Методическая статья

Вывод глиальных ограниченной прекурсоров от E13 мышей

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3462

⸱

20 июня 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hugo W. Moser Research Institute at Kennedy Krieger, Johns Hopkins University, 2Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine, 3University of Maryland , 4Experimental Neurology, Biogen Idec, 5The Brain Science Institute, Johns Hopkins School of Medicine, 6Department of Pediatrics, Johns Hopkins School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает вывод глиальных ограниченной прекурсоров от плода спинной мозг и поддерживать в пробирке или для трансплантации или для изучения oligodendrocytic линии.

Аннотация

Это протокол для вывода ограниченного глиальных предшественников (ВРП) в клетки спинного мозга плода E13 мыши. Эти клетки ранних предшественников в oligodendrocytic линии клеток. В последнее время эти клетки были изучены как потенциальный источник для восстановительного лечения заболеваний в белом вопрос. Перивентрикулярная лейкомаляция (ПВЛ) является ведущей причиной негенетические белый болезнь материи в детстве и затрагивает до 50% очень недоношенных детей. Эти данные свидетельствуют о повышенной чувствительности развивающегося мозга к гипоксии-ишемии, окислительного стресса и токсичности, которые избирательно зарождающейся белого вещества. Глиальных ограниченной прекурсоров (ВРП), олигодендроцитов клеток-предшественников (OPC) и незрелых олигодендроцитов (preOL) кажутся ключевыми игроками в развитии ПВЛ и являются предметом продолжающихся исследований. Кроме того, предыдущие исследования выявили множество тканей центральной нервной системы, которая повышенная восприимчивость к токсичности как глутамата также модель развития этой восприимчивости. Наша лаборатория в настоящее время изучает роль предшественников олигодендроцитов в ПВЛ и использования клеток в ВРП стадии развития. Мы используем эти полученные клетки ВРП в нескольких экспериментальных парадигм, чтобы проверить их реакцию на выбор напряжений в соответствии с ПВЛ. ВРП клетки можно манипулировать в пробирке в фотобарабанов и preOL для экспериментов трансплантации мышиных моделях ПВЛ и в пробирке моделей ПВЛ, как оскорбления в том числе гипоксии-ишемии. При использовании культивированных клеток и в лабораторных исследованиях не было бы быть уменьшена изменчивость между экспериментов, что облегчает интерпретацию данных. Культивируемых клеток позволяет по обогащению ВРП населения, а также сведение к минимуму воздействия загрязняющих клетки без ВРП фенотипа.

Протокол

Введение

В этом протоколе мы покажем, как для извлечения, выбор и пластины глиальных ограниченной предшественника (ВРП) в клетки спинного мозга плода E13 мыши. Эти клетки ранних предшественников в oligodendrocytic и астроцитов линий клеток и определяются их выражение A2B5. В среднесрочной ВРП дополнить FGF-2, A2B5 ВРП + начнется выражения начале oligodendrocytic линии маркеров PDGFαR и NG2 1,2. Эти олигодендроцитов клеток линии проходят через ряд различных фенотипических этапов, каждый из которых характеризуется морфологическими изменениями, а также выражения маркерами определенных этапах своего развития.

Эти клетки-предшественники в настоящее время изучается как потенциальный источник для клеточной терапевтических подходов при расстройствах центральной нервной системы белого вещества, в том числе рассеянного склероза, leukodystrophies и перивентрикулярной лейкомаляции (ПВЛ) 3,4,5,6 6,7,8,9. Эти глиальные клетки-предшественники также были использованы при исследовании других белом веществе болезнь моделей, таких как травмы спинного мозга и бокового амиотрофического склероза 10,11,12,13.

Наша лаборатория разработала раннем послеродовом гипоксии-ишемии мышиной модели, с которой мы оцениваем эффективность этих спинного мозга, полученных ВРП клеток восстановительного подхода в ПВЛ, основная причина детского церебрального паралича 14,15,16. Существует также грызунов мозга, полученных OPC модель, которая широко используется для изучения белого вещества, так как травма ВРП клетки имеют тенденцию дифференцироваться в астроцитарных путь 17. Фенотип OPC уже поступила в олигодендроцитов пути линии, явление, которое кажется irreversible. Тем не менее, мы заинтересованы в оценке реакции широкого спектра олигодендроцитов предшественников в том числе ВРП и, возможно, даже ПОШ, полученные в E10.5. По этой причине мы приняли спинного мозга, полученных ВРП модель для нашей работы.

