Пресинаптических Динамика Допамин в стриатуме мозга Ломтики с быстрой разверткой циклической вольтамперометрии

Краткое содержание

Использование быстрого сканирования циклической вольтамперометрии для измерения электрической вызвала пресинаптических динамики дофамина в полосатом ломтики мозга.

Аннотация

Обширные исследования были направлены на нейротрансмиттера допамина из-за его важности в механизме действия наркотиков, вызывающих зависимость (например, кокаин и амфетамин), роль, которую оно играет в психиатрических заболеваний (например, шизофрения и синдром дефицита внимания с гиперактивностью), и его участие в дегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона. В нормальных физиологических условиях, допамин, как известно, регулирует двигательную активность, познание, обучение, эмоциональное воздействие, и нейроэндокринной секреции гормона. Один из крупнейших плотности дофаминовых нейронов в полосатом теле, которые можно разделить на два различных регионах нейроанатомической известный как прилежащего ядра и хвостатого-путамен. Цель состоит в том, чтобы проиллюстрировать общий протокол для среза быстрое сканирование циклической вольтамперометрии (FSCV) в стриатуме мышей. FSCV является четко определенной электрохимической техники предоставляя возможность измерять выпуск допамина и поглощения в реальном времени в гiscrete регионах мозга. Углеродные волокна микроэлектродов (диаметр ~ 7 мкм) используются в FSCV обнаружить допамина окисления. Аналитические преимущество использования FSCV обнаружить дофамина заключается в расширении временным разрешением в 100 миллисекунд и пространственным разрешением менее десяти микрон, что обеспечивает дополнительную информацию в микродиализа естественных условиях.

Протокол

1. Экспериментальные необходимости

Электрод Изготовление

• Есть множество методов углеродного волокна микроэлектродов изготовления, так как большинство сделаны в доме. Обычно то, что диктует детали изготовления электродов является электрохимический метод, который применяется к электроду (например amperometry против FSCV). Для FSCV, микроэлектродов может быть собственного производства с помощью следующей трехступенчатой ​​процедуры. Для более полного описания углеродного волокна изготовления электродов, см. недавнюю статью Юпитер ^1. Однако учтите, что электроды, описанные ниже, цилиндрические углеродные волокна микроэлектродов, которые требуют меньше шагов для изготовления по сравнению с амперометрического углеродного волокна микроэлектродов из вышеупомянутого протокола. Этот упрощенный протокол не требует кипячения углеродного волокна в ацетоне, пожарные полировки стеклянных капилляров, или с использованием эпоксидных, чтобы запечатать стекловолокном перехода.
• Использование ASPIR вакуумного отсосаел из углеродного волокна (диаметр 7 мкм; Гудфеллоу Oakdale, Пенсильвания) в боросиликатного стекла капилляр с микрофиламентов (длина 10 см, диаметр 1,2 мм, 0,68 мм ID; AM систем, Carlsborg, штат Вашингтон).
• Место резьбовых капилляр в электроде съемник (Narishige, Токио, Япония), где капиллярная вытягивается в два раза. Выходные параметры электрода съемник действительно изменяются от лаборатории до лаборатории. Для сравнения, наш выход параметров съемника являются основным магнитом 90,7, 23,2 суб-магнит, и 53,4 для нагревателя. Выход настройки должны быть эмпирически изысканные для создания стеклянных конуса, что составляет примерно 4,4 мм в длину, с герметичное уплотнение вокруг углеродного волокна.
• Под микроскопом (Olympus, Токио, Япония), отделка из углеродного волокна (используя лезвие скальпеля) простирается от стеклянным наконечником позволяет примерно 50-200 мкм из углеродного волокна, чтобы выступать с плотно закрытыми интерфейс.

Решение Подготовка

Три типа искусственного восковинаbrospinal жидкости (aCSF) решения должны быть подготовлены заранее, все в сверхчистых (18 МОм см) воды.

