Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение γHV68 инфекции у мышей

12.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3472

⸱

22 ноября 2011 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

γ-Herpesviruses (γ-HVS) устанавливает пожизненное настойчивость в их хозяина. Заражение мышей с γ-HV68 обеспечивает генетически послушный В естественных условиях Модели для характеристики жизненного цикла / патогенезе γHVs. Этот протокол описывает обнаружения и количественного определения γHV68 инфекции при острых и латентных стадиях после заражения бляшкообразующих, инфекционный центр, и КПЦР анализов.

Аннотация

γ-Herpesviruses (γ-HVS) отличаются способностью устанавливать скрытые инфекции лимфоидных клеток 1. Узком диапазоне множество человеческих γ-HVS, таких как ВЭБ и KSHV, серьезно препятствует детальные исследования патогенных. Мышей γ-герпесвирусов 68 (γHV68) акций обширные генетические и биологические сходства с человеческим γ-HVS и является естественным возбудителем мюрид грызунов 2. Таким образом, оценка γHV68 заражение мышей инбредных линий на разных стадиях вирусной инфекции служит важной моделью для понимания вирусной жизненного цикла и патогенез при γ-HVS инфекции.

После прививки интраназально, γHV68 инфекция приводит к острой виремии в легких, который позже решил в латентной инфекции спленоцитов и других клеток, что может быть возобновлен в течение всего срока хост 3,4. В этом протоколе мы опишем, как использовать доску анализа для оценкис инфекционным титром вируса в легких гомогенатах на Веро монослоев ячейки на ранней стадии (5 - 7 дней) после интраназального заражения (точек на дюйм). Хотя острой инфекции в значительной степени очистили 2 - 3 недели postinfection, латентной инфекции из γHV68 установлено около 14 точек на дюйм и поддерживаться в дальнейшем в селезенке мышей. Скрытая инфекция обычно поражает очень небольшой популяции клеток в инфицированных тканях, при этом вирус остается бездействующим и отключает большую часть своей экспрессии генов. Латентно-инфицированных спленоцитов спонтанно активировать вирус на культивирующий в искусственной среде в культуре ткани, которая может быть кратко изложил на инфекционный центр (ИЦ) анализа для определения вирусной нагрузки скрытой. Для дальнейшей оценки количества вирусных копий генома в острой и / или латентно инфицированных тканей, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) используется для его максимальной чувствительности и точности. Комбинированный анализ результатов КПЦР и налета анализа и / или IC анализ покажет пространственно-временные профили вирусногорепликации и инфекционности в естественных условиях.

Протокол

Следующий протокол будет описывать изучение вируса титры и вирусной нагрузки генома в литический и латентной инфекции цикл γHV68 у мышей, которые теоретически могут быть использованы для оценки заражения другими вирусами с похожими образ жизни, что и γHV68.

1. Усиление γHV68

  1. Оттепель замороженных флакон γHV68 в 37 ° С водяной бане.
  2. Добавить к вирусным inoculums NIH3T12 или культуры клеток 3T3 (~ 50% слияния) в 10 см блюда и культуры инфицированных клеток при 37 ° С в 5% СО 2.
  3. Изучение культуры микроскопии для цитопатический эффект (ЦПЭ) и сбор средств массовой информации в период, когда более 80% клеток показывают, CPE, 4 ~ 5 дней после заражения. Для максимального выхода вируса, инфицированные культуры клеток можно заморозить-и-талого дважды, чтобы освободить всех клеточно-ассоциированных γHV68.
  4. Центрифуга собранных средств массовой информации при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре (RT), чтобы удалить ячейку мусора.
  5. Тщательно передачи супернатантах к новой трубы (высокоскоростной центрифуге трубки), не касаясь ячейки мусора на дне.
  6. Высокоскоростные центрифуги при 12000 оборотов в минуту (для Sorvall SA-600) при температуре 4 ° С в течение не менее 1,5 часов, чтобы сосредоточиться вирусных частиц.
  7. Отменить супернатанты в 10γ отбеливающим раствором и тщательно повторно приостанавливать гранул (вирус и остаточного мусора ячейки) с 1 мл бессывороточной DMEM. Передача ресуспендировали гранулы в 1,5 мл микро-центрифуге трубки и хорошо перемешать на вортексе.
  8. Центрифуга в течение 2 мин при максимальной скорости для удаления остатков мусора клеток и передачи супернатант (вирус акций) в новую пробирку. Это последняя вирусная акция для инфекции. Титр вируса акции определяется доска анализа (см. ниже).