В дополнение к использованию ВРП для замены клеток, вывод из этих клеток дикого типа и трансгенные модели грызунов белого вещества заболевания позволяет в дальнейшем изучении в глиальных дифференциации в норме и при болезни условия в постановке лабораторных условиях. Предыдущие публикации показывают данные селективной уязвимости oligodendrocytic линии клеток-предшественников различных внешних стрессов, как созревание зависимость токсичности глютамата, окислительный стресс, и выберите факторов, обуславливающих neuroinflammation 18,19. Наши исследования были направлены на понимание клеточных и молекулярных механизмов, стоящих за развитием этих белых травм вопрос, оценки восприимчивости клетоколигодендроцитов спектр линии оскорбить, а также анализ предполагаемых терапевтических подходов.

Материалы

Все процедуры, связанные с животными соответствующие PHS политики и JHU IACUC. Все процедуры должны выполняться в ламинарном боксе в целях поддержания асептических условиях. Обычно вскрытия выполняются в горизонтальном потоке капотом и в пробирке работы в вертикальном капот потока. Все средства массовой информации использовали холода во время вскрытия. У мышей, используемых в нашем исследовании дикого типа CD-1 напряжение и трансгенных GFP в C57/BL6 фоне. Один CD-1 мыши плотины обычно дает 10 + плодов, которые являются достаточно семян 1-2 T25 колбы. Как правило, две плотины приносятся в жертву во время и спинного мозга плода объединения и высевали в 1 T25 колбу на плотину. Как только клетки были получены они могут быть расширены и характеризуются в пробирке для последующих исследований.

1. Подготовка средств массовой информации и фляги

  • ВРП акциисреды используется как Dissection среда: DMEM / F12 1:1 (Invitrogen) + B27 (50х, Invitrogen) N2 (100x, Invitrogen) добавки и бычьего сывороточного альбумина (БСА, 0,5% вес / объем).
  • Разрушение среды: как же вскрытие среды.
  • Культура среды: ВРП акции средний + FGF-2 (10-20 нг / мл; Invitrogen) и гепарин (1 мкг / мл, Sigma).
  • PLL / ламинин покрытием 75 см 2 или 25 см 2 колбах (T75 или T25).
  • Ткань культуры фляги (75 см 2, Falcon) были покрыты 15-20μg/ml поли-L-лизин (PLL, Sigma) в дистиллированной H 2 O, инкубировали при 37 ° С в течение 1 ч, затем атмосферный. Колбы промывали 1X с PBS затем покрывают 15-20 мкг / мл Ламинин (Sigma) в PBS при 37 ° С в течение 1 часа, а затем и свежий атмосферный PBS или средства массовой информации пока не добавил клетки готовы быть покрытием. После покрытия колбы не следует высохнуть, но могут быть сохранены в PBS или средств массовой информации при 4 ° С в течение кратких периодов перед использованием.

2. Инструменты и другие Мaterial

  • Чашки Петри: 4 на плотине: 3 чашки Петри для вскрытия (75 мм), 20 мм блюдо для сбора собрано спинного мозга.
  • Большие ножницы (43 мм Рабочая ножницы, Roboz) и ткани щипцы для открытия живота плотины с.
  • Малые ножницы для рассечения матки и удаление плода (15 мм Micro Анатомический ножницы, Roboz).
  • Micro Анатомический весной ножницы (6 мм), чтобы вскрыть спинного мозга плода.
  • Micro Анатомический пинцет угловой для крепления дамбы и плода тело во время операции и последующее удаление спинного мозга при воздействии.
  • 40 или 70 мкм клетки фильтр для удаления клеточных остатков перед покрытием.
  • 0,05% трипсина подогретую до 37 ° C.
  • 10 мг / мл ДНКазы 1 (Sigma), приготовленный как 100x акций (1 г / мл).
  • Био-опасность мешок для трупов животных.
  • 15 и 50 мл пробирок для обработки извлечения спинного мозга.

