Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Transretinal записи ЭРГ от мыши Retina: палочек и колбочек Photoresponses

17.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3424

⸱

14 марта 2012 г.

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем относительно простой метод transretinal электроретинограммы (ЭРГ) записи для получения палочек и колбочек photoresponses с нетронутой сетчатке мышей. Такой подход имеет преимущество блока синаптической передачи от фоторецепторов, чтобы изолировать их свет ответы и записать их с помощью поля электродов, расположенных по всей изолированные плоские установлен сетчатки.

Аннотация

Есть два различных классов формирования изображения фоторецепторов в сетчатке глаза позвоночных: палочки и колбочки. Стержни способны обнаруживать одиночные фотоны света в то время как конусы непрерывно работать в быстро меняющихся условиях яркого света. Поглощение света стержень и конус конкретных зрительных пигментов в наружных сегментов фоторецепторов вызывает фототрансдукции каскад, что в конечном итоге приводит к закрытию циклических нуклеотидов закрытых каналов на мембране клетки и гиперполяризации. Это светоиндуцированного изменения мембранного тока и потенциал может быть зарегистрирован в качестве фотоотклика, либо классический 1,2 электрод всасывания технику записи или записи transretinal электроретинограммы (ЭРГ) с изолированной сетчатки с фармакологически заблокирован постсинаптических компонентов ответ 3-5. Последний метод позволяет наркотики доступны длительные записи с мышью фоторецепторов и особенно полезна для получения стабильных photoresponses птОМ скудны и хрупкими конусов мыши. В случае конусы, такие эксперименты могут быть выполнены как в темно-адаптированных условиях и после интенсивного освещения, который отбеливает практически все зрительного пигмента, чтобы следить за процессом восстановления конус фоточувствительность в темное адаптации 6,7. В этом видео мы покажем, как выполнять стержень и M / L-конус управляемой transretinal записи с темно-адаптированных мыши сетчатки. Род записи будут осуществляться с использованием сетчатки дикого типа (C57BL / 6) мышах. Для простоты конус записи будут получены из генетически модифицированных стержень трансдуцина α-субъединицы нокаут (ta - / -) мышей, которые не имеют стержень сигнализации 8.

Протокол

1. Изготовление электродов

  1. Подготовка стеклянных электродов. Взвесьте 120 мг агара и смешайте его в 10 мл дистиллированной воды (конечная концентрация агара 1,2%). Растопить агар решение в ванну с горячей водой. Заполните стеклянные капилляры (мы используем инструменты Слово Presision TW100-4 капилляров со следующими размерами: длина = 100 мм, OD / ID = 1/0.75 мм, а внутренний объем = 44 мкл) с агар решения с использованием пластикового шприца. Укрепить агар при комнатной температуре в течение 10 мин. Таким образом, до ~ 200 капилляры могут быть заполнены (остальные агар смесь можно хранить при температуре -4 ° С и повторно использовать несколько раз).
  2. Разрежьте пополам капилляров помощью алмазного ножа.
  3. Замочите в результате стеклянных электродов в мышь решение электрода, по крайней мере 24 часов при температуре 4 ° C. Хранить электродов при температуре 4 ° C и использовать их на протяжении 3-4 месяцев.