• Сахароза-aCSF могут быть подготовлены по крайней мере за день до нарезки. Сахароза-aCSF буфер состоит из (в мм): 180 сахарозы, 30 NaCl, 4,5 KCl, 1,0 MgCl _2, 26 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO ₄ и 10 D-глюкозы (рН 7,4) и должна быть кислородом использованием 95 % O ₂ / 5% CO ₂ в течение 15 минут ^2. Если подготовленные заранее, решение может быть сохранен в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 1 недели.
• ACSF решение для вольтамперометрии записи должны быть готовы в день эксперимента. Решение состоит из aCSF (в мм): 126 NaCl, 2,5 KCl, CaCl 2,4 _2, 1.2 ₂ MgCl, 25 NaHCO _3, 1,2 NaH ₂ PO _4, 11 D-глюкозы, 0,4 аскорбиновой кислоты (рН 7,4). В ходе эксперимента, кислородом путем пропускания с 95% О2 / 5% CO ₂ при комнатной температуре.
• Modified-aCSF решение для калибровки электродов содержит (в мм): 2,5 KCl, 126 NaCl, 1,2 NaH _{2 4} PO, 2,4 ₂ CaCl, 1,2 MgCl ₂ и 25 NaHCO ₃ (рН 7,4) и может быть сохранена на срок до одной недели, без охлаждения или оксигенации.

Электрод калибровки

• Электрод жизнеспособность и чувствительность определяется до и после калибровки, соответственно, используя поток "Т-клеток", содержащий 3 порта с закрытой электрода сравнения (Ag / AgCl). Сфабриковано микроэлектрода опускается в поток "Т-клеток". Входной порт подключен к шприцевой насос, обеспечивая непрерывный поток модифицированной aCSF со скоростью 2 мл / мин. Третий порт "Т-клеток" подключается к шприц с 3 мкМ дофамина, сделанные в модифицированной-aCSF.
• Для предварительного калибровки, позволяет изменение aCSF решение поступать в течение 3 - 7 секунд, а затем вручную вводят 1-2 мл 3 мкМ дофамина стандарта. Для каждого электродабыть предварительно откалиброван, повторить калибровку по крайней мере 3 раза, а средняя максимальная токов, полученных от каждого.
• Сразу после эксперимента вольтамперометрии ломтик (см. раздел 3), электрод после калиброванного таким же образом, как описано выше.
• Калибровочный коэффициент (в дальнейшем используются при анализе данных) определяется путем деления средней окислении дофамина тока (нА) путем концентрации дофамина стандарта. Например, текущий ответ делится на 3 при использовании 3 мкМ дофамина стандарта.