3. Определение по времени Pregnancy

Беременные плотины мыши либо заказать у коммерческих источников указанием доставку эмбриональных день E12 или E13 в развитии плода или беременность определяется в доме. Короче говоря, две женщины находятся вместе с одним мужчиной в конце дня и оставляют на ночь вместе. На следующий день у самок наблюдается наличие вагинально расположен слизистая пробка. Слизистая пробка только признак того, что спаривание происходит настолько животных взвешивали ежедневно контролировать уровень увеличения веса. В день, когда слизистая пробка наблюдается определяется как эмбриональные дня (E1).

4. Вывод тканей

  1. Работа по горизонтальным капотом поток для поддержания асептических условиях.
  2. Спрей вниз капот и рабочая зона с 70% этанола.
  3. Автоклав инструментов или спрей подробно с 70% этанола.
  4. Подготовка инструментов, средств массовой информации, и микроскоп для использования.
  5. Налейте 20 мл холодной среды рассечение в стерильные Петри диш.
  6. Обезболить животное хлоралгидрат (500 мг / кг) вводили внутрибрюшинно (IP), а затем шейки дислокации или обезглавливание.
  7. Спрей области живота плотины с 70-90% этанола (дезинфекции)
  8. Откройте живота с большим ножницами и щипцами.
    1. В CD1 и C57/BL6 штаммов: обычно от 8 до 14 плодов будет внутри матки. Количество плодов является штамм зависимы.
  9. Извлечение матки у мышей, включая щенков и место в свежей холодной среды вскрытия в чистую чашку Петри мыть кровь и ткани мусора из плода.
  10. Извлечение плода каждый из рога матки и отделить их от зародышевого мешка и плаценты используя небольшие ножницы. Передача извлеченных плодов в свежем среднего рассечение в новую чашку Петри.
    1. Вскрытие среда должна быть при низкой температуре, чтобы снизить метаболическую активность и сохранить жизнеспособность полученных клеток.
    2. Работа с сегодняшнего дня с двумя щипцами имикро рассечения весенне-ножницы.
  11. Работая под микроскопом рассечение, порезать кожу вдоль позвоночника с микро-хирургических ножниц и корки назад, чтобы разоблачить спинного мозга.
  12. Секут спинного мозга с микрохирургические ножницы около C1 и в начале хвоста.
  13. Удаление спинного мозга с тупым пинцетом, убедитесь, что все кости и хрящи удаляются и передать 3 чашки Петри на вскрытии среды.
  14. Чтобы предотвратить разрастание ткани менингеальные в последующих культурах клеток попытаться удалить как можно больше мозговых оболочек как можно дальше от спинного мозга. В связи с зарождающейся выступающие периферических нервов это сложнее, чем удаление менингеальные ткани извлечен мозг.
  15. После мозговые оболочки были удалены, передавать спинного мозга до 20 мм блюдо Петри
  16. Очистка от тщательно распыление области с 70-90% этанола.
  17. Следующие шаги для диссоциации должно быть сделано быстро, чтобы сохранитьвысокую жизнеспособность производных спинного ткани мозга.

5. Создание культуры

  1. Трипсин должны быть предварительно нагревается в течение 30 мин при 37 ° CH 2 O-ванна. Соответствующие аликвоты должны быть удалены со склада для уменьшения воздействия акции к колебаниям температуры.
  2. Передача собранных спинного мозга в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 10 мл подогретого трипсина (0,05%; качества биологических препаратов) и 100 мкл ДНКазы (10 мг / мл) и растирают кратко.
  3. Инкубируйте в 37 ° CH 2 O-бане в течение 10 минут.
  4. Растереть и выдержать еще 10 мин.
  5. Добавьте 5 мл ВРП среды (определен выше) и центрифуги в течение 5 мин при 1000 оборотов в минуту.
  6. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют гранул с 10 мл среды ВРП и добавить ДНКазы-1 (10 мг / мл, Sigma).
  7. Инкубируйте в 37 ° CH 2 O-бане в течение 10 минут.
  8. Центрифуга 5 минут при 1000 оборотов в минуту и ​​аспирации супернатант.
  9. Ресуспендируйте гранул с частотойш ВРП среднего, то фильтр мусора с 40 - 70 мкм ячейки фильтра.
  10. Пластина на PLL / ламинин покрытием 25 см 2 колбах (T25) и инкубировать при температуре 37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2.
  11. 100% СМИ изменится на следующий день.
  12. На данный момент ВРП придают и начал расширение процессов.