2. Настройка эксперимента

  1. Темно-адаптировать мышь ночь. Использование дикого типа (например, C57Bl / 6) мыши для стержневых управляемой transretinal записи и T α - / - мышей, лишенных стержня сигнализации 8 конус transretinal записей.
  2. Подготовить 1 л перфузионного раствора, 100 мл электрод решение, и 20 мл инкубационного раствора (см. ниже) и фильтровать корыта перфузии решение Millipore 0,45 мкм и 0,22 мкм фильтр (опция).
  3. Калибровка источника света (505 нм светодиодные и галогенные лампы оптических стимулятор) с помощью фотометра помещается в плоскости сетчатки. В случае светодиодный источник света, использовать оптический рассеиватель света для достижения единообразия.
  4. Подготовка перфузии камеры для эксперимента (камера конструкции могут отличаться). Наша камера из 3 оргстекла мм, нижний из крышки небольшие пластиковые чашки Петри, а также имеет активный объем перфузии ~ 400 мкл (L = 25 мм, W = 8 мм, H ≈ 2 мм). Заполните нижний электрод пространстве камеры с электродами растворе, содержащем 2 мМ L-глутамата и 10 мМ BaCl 2. Использование пластиковых труб и стеклянного капилляра, чтобы связь между решением в нижний электрод пространства (из пластика разъем трубы прикреплены к нижней палаты) и держатель электрода. Убедитесь, что нет пузырей в электроде, соединительные трубки, или держатель электрода (очистить решения с использованием пластикового шприца, если это необходимо).
  5. Установите запись камеры на сцене микроскопа (опционально: микроскоп может быть установлен на антивибрационные стол и экранированные в клетку Фарадея, чтобы минимизировать механические и электромагнитные помехи). Подключите нижний держатель электрода к положительному полюсу headstage дифференциального усилителя (например, Warner инструменты DP-311 усилитель). Центр и выравнивания камеры нижнего электрода с открытием месте световой раздражитель. Подключите перфузии линии записи камеры и поверните перфузии на.
  6. Bubble перфузии раствора с 95% O 2/5% CO 2 при инкубации его в 40 ° C Ватэ ванну. CO 2 регулирует рН раствора до 7,2. Решение вытекает из бутылки, чтобы записи камеры под действием силы тяжести, проходящих через керамический резистор нагревательных его 36-37 ° C. Для уменьшения потерь тепла, нагревателем должна быть расположена как можно ближе к записи камеры возможно, в идеале на стадии микроскоп.
  7. С регулятором потока регулировать расход около 1 мл / мин.
  8. Подключите верхний электрод на второй (отрицательный) полюс headstage помощью второй держатель электрода. Привязка термопарой к верхнему электроду использованием уплотнительного кольца. Убедитесь, что электрод и термопары советы близко друг к другу так, чтобы температура чтении приняты как можно ближе к центру сетчатки, насколько это возможно. Погрузите кончик верхнего электрода в перфузии раствором и поместите его в центре камеры. Позвольте 10-15 минут для базовой стабилизации.
  9. Регулировка напряжения постоянного тока на нагреватель, чтобы температура раствора составляет 36 -37 ° C.

3. Выделение мышью Retina

  1. Под тусклым красным светом, усыпить темно-адаптированных мышь с CO 2 и шейки дислокации. Дополнительно: сделать отметку на каждой мыши глазное яблоко от прижигания наиболее спинной точки склеры с прижиганием ручкой или с подогревом вскрытия PIN-код. Все последующие процедуры проводятся в инфракрасном свете с помощью инфракрасной преобразователи изображения подходят для рассечения микроскопом.
  2. Проанализируйте из глаза с изогнутыми ножницами, слегка надавливая и растяжения кожи по бокам каждого глаза. Hemisect оба глаза при использовании инфракрасной подсветки microscissors или лезвием бритвы.
  3. Удалить роговицы и хрусталика. Удалить столько стекловидного тела, как это возможно.
  4. Пил первый сетчатки из слоя пигментного эпителия и, при необходимости, тщательно очистите его с помощью щипцов для удаления оставшихся гранул пигментного эпителия. Мы, как правило, используя всю сетчатку для палочек и колбочек transretИнал записей. Однако, если вы хотите записать в частности из спинной части сетчатки мышей, которая имеет больше M / L-конуса 9 до пилинга сетчатки удаление вентральной части наглазник с лезвия бритвы или microscissors помощью прижигания знак в качестве ссылки.
  5. Поместите второй hemisected глазное яблоко в небольшом чашку Петри с инкубационный раствор и инкубировать препарата в светонепроницаемый ящик насыщенной чистым кислородом до использования. Как правило, в этих условиях второй наглазник мыши могут храниться в течение нескольких часов при комнатной температуре и использовать для записи.
  6. С помощью стеклянной или пластиковой пипетки передачи изолированной сетчатки к снижению перфузии раствора (около 300 мл) на крышке чашки Петри. Добавить 5-6 капельки электродов раствор, содержащий BaCl 2 предварительно инкубировать сетчатки с BaCl 2. Поместите квадратный кусок (около 5х5 мм) задней стороне угла смазкой (мы используем Dow Corning 111 смазку клапанов и герметик) Millipore фильтровальную бумагу (0,45 мкм HARG типа) с готовых дыру в центре (2-2,5 мм в диаметре), к тому же капля раствора. Используя щипцы положение сетчатки в верхней части фильтровальной бумаги (фоторецепторов стороной вверх) и нажмите ее края на периферии плоской смонтировать его. Сетчатки должна быть сосредоточена на открытии в фильтровальную бумагу.
  7. Используя щипцы передать фильтровальную бумагу с сетчатки перфузии камеру и поместите его над стимул место краю нижнего электрода пространства. Слегка нажмите на смазанные края фильтровальной бумаги для соединения его с камеры.
  8. Установите верхний электрод в центре сетчатки глаза (слегка касаться фоторецептора слой). Центрирование верхнего электрода на сетчатке увеличивается амплитуда сигнала (до ~ 20-40% по сравнению с помещая его ближе к краю сетчатки). Хотя такое расположение электродов слегка искажает эффективную интенсивность светового раздражителя достижения небольшой участок сетчатки (~ 12-15% от общей площади), до сих пор оптимальный способ размещения электроноврастоптал. Препарат готов к transretinal записей.