2. Фрагмент подготовки

1. Налейте 10 мл сахарозы aCSF в небольшой стакан и положите в ведерко со льдом. Кроме того, место мгновенный клей (Loctite 404) в ведерко со льдом, в пределах досягаемости.
2. Подготовка лезвие бритвы и необходимые инструменты, необходимые для вскрытия, таких как щипцы, лопаточки и ножницы,, протирая их протрите спиртовым площадку.
3. Жертва мыши СО ₂ удушья в небольшой ча газаmber, после чего немедленно обезглавливание использовании острых ножниц. Быстро удалить весь мозг. Место мозга в стакан ледяной сахарозы aCSF в течение примерно 10 минут.
4. В то же время, подготовить Vibratome для нарезания. Во-первых, место некоторые колотого льда в образце ванну. Поместите образец камеры и затянуть, чтобы держать это твердо в месте. Добавить еще лед вокруг образца камеры, чтобы заполнить пробелы, убедившись, что никакого льда попадает в камеру. Положите вымытую лезвие в лезвие держатель на Vibratome и заполнить образец камеры с ледяной сахарозы aCSF.
5. Чтобы создать рабочую поверхность для подготовки мозга, налить холодной aCSF сахарозы на кусок бумажного полотенца, который был размещен на перевернутой чашки Петри. Использование щипцов передачи мозга на подготовленную чашку Петри. Для корональных ломтиками, вырезать мозжечка по средне-поперечной оси при помощи лезвия бритвы и выбросьте. Это создает плоским основанием, которое может быть прикреплена к Vibratome стадии.
6. Местокаплю клея Loctite (помещенный в ведерко со льдом во время Шаг 1) на образце стадии. Сразу же, наносит плоский конец подготовлены мозга на сцену, держа его вертикально, как это возможно. Место этап в образце камеры и затяните винт, гарантируя, что мозг полностью погружается в сахарозы aCSF в камере.
7. Использование элементов управления на передней панели Vibratome настроить этапе, с тем, что лезвие одной линии с верхней части мозга. Оптимальные параметры для Vibratome получаются путем установки частоты и скорость низкая. Нижняя скоростях предпочтительнее, чтобы минимизировать силу лезвие от давя мозга, которая наблюдается на высоких скоростях. Толщина среза установлен в 400 мкм.
8. Первые несколько ломтиков не будет содержать полосатом теле. Повторите нарезки ломтиками содержащие до полосатого тела получаются. После полосатой будет достигнута область (утверждено анатомических ориентиров), используйте кисть поднять ломтик и положите в стакан скислородом, при комнатной температуре aCSF. Как правило, можно получить от 3 до 4 ломтика содержащие полосатой комплекса, так что хвостатого-путамен и прилежащем ядре включены.
9. Разрешить ломтиками, чтобы акклиматизироваться в aCSF кислородом при комнатной температуре не менее 1 часа, прежде чем использовать для экспериментов.

3. Вольтамперометрическое записей из кусочков

Хотя ломтиками высиживания, камера ломтик запись может быть подготовлен.

1. Возьмите трубку подключенного к погружению камеры записи (Custom Научные, Denver, CO) и место в кислородом, при комнатной температуре aCSF. Установить перфузии насоса (Watson Marlow Limited, Фалмут, Англия) для скорости потока 1 мл / мин. Установить регулятор температуры до 32 ° C. После aCSF заполняет заказ часть держателя (изменение сетки диск стадия), подготовить его для среза, удаляя пузырьки воздуха с помощью иглы шприца (BD спинного иглы).
2. Премьер срез ванны, опираясь на вакуумныеОтток трубки (что приводит к стеклянной бутылке жидкость отходы) с помощью шприца для запуска потока. Место kimwipe выступать в качестве фитиля на краю среза держатель для контроля переполнения буфера.
3. После 1 часа инкубации, передачи ломтиками, чтобы часть держателя в записи камеры, которая постоянно озарен 95% O ₂ / 5% CO ₂ комнатной температуре aCSF.
4. Погрузитесь Ag / AgCl электродом сравнения в срезе держатель (приклеенный к крышке часть камеры) и подключите электрод использованием крокодил в голове сцены.
   • Ag / AgCl электродом сравнения могут быть сделаны в доме путем анодирования (+1 V) 250 мкм серебряной проволоки (AM Systems, Carlsborg, WA) в 1 М HCl в течение 5 минут для нанесения тонким слоем AgCl на поверхности серебряной проволоки.
5. Нижняя вольфрамовым электродом стимулирующие (пластмассы Один из них, Роанок, Вирджиния) к поверхности полосатой срез мозга. Стимулирующий электрод вступает в контакт с ломтиком как она покоится на вершинеоб этом, но не следует прокалывать срез. В нашей экспериментальной установки, стимуляции генерируется стимулятор Neurolog.
6. Углеродного волокна рабочие микроэлектрода снова заполнены 150 мМ KCl решения с использованием BD спинного иглы. Провода затем вставляется (Squires Электроника, Корнилий, OR), которая соединена с головой этапе низким уровнем шума ChemClamp потенциостате (Даган Корпорации, Minneapolis, MN) с использованием крокодил. Рабочий электрод помещается примерно 100 - 200 мкм от биполярного стимулирующих электродов, около 75 мкм глубоко в срез.
7. Электростимуляции, используя либо один (монофазные, 350 мкА, 60 Гц, и 4 мс ширина импульса) или несколько (например, 5 импульсов, 350 мкА, 20 Гц и 4 мс в ширину) импульсов, доставляются стимулирующий электрод, чтобы вызвать нейромедиатор выпуск ^3.
8. Для измерения электрической вызвала допамина использованием FSCV, форма волны треугольника, подаваемого на электрод. Типичные параметры для допамин обнаружения: потенциал микроэлектрода углеродного волокна проводится в сравнении с -0,4 V Ag / AgCl электродом сравнения, сползали к положительному пределу +1.2 V, а затем вернули до -0,4 В при скорости сканирования 400 В / с .
9. Срез электрической стимуляции через каждые 5 минут и вольтамперометрии измерений в результате истечения дофамина производится в течение 15 секунд.
10. После по меньшей мере три устойчивых электрической стимуляции высвобождения дофамина записи (разница между максимальной высоты <10%), aCSF содержащих фармакологических агентов интересов перфузии при скорости потока 1 мл / мин над сектором в течение 30 минут для получения максимального эффекта. Электрически стимулировать записи дофамина осуществляется каждые 5 минут во время фармакологических перфузии.