6. Immunopanning населения ВРП

  1. Пластина спинного мозга в ткани PLL / ламинин покрытием колбы до колбы составляет 85-90% сливной или около недели.
  2. Урожай клетки, очищая колбу с резиновой полицейский или 0,05% трипсина, растереть тщательно, но осторожно, центрифуги при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин и тщательно ресуспендируют шарик с 3 мл среды ВРП.
  3. Передача 1 мл до 3 колбы T25 или 3 мл на 1 T75 колбу добавляют соответствующие объемы средних и полностью покрывают клетки и позволяет колбы достичь 80-90% слияния.
  4. Изменение средств массовой информации каждый день, раньше, если среда быстро истощает.
  5. Пальто бактериологического Петри блюда (75 мм) в течение ночи при температуре 4 ° С, анти-мышиного антитела IgM (Южный Biotech), 10 мкг / мл в PBS.
  6. Аспирируйте избыточный буфер и мыть чашки Петри с 3-кратным PBS.
  7. Добавить A2B5 антител (Millipore) в концентрации 5 мкг / мл разводят в PBS и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре (RT).
  8. Промыть пластины снова 3x с PBS затем добавить 8 мл среды стеклопластика для предотвращения высыхания плиты.
  9. Передача 5 мл среды ВРП от чашки Петри и клеток урожай ВРП, очищая колбах с резиновыми полицейский отделить все клетки
  10. Растереть клеточной суспензии кратко, чтобы разбить сгустки и передачи 5 мл суспензии клеток в A2B5 покрытием бактериологических чашках Петри.
  11. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре без встряхивания.
  12. Через 1 час аспирата СМИ и мытья плиты 8x с PBS.
  13. Аккуратно очистить клетки с резиновой полицейский в 2 мл GRP медиа затем передать PLL / ламинин покрытие пластин или колбы с соответствующим объемом среднего ВРП.

    7. Замораживание и хранение клеток, полученных из

    1. Клетки собирают с 85-90% сливной T25 или T75 колбе с 2 мл 0,05% трипсина.
    2. Трипсин разбавляется и инактивируется с 8ml среднего акции ВРП и центрифугировали при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин.
    3. Гранулы из колбы T25 ресуспендировали в 1 мл ВРП замерзания среды (ВРП акции среде с 10% (объем / объем) ДМСО и, возможно, 20% FBS). Чем больше гранул из T75 колбы разбавляют в два раза.
    4. Клеточные суспензии 1,5 - 3 х 10 10,11,12,13 клетки переносятся в криогенной флаконах (Nalgene) и сохраняется в течение ночи в криогенный контейнер (Nalgene), содержащий изопропиловый спирт при -80 ° C медленно заморозить на ночь.
    5. После замораживания клетки быстро переходят в морозильнике ящики и хранить от 6 месяцев до 1 года при температуре -80 ° С или долгосрочной перспективе в N (L). Талая клетки, как правило, 60-80% жизнеспособных значительной степени зависит от качества PLL / ламинин покрытия.
    8. Представитель Результаты