4. Transretinal Recordings

  1. В зависимости от вашей линии мышей, запись стержень или M / L-конус управляемой ответы тест вспышки от тусклый к яркому интенсивность калиброванный света 505 нм, выделяемых из светодиодных источников света или оптический стимулятора. В случае наших светодиодных источников света, интенсивность вспышки контролируется путем сочетания компьютерное управление светодиодной входного напряжения, переключаемых резисторов, и набор фильтры нейтральной плотности (мы используем E-Цвет # 211 0.9 ND фильм фильтры Rosco лабораторий ), помещенный между светодиодами и сетчатки. Продолжительность светодиодной вспышкой тест (20 мс) контролируется с помощью компьютера. При использовании галогенной лампы оптических стимулятор, тест интенсивность вспышки и длины волны можно управлять с помощью набора фильтры нейтральной плотности и узкие фильтры интерференционных полос, соответственно. Испытание длительность вспышки можно управлять с помощью управляемого компьютером ставни.
  2. Дополнительно: для поддержания эффективнойПодавление глиальных компонент фотоотклика с BaCl 2 в течение дня, изменить нижний электрод решения иногда (например, до тестирования каждого сетчатки) очищая его с помощью пластиковых шприц, заполненный свежим раствором.

5. Представитель Результаты

Решения

  1. Мышь сетчатки перфузии решение: 112,5 мм NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 10 мМ HEPES (рН 7,2), 20 мМ NaHCO 3, 3 мМ сукцината натрия, 0,5 мМ Na глутамата, 0,02 мМ ЭДТА, и 10 мМ глюкозы. Кроме того, решение с добавлением 2 мМ L-глутамата и 10 мкМ DL-АР-4, чтобы блокировать более высокого порядка компонентов фотоотклика 10,11 и 0,1% MEM витаминов и аминокислот MEM решения кислоты (Sigma), чтобы улучшить сетчатки жизнеспособность.
  2. Мышь электрод решение: 140 мм NaCl, 3,6 мМ KCl, 2,4 мМ MgCl 2, 1,2 мМ CaCl 2, 3 мМ HEPES (рН 7,4, NaOH). Решение в нижней элементыctrode пространство также содержит 2 мМ L-глутамата, чтобы заблокировать синаптической передачи 10 и, кроме того, 10 мМ BaCl 2 для подавления глиальных компонент фотоотклика 3,12.
  3. Решение Retina инкубации: растворить 272 мг L-15 среднего (Sigma) и 20 мг BSA в 20 мл дистиллированной воды. Окончательный L-15 и BSA концентрации 13,6 мг / мл и 1 мг / мл, соответственно. Отрегулируйте рН до 7,4 с 1 M HCl.

Рисунок 1.
Рисунок 1. Принципиальная схема показывает выделение мышью сетчатки для transretinal записи ЭРГ.

Рисунок 2.
Рисунок 2. Фотография камеры перфузии и записи электродов с их владельцами. Красные стрелки указывают направление потока перфузии.