4. Анализ данных

Результат тока от времени следы полученных из среза может быть пригодным к нелинейной регрессии для набора Михаэлиса-Ментен основан уравнений, как описано Вайтманаи коллегами в программное обеспечение, написанное в LabVIEW (National Instruments, Остин, Техас) ^4-6. В это программное обеспечение, тока от времени следы могут быть установлены путем изменения двух параметров, _макс (нМ / с; соответствующая скорость поглощения переносчика дофамина о чем свидетельствует нисходящей фазе луч) и дофамина концентрация в импульсе (нМ ; соответствующий пик максимальной высоте). Величина К _м, отражает близость допамина для переносчика дофамина, устанавливается до 160 нМ и не изменился. Пост-калибровочный коэффициент электрода, которая определяется после проведения эксперимента требуется до монтажа. Программное обеспечение LabView содержит коэффициент детерминации (R ²⁾ параметр для определения критерия согласия (R ² значения> 0,8 используются).

5. Представитель Результаты

FSCV был использован для изучения одиночных импульсов, электрически стимулировать высвобождение дофамина и поглощения в хвостатое кластьаминь (CPU), прилежащем ядре (NAC) ядро, а НАК оболочки у мышей. Представитель результаты, показанные на рисунке 1А продемонстрировать текущее (или концентрации) в зависимости от времени сюжеты. Красная стрелка указывает, когда электрическая стимуляция применяется к срез сопровождается соответствующим ростом количества тока, вызванное изменением концентрации дофамина в микроэлектрода из углеродного волокна. Преобладающим процессом при электрической стимуляции высвобождения дофамина, но и другие процессы, такие как поглощение и диффузия вклад в общую высоту наблюдается пик, а также. Нисходящей фазе пика в первую очередь обусловлено обратного захвата нейромедиаторов его транспортер с нейронной стимуляции был остановлен ^7. Тем не менее, пик распада не ограничивается обратного захвата, как диффузия и обмена веществ также способствует уменьшению тока. Высказывалось предположение, что, поскольку временная шкала измерений электрохимических считанные секунды, FSCV слишком быстр для измерения contributioнс от обмена веществ ^7. В этих тока от времени следы, ось у преобразуется в концентрацию (мкМ) с помощью пост-калибровочный эксперимент фактор. На вставке к рисунку 1А соответствующего фона вычитается циклических вольтамперограммы для тока от времени следы. Построение измеряемого тока (ось у) против приложенного потенциала на электрод (ось х), дофамин является химически отождествляется с наблюдается пик окисления при +0,6 В и соответствующего пика снижение допамина-орто-хинон наблюдается при - 0,2 В по сравнению с Ag / AgCl электродом сравнения. Третье представление данных использует трехмерный псевдо-цвет участка (рис. 1В), объединяющих информацию от обоих тока от времени следы и циклических voltammogram в единый сюжет. В представитель псевдо-цвет сюжет, время строится в секундах по оси абсцисс, приложенного напряжения для углеродного волокна рабочие микроэлектрода на графике вдоль оси ординат, и ток представляется в виде ФАЛсебе цвет по Z-оси. Из-за небольшого размера из углеродного волокна микроэлектродов (~ 7 мкм в диаметре), электрически стимулировать динамику дофамина может быть обнаружено в дискретных анатомических регионов стриатуме (CPU по сравнению с НАК ядро ​​по сравнению с НАК оболочки; рис. 2).

