Мониторинг Расколотая активность каспазы-3 и Апоптоз Иммортализованные Олигодендроглиальные Клетки с использованием живых клеток и цифровой обработки изображений Cleaveable флуорогенных краски Подложки После калий-индуцированной деполяризацию мембраны

Краткое содержание

Live-ячейки изображения каспазы-3 опосредованного апоптоза в увековечены N19-олигодендроцитов культурах клеток с использованием NucView 488 каспазы-3 субстрата. Эта техника применима для запрограммированной гибели клеток анализов в режиме реального времени в различных типах клеток и тканей.

Аннотация

Центральная нервная система может испытывать ряд стрессов и неврологических нарушений, которые могут иметь многочисленные неблагоприятные последствия, которые в конечном итоге приводят к сокращению популяции и функции нейронов. Поврежденные аксоны могут высвобождать возбуждающие молекулы, включая калий или глутамат, во внеклеточный матрикс, что, в свою очередь, может привести к дальнейшему повреждению поддерживающих глиальных клеток, включая астроциты и олигодендроциты^. Если повреждение не прекращается, клетки подвергаются запрограммированной клеточной смерти (апоптозу), которая регулируется и активируется рядом хорошо установленных каскадов передачи сигнала ¹⁴. Апоптоз и некроз тканей могут возникать после черепно-мозговой травмы, ишемии головного мозга и судорог. Классическим примером апоптотической регуляции является семейство цистеин-зависимых аспартат-направленных протеаз, или каспаз. Активированные протеазы, включая каспазы, также участвуют в гибели клеток в ответ на хронические нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и рассеянный склероз ^{4, 14, 3, 11, 7}.

В этом протоколе мы описываем использование субстрата каспазы-3 NucView 488 для измерения скорости опосредованного каспазой-3 апоптоза в культурах клеток ^{15, 5} иммортализированных N19-олигодендроцитов (OLG) после воздействия различных внеклеточных стрессов, таких как высокие концентрации калия или глутамата. Условно иммортализованная клеточная линия N19-OLG (представляющая собой предшественника O2A) была получена от доктора Энтони Кампаньони (Институт нейронаук Семеля Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе) ^{15, 5} и ранее использовалась для изучения молекулярных механизмов экспрессии миелиновых генов и передачи сигналов, приводящих к дифференцировке OLG (например^{, 6, 10}). Мы обнаружили, что эта клеточная линия устойчива к трансфекции с экзогенным основным белком миелина (MBP), слитыми либо с RFP, либо с GFP (красным или зеленым флуоресцентным белком) ^{13, 12}. Здесь клеточные культуры N19-OLG обрабатывали либо 80 мМ хлорида калия, либо 100 мМ глутамата натрия для имитации аксональной утечки во внеклеточный матрикс с индуцированием апоптоза ⁹. Мы использовали бифункциональный субстрат каспазы-3, содержащий субъединицу узнавания каспазы-3 DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) и ДНК-связывающий краситель ². Субстрат быстро проникает в цитоплазму, где расщепляется внутриклеточной каспазой-3. Краситель NucView 488 высвобождается и попадает в ядро клетки, где связывается с ДНК и флуоресцирует зеленым цветом на длине волны 488 нм, сигнализируя об апоптозе. Использование субстрата NucView 488 caspase-3 позволяет визуализировать живые клетки в режиме реального времени ^{1, 10}. В этом видео мы также рассказываем о культивировании и трансфекции иммортализованных клеток N19-OLG, а также о методах визуализации живых клеток.