Рисунок 3. Рисунок 3. Схема экспериментальной установки для transretinal записи ЭРГ. Красные стрелки указывают направление потока перфузии.

Рисунок 4.
Результаты Рисунок 4 представителя. Записали семью мышь стержень управляемой transretinal ответов. Photoresponses были нижних частот фильтром на 30 Гц (8-контактный Бесселя), оцифрованные с частотой 1 кГц и хранятся на компьютере для дальнейшего анализа. Показано следы представляют собой средние 5-6 ответов на тусклый свет и интенсивность 2-3 ответов на интенсивности насыщения светом.

Рисунок 5.
Рисунок 5 Представитель результаты. Записанных семью мышь конус управляемой transretinal ответов. Photoresponses были нижних частот фильтром на 30 Гц (8-контактный Бесселя), оцифрованные с частотой 1 кГц и хранятся на компьютере для дальнейшего анализа. Показано следы усреднениях годов 5-10 ответов на тусклый свет и интенсивность 3-5 ответов на интенсивности насыщения светом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод стержня и конус управляемой transretinal записи ЭРГ описанных выше становится мощным инструментом для исследования функции мыши фоторецепторы как дикого типа и генетически модифицированных животных. В дополнение к легкой характеристика основных свойств фотоотклика, этот простой метод обеспечивает большую стабильность ответ в течение длительных экспериментов на близкие к нетронутым препаратов сетчатки. И темно-адаптированных стержень максимальная амплитуда реакции и фотосенсибилизация в мышей дикого типа стабильны ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Поддержка развития карьеры награду от исследований в области профилактики слепоты, NIH гранты EY19312 и EY19543 (Vjk), а также неограниченный грант от исследований в области профилактики слепоты и EY02687 (кафедра офтальмологии и визуальных наук в Университете Вашингтона).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материал Имя Тип Компания Номер по каталогу Комментировать
DL-АР-4 TOCRIS биологических наук 0101
Все остальные реагенты Sigma-Aldrich
Стеклянные капилляры Инструменты Всемирной Precision TW100-4 Для изготовления электродов
Фильтровальная бумага HARG Millipore HABG01300
Фотометр UDT инструменты S350 Для легких калибровки
Радиометрический датчик кремния UDT инструменты 221 Для легких калибровки
Anti-вибростол Технические Manufacturing Corporation TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 Чтобы свести к минимуму механические шумы
Воздушный компрессор Пантера P 15TC Вертер Международного P 15TC Подключение к антивибрационные стол
Стереомикроскоп LEICA MZ9.5 Для мыши рассечение глаза
Инфракрасные преобразователи изображения BEMeyers ProwlerTM Связанные с стереомикроскоп
Дифференциальный усилитель
DP-311 		Warner Instruments DP-311
Axon DIGIDATA 1440A Digitizer ; Molecular Devices 1440A
Двухканальный 8-полюсный фильтр Крон-HITE корпорации 3382
Керамическая резистор TE подключения CGS SBCHE618RJ Для нагревательных перфузии решение
Термопара Т Physitemp инструменты IT-18
Температура монитор Омега DPi32 Подключение к термопары
Светодиодная 505 нм TT Electronics / Optek технологии Digi-Key P / N 365-1185-ND Чтобы применить тест вспышек / отбеливания свет
Прижигание перо Bovie AA25 Для маркировки спинной частис помощью мыши глазного яблока
pCLAMP 10 электрофизиологии сбора данных и программного обеспечения для анализа Molecular Devices

Ссылки

  1. Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
  2. Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings. J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).
  3. Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures. J. Physiol. 567, 923-938 (2005).
  4. Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina. Vision Res. 48, 264-272 (2008).
  5. Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
  6. Wang, J. S., Kefalov, V. J. An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle. Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).
  7. Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein. J. Neurosci. 31, (2011).
  8. Calvert, P. D. Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).
  9. Applebury, M. L. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27, 513-523 (2000).
  10. Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response. Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).
  11. Vinberg, F., Koskelainen, A. Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery. PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).
  12. Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina. Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Transretinal записи ЭРГ от мыши Retina: палочек и колбочек Photoresponses
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.