Преимущество использования полосатой корональных ломтиками является то, что он устраняет взносов допамина органов клетки, и дает возможность исследования динамики пресинаптического дофамина. Пресинаптических контроль высвобождения дофамина и поглощение не является строго ограничено допамина ауторецепторов или транспортер функции, что и другие показали ^{16, 17.} Heteroreceptors других систем нейротрансмиттер допамин также модулировать динамику ^{18, 19.} Представитель тока от времени следы показано на рисунке 3А продемонстрировать, что, когда срезы обрабатывали 1 мкМ quinpirole (D2/D3 рецепторов) в течение 30 минут, уменьшение электрически вызвал высвобождение дофамина наблюдается. С другой стороны, когда субстратдля переносчика дофамина, такие как метамфетамин, является перфузии над сектором в течение 30 минут, никакой разницы в высвобождение дофамина наблюдается (рис. 3В). Пик распада смещается вправо, что, как правило, связаны с изменениями в допамин кинетики транспортер (К _м) ^3. Наконец, на рисунке 3C является представителем следов тока от времени следы когда-то срез был купались в 100 нг / мл мозга нейротрофического фактора (BDNF) решение, была выдвинута гипотеза, влиять на высвобождение дофамина ^{20 динамика, 21.} С этого представитель следа, можно видеть, что BDNF обладает способностью усиливать электрический вызвало высвобождение дофамина. Взятые вместе, эти фармакологические методы лечения подчеркнуть полезность FSCV, чтобы исследовать динамику дофамина в полосатом теле.

Основное ограничение использования мозга ломтиками исследовать динамику пресинаптического дофамина FSCV в том, что neurocircuitry с интактным мозгом теряется.С ломтиком FSCV невозможно, чтобы изучить эффекты нейротрансмиттеров из других областей мозга, что делает его трудно понять, вклад этих систем на функциональные области расследуется (например, полосатого тела), или оценить, не стимулировали уровни допамина. Тем не менее, последние технические достижения в области FSCV позволило допамина переходных измерений (с учетом и без электрической стимуляции) в свободно движущейся крыс в ответ на фармакологические манипуляции, самоуправления, или новизны ^{22 - 24.} В целом, ломтик FSCV дает ценную информацию о динамике пресинаптического дофамина и связь результатов ломтик FSCV для дополнительных методов, таких как нейрохимические микродиализа, электрофизиологии, и / или свободно движущиеся FSCV предлагает более полное представление о функционировании нейротрансмиттеров в головном мозге.

Рисунок 1. Электроприводом вызвала допаминэлектронная версия измеряется с помощью FSCV следующие одиночных импульсов возбуждения в спинном ломтиками процессора от мышей C57BL/6J. (А) концентрации в зависимости от времени след в которых высвобождение дофамина вызвали одного импульса (красная стрелка). Единственная звездочка представляет факторов, которые способствуют росту концентрации, которые, в основном, высвобождение дофамина, но поглощения и диффузии также внести свой вклад. Две звездочки представляет пик сигнал возвращается к исходному уровню, в основном за счет поглощения, но и способствует диффузии. Врезка показывает соответствующий вольтамперограммы циклической. (B), представитель цвет участков из спинной отображения времени ЦП (ось абсцисс), приложенного потенциала для микроэлектрода углеродного волокна по сравнению с Ag / AgCl электрод сравнения (у-оси), и ток в псевдо-цвет.