Протокол

1. Размораживание и культивирования клеток

1. Получить запас замороженных увековечены N19-олигодендроглиальных клеток от долгосрочных магазинов жидкого азота.
2. Погрузитесь флакон, содержащий клетки при 37 ° С водяной бане, пока клеточная суспензия является полностью оттаять.
3. Добавить 7 мл DMEM (модифицированная Дульбекко Eagle Medium) с высоким глюкозы с добавлением 10% FBS (эмбриональной бычьей сыворотки) и 1% пенициллина / стрептомицина на 10 см пластины культуры.
4. Добавить клеточной подвески каплям к пластине, и осторожно перемешивать и рок-Петри пластины для разгона клетки равномерно.
5. Культуры клеток при 34 ° C / 5% СО ₂ инкубатора.
6. После 4-х часов, аспирация средств массовой информации из пластин для удаления оставшихся ДМСО (диметилсульфоксид), который был использован в качестве криопротекторов, и заменить свежим СМИ (7 мл DMEM высокого глюкозы СМИ с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин) .

2. Пассирования клетки

1. На 70-80%слияния (4-7 дней роста), аспирация средств массовой информации из клеток.
2. Добавьте 1 мл 0,25% трипсина к пластине. Внесите трипсина отделить клетки (около 5 минут).
3. Сделать соответствующие разведения для экспериментальных условий и прохождения дополнительных 10 см пластины для будущих экспериментов на клеточном плотностью не менее 0,1 х 10 ^{6 клеток} / мл.

Примечание: Вы должны прохождения ваши клетки не реже двух раз после оттаивания, прежде чем использовать их для экспериментов.

3. Подсчет и покрытие Клетки

1. Для пластины ячеек для живых клеток с изображениями, trypsinize как описано выше.
2. Удалить примерно 30 мкл клеток и подсчета использованием гемоцитометра.
3. Место без покрытия стекло покровное в 6 лунками. Добавить клетки и при плотности 0,1 х 10 ^{6 клеток} / мл в 2 мл фенола без DMEM высокого глюкозы средства массовой информации, с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин / стрептомицин, при 34 ° C / 5% CO _2.
4. Позволятьклеткам расти в течение ночи (16-20 ч) при 34 ° C / 5% CO ₂ до трансфекции.

4. Трансфекция

1. Комбинат 100 мкл сыворотки среде, 0,5-4 мкг очищенной ДНК плазмиды, и 4 мкл FuGENE HD (Roche). Vortex аккуратно перемешать.
2. Vortex вновь кратко и позволяют ДНК, чтобы комплекс в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем добавить FuGENE HD ДНК смесь непосредственно на культуре клеток. Наклон пластины аккуратно перемешать.
3. Культуры клеток для дополнительных 48 ч при температуре 34 ° C / 5% CO ₂ до начала лечения или эксперимента.

5. Подготовка Клетки для Live-сотовый Imaging (LCI)

1. Включите LCI Chamlide живая клетка блока управления инструментом не менее 1 ч до Вы хотите, чтобы начать свой эксперимент. Блок управления также регулирует температуру и влажность в пределах LCI Chamlide, а также регулирует поток предварительно смешанного 5% CO _2.

Примечание: Желательно, чтобыВключение блока управления до 3-х часов до начала эксперимента, чтобы весь этап достигает 34 ° C. Этот шаг позволит снизить координационного дрейф, который вызван fluxulation и тепловое расширение металла сцене, как она согревает, во время съемки.

2. Работая в течение капотом, спрей Chamlide магнитного типа культуры камеры, и пинцет, с 70% этанола и дать им возможность высохнуть в течение 5 минут.
3. Удалить клетки из инкубатора и подтвердить, что они здоровы. Они должны появляться сторонником и хорошо распространяется на стекло покровное с многочисленными процессами мембраны. Клетки, которые подчеркнули, от трансфекции не подходят для экспериментов, и будет иметь сокращение числа процессе расширения и часто неправильной формы ядра.
4. Tilt 6-луночного планшета и удалить покровное с помощью пинцета. Быстро положите покровное ячейку вверх в нижнюю часть культуры камеры. Не допускайте, покровным, чтобы высохнуть.
5. Прикрепите магнитные основныхТело культуры камеру и добавить 500 мкл средств массовой информации из оригинальной 6-луночный планшет на вершину покровным. Повторное использование этого средства массовой информации будет уменьшаться количество нагрузки на клетках, вызванное изменениями окружающей среды, а также может быть полезным для оценки внеклеточной выделяются факторы.
6. Место стеклянной крышкой на культуру камеры.
7. Используйте KimWipe опрыскивают 70% этанолом, чтобы удалить остатки материала со дна покровное, которая может помешать микроскопии.
8. Место культуры в камере 34 ° C / 5% CO ₂ инкубаторе в течение 30 мин. Этот шаг гарантирует, что камера сама нагревается до 34 ° С до снижения смещения покровного как металл нагревается.