    CO 2 не используется для анестезии животных в связи с возможным вниз влияние на жизнеспособность плода и в конечном счете производные клеток. Кроме того, это будет очень сложно полностью удалить из оболочек спинного мозга при выводе процедуры, но сочетание ВРП среднего и immunopanning устранит эти быстрорастущие клетки. Кроме того, весь спинной мозг собирается, несмотря на большую вентральной концентрации населения ВРП благодаря происходящих в брюшной спинного мозга и спинной миграции 20. Однако средний GRP выбирает GRP фенотип и население максимальным по A2B5 immunopanning. После нанесения покрытия тканей спинного мозга, в культурах пробирке инкубируют в течение двух местах или около недели. Через 2 дня в области культуры, клетки различных морфологии можно наблюдать в культуре ткани колбы с указанием гетерооднородности населения, но средний GRP выбирает GRP фенотипа. Эти клетки представляют собой сочетание A2B5 + GRP, E-NCAM + нейронов ограниченной прекурсоров (НРП) и нестина + A2B5-нейроэпителиальных клеток и, возможно, фибронектин + менингеальные клетки. Кроме того, более зрелый фенотип может присутствовать выражение маркеров в том числе и doublecortin Tuj1 для нейронов линии, GFAP в астроцитах и PDGFaR и Galc по линии олиго Для того, чтобы максимально высоко обогащенного ВРП населения от начальной гетерогенных бассейн (рис. 1а), клетки могут быть дважды immunopanned выбрать и ликвидации E-NCAM + клеток с последующим отбором для A2B5 + ВРП населения раз плотность клеток увеличилось до 85-90% слияния в T75 колбы. Эти ВРП клетки сохраняют свою способность стать астроциты несмотря на то что в среде, которая выбирает для олигодендроцитов фенотип, поэтому последующие A2B5 immunopanning могут быть необходимы для поддержания обогащенного ВРП населения. Immunopanning GENERсоюзника дает до 95% A2B5 + клеток, но и для еще большей доходности A2B5 сопряженных магнитных шариков (Miltenyi Biotec Inc) могут быть использованы для обеспечения доходности до 97%. Бдительность в поддержании ВРП культур, таких как закономерные изменения среды позволит свести к минимуму распространение не-GRP типов клеток. Даже в отсутствие BMP-4 астроциты могут быть найдены и обедненного средства массовой информации, в частности, кажется, вызывают дифференциацию астроцитарных фенотипа. Несмотря на то, B27 дополнение содержит три-йодтиронин гормонов (Т3), произошло не наблюдается тенденции к дифференцировке в олигодендроциты населения ВРП, только тогда, когда более высокие уровни T3 добавляют в среде это явление происходит. Тем не менее, Т3 свободный B27 добавки могут быть заменены, если есть беспокойство за загрязнение зрелых олигодендроцитов (рис. 1б). Эти ВРП клетки можно легко определить по их морфологии малых сома с 2 или 3 коротких процессов, но на экране и для других типов клеток, которые могут присутствовать, имmunocytochemistry может быть выполнена для ранее назывался общим развитием и типа клеток специфических маркеров. Там будет часто быть небольшой постоянный населения A2B5-клеток, которые нейроэпителиальных (НЭП) и способна стать либо GRP или NRP. К счастью, больше клеток поддерживается в среде ВРП более вероятно, что среда будет выбрать для фенотипа ВРП.

    Рисунок 1.

    Рисунок 1.) Покрытием клеток спинного мозга гетерогенных морфологии наблюдается через 2 дня в области культуры. Б) Immunopanning максимально высоко обогащенного ВРП населения от начальной гетерогенных бассейн.

Обсуждение

Заболевания центральной нервной системы белого вещества включают в себя большое количество этиологии, в том числе генетических, воспалительных, ишемических и токсических причин 19,21,22,23,24. В то время как рассеянный склероз и васкулопатии являются основной причиной заболеваний белого вещества у взрослых, перивентрикулярной лейкомаляции связанные с преждевременным является наиболее частой причиной травм белого вещества в детстве населения. В целях дальнейшего разграничения механизмов болезни в дальнейшем изучении клеток ofoligodendrocytic линии, которая сильно зависит от перинатальных оскорбление, не требуется. ВРП были изолированы от грызунов эмбрионального спинного мозга и показано, что tripotential в природе, что приводит к олигодендроцитов и астроцитов двух различных популяций, но не дифференцироваться в нейроны 2,25,26. Кроме того, клетки-предшественники олигодендроцитов (OPC), полученных от крыс и зрительного нерва конце эмбрионального или раннего постнатального мозга крыс были продемонстрированы, чтобы созреть в функционирование олигодендроцитов в соответствующих условиях среды 27,28. Кроме того, плода и взрослого человека, полученных OPC были дальнейшие манипуляции в более зрелых олигодендроцитов фенотипов 29,30.

