Math-Multiply Этот шаг является необязательным, так как она предназначена только для увеличения четкости образов, гарантируя, что отношения не находятся в диапазоне между 0 и 1.
4. В YFPex - стек YFPem, рисовать области интереса (ROI) в области, которая лишена клеток, но это близко к клетке должна быть измерена. Различные клетки в тот же образ может потребовать различных регионах, и как фон и интенсивность сигнала обычно является самым сильным в центре изображения.
5. Добавить в рентабельность инвестиций ROI менеджер: Анализ-инструмент-ROI менеджера.
6. Измеряется средняя интенсивность ROI в обоих YFPex - YFPem и CFPex - YFPem стека: Анализ-Measure
7. Повторите на нескольких timepoints и убедитесь, что фон интенсивности близки к ячейке интерес похожи на протяжении всего фильма.
8. Установите измерения включают минимальную интенсивность: Анализ-Set-Min измерений и Макс серого.
9. Нарисуйте область интереса, охватывающего большую часть клетки и мера минимальной интенсивности в обоих YFPex - YFPem и CFPex - YFPem стека. Возьмите разницу между измеренным минимальные интенсивности и интенсивность фона с 4,6 и делим его на две части. Это создает основу для оценки отсечения значение.
10. Открытый Плюс Ratio. Выберите YFPex - YFPem и CFPex - YFPem стека. Для FRET отношение, выберите CFPex - YFPem как стек 1, для перевернутого FRET соотношение визуализации зонды, где FRET эффективность уменьшается при фосфорилирования, выберите YFPex - YFPem как стек 1.
11. Вставьте измеряется интенсивность фона и обрезки значения.
12. Установите масштабирование полученное соотношение стек и применять подходящие U смотретьр таблицы (LUT) для визуализации соотношение меняется.

5. Представитель Результаты

Plk1 деятельность первого видимого в ядре в G2 фазе и пики во время митоза. На рисунке 3 показан эксперимент с использованием минимальных настройках фототоксичности, как описано в разделе 2. Пожалуйста, обратите внимание, что это представитель первоначальный результат, и что воздействие условий или времени между снимками может быть изменена для увеличения сигнала к шуму или временное разрешение. Рис 3D показывает, что большинство клеток, экспрессирующих зонд размножаться со временем клеточного цикла от 20 до 25 часов, указав, что изображение условий и уровня экспрессии зонд не влияют тайминги клеточного цикла. Несмотря на значительный шум, тенденция Plk1 повышения активности в G2 и достигает пика в ¹⁴ митоза отчетливо видно (рис. 3А). Обработка первичных данных, здесь означает фильтрации представлена ​​как кимограф (рис. 3В), или количественная оценка средней перевернутой ра TiO (рис. 3C) может повысить четкость.

Рисунок 1. Принцип FRET основе датчика для контроля киназы и фосфатазы деятельности. Два флуорофоры, как правило, CFP (синий) и YFP (зеленый), связаны фосфо-связывающий домен (оранжевый) и phosphorylatable последовательности (желтый). Фосфорилирование (красный) опосредует связывание с фосфорно-связывающий домен, тем самым вызывая конформационные изменения в зонд. Результаты конформационного изменения разницы в расстоянии и ориентации между двумя флуорофоров, что влияет на эффективность FRET между CFP и YFP. FRET могут быть визуализированы, возбуждая CFP и мониторинга YFP выбросов (пунктирные линии).

Рисунок 2. Схематическом плане экспериментальной процедуры.

p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Plk1 деятельность первого видимого в ядре в G2 фазе и пики во время митоза. U2OS клеток, экспрессирующих FRET основе датчика мониторинга деятельности Plk1 ^9,14 были сняты в течение 60 часов использования Deltavision Spectris Система визуализации оснащена 20-кратным Н. А. 0,7 объективный воздуха и ртутной лампы. Изображениями условия были выбраны вызывать минимальное фототоксичности, как указано в разделе 2, используя 4x биннинга и нейтральные фильтры, которые блокируют 99% входящего света. , Ложное представление цвета перевернутая FRET-коэффициент, после одной ячейки по 4 подразделения. B, кимограф ячейки показана на после применения фильтра означает. С количественной перевернутой FRET отношение ячейки показана на А. Д., кумулятивные вступления митотической из 50 FRET-зонд экспрессирующие клетки, в том числе подразделений дочерних клеток.

Обсуждение

Мониторинг FRET протяжении клеточного цикла требует соображения, которые являются менее важно при оценке краткосрочных ответов на внешние раздражители. Во-первых, прогрессию клеточного цикла легко возмущенного стресс сигнализации, требуя, чтобы фототоксичности сведено к минимуму. Во-вторых, все журналисты могут потенциально влиять на клеточные процессы титрованием из киназ, фосфатазы или взаимодействия доменов. Вероятно, самый простой способ оценить, если условия эксперимента адекватны заключается в измерении длины клет...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент	Номер по каталогу	Компания
Лейбовиц L-15, без фенола красного	21083-027	GIBCO, по Life Technologies
DMEM + Glutamax-I	31966	GIBCO, по Life Technologies
Эмбриональной бычьей сыворотки (FBS)	SV30160.03	Hyclone
0,05% трипсина ЭДТА	SH30236.01	Hyclone
Пенициллин-Стрептомицин	SV30010	Hyclone
DPBS	14287	GIBCO, по Life Technologies
Пуромицин	P8833	Sigma-Aldrich