6. Микроскоп Настройки

Изображения были получены здесь использовании Leica DMIRE2 инвертированный микроскоп с пользовательским объектив реле и выбросов фильтр колесо жилья для картриджа загрузки нескольких колес (Кворум Technologies, Guelph, ON).

1. Светлое - лампа установлена ​​в 2,5 В и времени экспозиции до 240 мс.
2. Красный флуоресцентный белок (RFP) - Прибыль установлена ​​на уровне 140 за 200 мс.
3. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) - Прибыль установлена ​​на уровне 140 за 500 мс.
4. Наш микроскоп с регулируемой яркостью лампы, а не вращающийся диск для контроля количества света доступны для клеток. Мы проводим наши эксперименты со светом в 90% от максимальной интенсивности лампы.

7. Лечение Клетки с Апоптоз Индукторы и NucView 488 каспазы-3 подложки

1. Важно подготовить большие запасы апоптоз индукторы заранее и заморозить их в аликвот, так что концентрация будет соответствовать между экспериментами.
2. NucView 488 подложку светочувствительных. Подготовка аликвоты 15 мкл уменьшить замораживания / оттаивания, и хранить трубы при температуре -20 ° C покрыты алюминиевой фольгой. Работа с освещением комнаты как можно ниже, чтобы уменьшить воздействие NucVМЭН 488 субстрата на свет, до его использования.
3. Получить культуры камере быстро из инкубатора, так что клетки не подвергаются снижение температуры. Место культуры камеры на экологической палаты микроскоп, и использовать зажимы, чтобы сохранить культуру камере двигаться. На этом этапе вы должны также тусклом комнате свет.
4. Включите 5% CO _2, предварительно смешанные бак с двойным регулятором.
5. Использование 10x цель, фокус, чтобы найти клетки на мониторе компьютера, используя яркие микроскопии. Примечание: вы хотели бы использовать крупнейших числовой апертурой на цель с желаемыми увеличением уменьшить время экспозиции.
6. Доставить индукторы апоптоза в клетках (в нашем случае 80 мМ калий, или 100 мМ глутамат), один из следующих методов может быть использован. Мы будем использовать доставки 80 мМ калий, как например, с помощью KCl расторгнутым 10x концентрата в наш типичный медиа культуры.
   1. Медиа обмен бу медленных и местных перфузии:
      - Использование перистальтического насоса для обмена медиа в культуре камера с новых средств массовой информации, содержащий 80 мМ калий.
      - Один конец трубки будет поставлять 10 мл запас 80 мм калия, растворенного в фенол без DMEM, а другой конец трубки будет удалить СМИ из камеры.
      - Вы хотите, чтобы по крайней мере 10-кратный обмен СМИ, чтобы убедиться, что средства массовой информации оставил в камере правильной концентрации калия.
      - После того, средства массовой информации происходит обмен, добавляют 3 мкл NucView 488 субстрат для средств массовой информации в камере. Внесите перемешать.
   2. Прямое добавление 80 мМ К ⁺ и NucView 488 субстрата к средствам массовой информации в культуре камеры:
      - Подготовка 10x маточного раствора 80 мм калия, растворенного в фенол без DMEM.
      - Добавить 3 мкл NucView 488 субстрата до 50 мкл 10x 80 мм калия. Внесите перемешать. Добавить в 500 мкл фенола без DMEM в культуре камеры.
      Примечание: этот методпредпочтительнее, если вы заинтересованы в сохранении или оценке роста или других выделяемых факторов, которые могут присутствовать в оригинальном носителе. Мы обнаружили, что NucView 488 подложке устойчив в культуре клеток для экспериментов прочного тех пор, пока 36 ч.