Рисунок 2. Высвобождение дофамина вызваны одной электрический импульс стимуляции (обозначен красной стрелкой) в активной зоне NACи оболочки от мышей C57BL/6J. (А и С) в зависимости от времени концентрации следов и соответствующие им вольтамперограммы циклические (вставка) от НАК ядра и оболочки. (В и D), как описано ранее, представитель участков цвет от НАК ядра и оболочки.

Рисунок 3 представителя следов после среза обрабатывают фармакологического агента в течение 30 минут;. Во всех случаях, одиночный импульс был использован, чтобы вызвать высвобождение дофамина в центральный процессор. () Применение агонистов дофаминовых D2 рецепторов, quinpirole (красная линия) по сравнению с предварительной обработкой (черная кривая). (B) Метамфетамин перфузии (фиолетовая линия) по сравнению с предварительной обработкой (черный след). (C) способность мозга нейротрофического фактора влияния дофамина динамика (синяя линия) по сравнению с предварительной обработкой (черная кривая).

Обсуждение

Протокол, представленные здесь демонстрирует, как подготовить и использовать мышь корональных ломтики мозга для экспериментов FSCV. Хотя этот способ можно использовать для получения и измерения динамики допамина, других нейротрансмиттеров, таких как аденозин, перекись водорода, норадреналина и серотонина были контролироваться в естественных условиях или в пробирке с ^{3 FSCV, 8 - 11.} FSCV может быть использован для мониторинга некоторые из этих других нейрохимических веществ простой модификаци...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Имя	Компания	CAS номер
Реагент
Хлористый калий	Рыболов	7447407
Хлористый натрий	EMD Химические вещества	7647145
Хлорид магния	Рыболов	7791186
Хлорид кальция	Рыболов	10035048
Бикарбонат натрия	EMD Химические вещества	144558
Натрия фосфат, Диаммоний	EMD Химическаяы	7558794
D-глюкозы	Рыболов	50997
Аскорбиновая кислота	Рыболов	50817
Сахароза	Рыболов	57501
Материалы	Продавец	Номер по каталогу
Углеродные волокна	Гудфеллоу Oakdale, Пенсильвания
Стеклянный капилляр	AM Системы Carlsborg штат Вашингтон.	602000
Серебряная проволока	-M Системы Carlsborg штат Вашингтон.	787000
Вольфрам стимулирующий электрод	Пластмассы Один из них, Роанок, Вирджиния
Платиновая проволока
Ведущий проволоки	Сквайрс Электроника, Корнилий, ИЛИ
Loctite 404 мгновенного клея	Hankal Корпорация Rocky Hill CT.
Бритва	Всемирный точные инструменты Инк FL.
BD спинного игла	BD Medical Systems, Franlin озеро, Нью-Джерси	REF 405234
Хирургическое Клинка	Перо безопасную бритву Ко LTD. Япония
Программное обеспечение	Продавец	Номер по каталогу
TH программного обеспечения	ESA Inc, Челмсфорд, Массачусетс
Инструмент	Продавец	Номер по каталогу
Погружение камеры записи	Custom Научные, Denver, CO
Neorolog стимул изолятор	Digitmeter, Хартфордшир, Англия
Автоматический регулятор температуры	Warner Instrument Corporation
Микроскоп (SZX7)	Олимп
Микроскоп	Рыболов
Vibratome 3000 секционирования системы	Санкт-Луесть, МО.
Перфузии насоса	Уотсон Marlow Limited, Фалмут Корнуолл - Англия	H110708
Микропипетки съемник	Narishige, Токио, Япония
ChemClamp потенциостате	Даган Корпорации, Minneapolis, MN.