ВРП клетки были изолированы как от спинного мозга крыс и E13.5 E12-13.5 на мышах. У крыс различия были зарегистрированы между спинной и брюшной-клеток, полученных ВРП в ответ на условия, способствующие поколения олигодендроцитов, астроцитов и с вентральной производных ВРП выставке большую склонность к дифференцироваться в более зрелые фенотипов 25,26,28. Это может быть связано с брюшной части спины миграции клеток зарождающейся GRP, которые могли бы быть менее восприимчивы к дифференциации сигналов. Immunopanning позволяет субпопуляции, что выражает A2B5 быть изолированы и собрали для поддержания культуры.

Наши мыши ВРП культур являются производными от общего спинномозговой ткани мозга, что приводит к гетерогенным, объединенные популяции клеток, из которых ВРП клетки выбраны химические (средний) и антитела на основе методов. Хотя наши исследования использовались спинного мозга мыши, полученные ВРП клеток, совсем недавно сообщалось вывод мозга мышей, полученных клеток-предшественников олигодендроцитов, которые также могут превращаться в зрелые олигодендроциты 31. Здесь клеток, полученных изначально культивировали как oligospheres, что с помощью подходящей культуральной среде манипулируют в обогащенном PDGFαR +, OPC населения 31. Наши исследования были направлены на влияние нашей модели гипоксически-ишемического инсульта на клетки в олигодендроциты спектр происхождение от A2B5 +, PDGFαR-GRP предшественников основного белка миелина выражения (MBP +) зрелых олигодендроцитов. В самом деле наша В пробирке Характеристика показывает, эти незрелые клетки зрелой ВРП в MBP экспрессирующие клетки либо в монокультур или во взаимодействии с культурами корковых нейронов. Эти клетки можно манипулировать в культуре в конкретные пути дифференциации для изучения механизмов, участвующих в перинатальном белый травмы вопроса. Есть несколько моделей мышей белых заболеваний вопрос, связанный с клетками олигодендроцитов происхождение и наличие этой группы населения позволяет тщательное расследование механизмов, привести к травме, а также изучить целесообразность возможных вариантов клеточной терапии.

Раскрытие информации

Исследование финансировалось Национальным институтом здравоохранения [NICHD P30HD024061 (АРМ), NINDS K08NS063956 (AF) и R01NS028208 (MVJ)] и Фонд детской неврологии. Содержание этого доклада, несут исключительно их авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального института здравоохранения, DHHS. Авторы не имеют конфликта интересов, имеющих отношение к этому исследованию.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Девин Гарри за его понимание и обратной связи на использование ВРП клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу
DMEM / F12 1:01 Invitrogen 11320033
B27 Invitrogen 17504044
N2 Invitrogen 17502048
RH-FGF-основной Invitrogen PHG0026
Трипсина (0,05%) ЭДТА Качество биологических, Inc 118-087-721
Поли-L-лизин HBr Сигма P1274-25 мг
Ламинин Сигма L2020-1 мг
ДНКазы 1 Сигма DN25

Ссылки

  1. Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis. Developmental biology. 186, 202-202 (1997).
  2. Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells. Developmental biology. 188, 48-48 (1997).
  3. Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system. Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).
  4. Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin. Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).
  5. Goldman, S. A., Windrem, M. S. Cell replacement therapy in neurological disease. Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).
  6. Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination. Glia. 59, 499-499 (2011).
  7. Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).
  8. Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).
  9. Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells. Nature. 362, 453-453 (1993).
  10. Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia. J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).
  11. Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain. Pediatric research. 49, 735-735 (2001).
  12. Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS. Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).
  13. Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16, 675-675 (1996).
  14. Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. Models of cerebral palsy: which ones are best. Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).
  15. Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain. Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).
  16. Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse. Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).
  17. Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40, (2002).
  18. Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes. Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).
  19. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).
  20. Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord. J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).
  21. Deng, W., Poretz, R. D. Oligodendroglia in developmental neurotoxicity. Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).
  22. Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).
  23. Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia. Nature. 438, 1162-1162 (2005).
  24. Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects. Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).
  25. Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function. J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).
  26. Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).
  27. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-390 (1983).
  28. Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins. BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).
  29. Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-439 (2003).
  30. Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter. J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).
  31. Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).

Перепечатки и разрешения

Теги

Выделение спинного мозгаиммунопаннингселективная среда для GRPдиссоциация клетокобработка трипсиномпокрытие PLL-ламининомселекция A2B5криоконсервацияанализ жизнеспособности клеток
Вывод глиальных ограниченной прекурсоров от E13 мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.