8. Live-ячейки изображения

1. Нажмите на красный канал для показа трансфекции клеток.
2. Выберите и сэкономить около десятка кадров, где Есть несколько трансфекции клеток, и сохранить эти «точки XY сцене". В зависимости от объема памяти компьютера, вы можете быть ограничено число этапе очки, которые вы сможете приобрести.
3. У микроскопа захвата изображения (в ярко-поле, красный канал и зеленый канал) в этих точках сохранены этапе каждые 6 минут.
4. Любая зеленая окраска, которая видна во время ранней стадии экспериментов, вероятно, указывает клетки, которые уже апоптоза, из-за обычно трансфекции и / или экологического стресса. ApoptОсис из-за экспериментальной процедуры будут обнаружены позже timepoint в эксперименте.

9. Статистический анализ

1. Для каждого эксперимента, мы программируем микроскопом, чтобы приобрести несколько точек XY собрать большой набор данных эффективно. Каждый эксперимент проводился в двух экземплярах или трех экземплярах, а также данные собираются из отдельных экспериментов в разные дни. Из каждого набора данных, мы анализируем до 15 полей зрения и сравнить соотношение каспазы-негативные клетки, чтобы каспазы-позитивных клеток (общее количество клеток в поле зрения / общее количество каспазы-положительных клеток).

2. Записанных измерений от каждого набора данных сгруппированы в большей выборочной совокупности, а затем сравниваются друг с другом использовании дисперсионного анализа таблицы (р = 0,05). Мы покажем, стандартные ошибки среднего (SEM) каждого эксперимента, а затем сравнить разницу в средствах, выполняя сравнения Тьюки проверки нуждаемости (р = 0,05), чтобы определить WHич лечения значительно отличаются друг от друга.

10. Представитель Результаты

Мы описали эксперимент, чтобы показать, как NucView 488 субстрат может указывать на увеличение скорости апоптоза N19-OLG клеточных культур следующее лечение с высокой внеклеточной концентрации калия. N19-клетки трансфицированных ППП, и либо обрабатывают 3 мкл NucView 488 субстрата (контроль), или 3 488 ​​мкл NucView подложки и 80 мм [K ^+] (лечения). Клетки мониторинг и изображения были приобретены в течение 12 ч время курса, который является достаточным для исследований, связанных с неврологическими оскорбления (рис. 1А). В контрольных условиях, мы не наблюдали значительного количества апоптоза по сравнению с 80 мм [K ^+] обработанных культурах (хешированном коробке), который показал примерно 45% гибель клеток через 12 ч (рис. 1б). Фонового сигнала зеленого наблюдатьд в контрольных условиях указывает клеток, которые претерпевают апоптоз без добавления внеклеточного калия. Практически ни одна из ячеек на выставке контрольный эксперимент апоптоза момент времени 12 ч, хотя в других ситуациях эксперименты могут быть необходимы для запуска дольше. Изображения были получены с помощью 10x цели. Бар = 100 мкм.

Рисунок 1. (А) 12 ч время курса эксперимент N19 OLG культур 48 ч после трансфекции выражения RFP-MBP (красный канал) вместе с 3 мкл NucView 488 подложке (зеленый коридор). Культур были либо получавших конечной концентрации 80 мМ [K ^+] (левая панель) или отсутствия лечения в качестве контроля (правой панели). Изображения были получены в 6 минутные интервалы, и значительной активации расщепляется каспазы-3 (зеленый сигнал) можно наблюдатьд в культурах, обработанных с 80 мМ [K ^+] в ядрах клеток (хешированном окно) по сравнению с контрольным экспериментом. (B) Процент расщепляется каспазы-3 клетки (рассчитывается путем деления общего количества клеток в поле зрения по Общее количество каспазы-положительных клеток). По сравнению с контролем условий, мы наблюдали около 45% гибели клеток следующих K ^{+-лечения} на 12 ч.

SVideo 1. 12 ч время курса эксперимент N19-OLG культур 48 ч после трансфекции выражения RFP-MBP (красный канал) с 3 мкл NucView 488 подложке (зеленый коридор), наряду с ярко-поле изображения и трехстороннее объединены изображения, после лечения 80 мм [K ^+].

SVideo 2. 12 ч время курса эксперимент N19-OLG культур 48 ч после трансфекции выражения RFP-MBP (красный канал) с 3 мкл NucView 488 подложке (зеленый коридор), наряду с ярко-поле мнимойх годов, и трехходовой объединенного изображения. Никакое лечение не была применена к культурам и N19-OLGs можно увидеть мигрирующих через микроскоп поля в отличие от клеточных культур обрабатывают 80 мм [K ^+] (ср. с SVideo 1).

Обсуждение

Хотя это не только флуорогенных продукт доступным для обнаружения апоптоза, Есть несколько существенных преимуществ использования NucView 488 подложке. Одним из основных преимуществ является способность следовать апоптоза в живых клетках в режиме реального времени, тогда как большинство альтернативных продуктов либо требуют лизиса клеток или плохо проницаемость клеток. Другие преимущества включают высокую чувствительность для каспазы-3, признание, высокая проницаемость клетки, низкой цитотоксичности, и никакого вмешательства в прогрессировании апоптоза. Подложка также имеет низкую флуоресценции фона, пока он не расщепляется и поступает в ядро, которое устраняет фоновые флуоресценции. Каспазы-3 узнаваемой последовательности содержит 3 отрицательных зарядов и ДНК-связывающий краситель имеет один положительный заряд ^2. DEVD-NucView 488 молекулы таким образом, имеет отрицательный заряд, который препятствует активации и связывания красителей с ДНК в клетках, где каспазы не активен.

Массачусетсintaining согласованности между экспериментов требуется, чтобы иметь возможность получения значимых сравнений между повторяет. Один из основных параметров сохранить последовательным является плотность клеток, как это влияет на скорость трансфекции. Получение высоких темпов трансфекции в увековечены N19-OLG культурах клеток гораздо сложнее, чем с другими общими линиями клеток, таких как HeLa или HEK293, и очень сильно зависит от плотности, по нашему опыту, ^{12, 13.} Наша лучшая эффективность трансфекции для этих клеток были получены с Fugene HD (Roche) и, как правило, около 15%, но может достигать более 30%, в зависимости от конструкции. Тщательный подсчет ячейки помощь в получении постоянную скорость трансфекции. Важно также выявить клетки от различных методов лечения в той же степени нагрузки на окружающую среду, в частности, при измерении скорости апоптоза. В частности, продолжительность времени, в течение которых клетки подвергаются воздействию реагентов трансфекции, или количество освещенности, важны экологические переменныепеременных для рассмотрения, и должно оставаться постоянным по всей экспериментов. Для наших приложений, мы обнаружили, что сбор большого количества полей-обзора обеспечивает достаточно большой размер выборки, чтобы сделать статистически значимые сравнения [там же].

Материалы

Название реагента	Компания	Номер по каталогу
NucView 488 каспазы-3 Пробирной комплект для живых клеток	Biotium	30029
FuGENE HD трансфекции реагента	Roche	04709705001
Дульбеко изменения Eagle среднего	Гибко	31053-028
0,25% трипсина	Гибко	15050-065
Эмбриональной бычьей сыворотки	Гибко	12483-020
Пенициллин / стрептомицин	Гибко	15140122
# 1.5-25 мм стекло покровное	Warner инструменты	64-0715
Chamlide реликтового излучения магнитного культуры камера для 25 мм покровное стекло	Кворум Технологии	CM-B-40
Cellstart культуры тканей 10 блюд см	VWR	82050-576
BD Сокол 6-а блюда культуре ткани	VWR	CA62406-161