2. Интраназально Заражение мышей с γHV68

  1. Infect мышей при ~ 6-недельного возраста с 1000 ~ 5000 бляшкообразующих единиц (БОЕ) в γHV68 на мышах.
  2. Анестезироватьмышей на инъекции кетамина / ксилазина (60 мкл / мышь из смеси 80 мг / мл кетамина и 12 мг / мл ксилазина) в брюшную полость. Монитор анестезии, зажимая мышей ног. Обычно это занимает ~ 5-10 мин. Если мышь не в полной мере под наркозом, то они будут чихать вируса.
  3. При наведении курсора мыши полностью под наркозом, использование пипетки привить ~ 30 мкл PBS содержащие γHV68 (15 мкл в каждую ноздрю) мышам капельный медленно, но неуклонно. Убедитесь, что мышь действительно вдыхание капель, не пытаясь форме пузырьков.
  4. Разрешить мыши для восстановления в течение 10-15 мин и контролировать благополучие мышей (например, сознание, дыхание и т.д.) перед их возвращением в клетку. Животные проверяются ежедневно в течение болезни и адекватности пищи, воды и постельные принадлежности условиях. Если клинические признаки болезни, боль или страдание развиваться, рутинной диагностики для определения этиологии будет проводиться. Животные, которые теряют более 20% своего веса будет записан для максимального снижения весаи эвтаназии. Окончательное решение о проведении эвтаназии по усмотрению клинического ветеринара и производится после консультации с главным исследователем.

3. Зубной налет Пробирной для определения титра вируса в зараженных Остро Легкие

  1. Титр вируса инфекционной определяются образование бляшек на монослоев клеток Веро.
  2. Веро клетки высевают на 2.5x10 4 клеток / лунку в 12 хорошо пластин день до доски анализа. Камеры должны быть равномерно распределены и плотность клеток должна достигать 30 - 40% в день налета анализа.
  3. Подготовка 0,5% (вес / объем) метилцеллюлозы (МЦ) наложение среде (табл. 1).
  4. Жертва γHV68-инфицированных мышей через 5-7 дней после интраназального инфекции для определения острой фазы титр вируса в легких. Для euthanization Кетамин HCl (80-100 мг / кг подкожно, IM, IP) будут администрируемых IM последующей внутривенной передозировки Na пентобарбитала (30-50 мг / кг, IP). Этот метод утвержден тон Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации.
  5. Урожай легких и полоскать два раза с 1 х PBS для удаления клеток крови. Сбор одной стороны легких в 1 мл ледяной полной среде DMEM и держать на льду. Быстрое замораживание другой стороны легких и хранить при температуре -80 ° С для изучения вирусной нагрузки ДНК в легкие КПЦР (см. ниже).
  6. Использование ткани гомогенизатор для гомогенизации ткани легких при максимальной скорости в течение 1 сек, замораживания-оттаивания и в три раза. Вымойте гомогенизатор с 70% этанола на каждом шагу при смене образца.
  7. Центрифуга гомогенизированных тканей при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин при 4 ° C. Сбор супернатант и перехода на новые трубы для доски анализа.
  8. Подготовка серийных разведений (обычно от 10 ° до 10 -8) легких гомогената образцов в 1,5 мл микро-пробирок с простым DMEM от вихря. Заполнять соответствующее количество труб с 540 мкл DMEM и разбавленных 60 мкл гомогената в первые трубки. Передача 60 мкл из первой трубки яНе следующий, и так далее.
  9. Аспирируйте средств массовой информации из подготовленных Веро монослоев в 12-луночных планшетах и нагрузка 200 мкл / лунку последовательно разбавлены гомогената, содержащие инфекционные вирусы в обратном порядке (от 10 -8 до 10 °). Использование двух скважин для каждого титрования (в двух экземплярах).
  10. Инкубируйте Веро клетки с вирусом inoculums 1 час при температуре 37 ° C. Аккуратно водоворот пластин каждые 15 минут, чтобы равномерно распределить вирус на монослой.
  11. Удалить inoculums и заменить его на 2 мл / лунку наложения среде (табл. 1). Инкубируйте пластин в течение одной недели при температуре 37 ° C.
  12. Удаление наложения среды (не нужно быть полным) и заменить исправить / пятно среде доска анализа (табл. 1) и инкубировать в течение по крайней мере на 1 час при комнатной температуре.
  13. Когда пластины сушат, подсчитать количество хорошо изолированных бляшек на каждого разведения. Чтобы свести к минимуму ошибки, только скважин, содержащих от 10 до 100 бляшек, подсчитываются.
  14. Рассчитать титр вируса использованием ФоллоКрыло формуле: титр (БОЕ / мл) = [(число бляшек / а) / (Объем inoculums / а)] х коэффициент разведения.

4. Инфекционные Пробирной центр для определения вирусной нагрузки в латентно инфицированных Спленоциты

  1. Вирусная нагрузка скрытой определяется инфекционный центр (ИЦ) анализ на монослой клеток Веро. Накануне IC анализа, семена клеток Веро в 6-луночных планшетах (1 -. 2,5 • 10 5 клеток / лунку Мы обычно используем 11 скважин в селезенке образца, 10 скважин будут использованы для серийно разведенной суспензии спленоцитов и одной скважины для тестирования спонтанной реактивации вируса после циклов замораживания-оттаивания.
  2. Жертва инфицированных мышей после задержки устанавливается (12 - 14 дней после заражения). Урожай селезенки мыши и бассейном их в 1 мл охлажденной DMEM.
  3. Механическая диссоциация мыши селезенки. Передача свежевыделенных селезенки мышей в 10 см тарелку и добавить 10 мл желаемого среде, такой как DMEM с 2% ЭТС. Влажные два матовое стекло класса microscОПЕ слайды с ледяной среде. Место селезенки на стороне матового одного слайда и ник капсула с краю замороженный конец другой слайд. Механически отделить селезенку между двумя слайдами, пока все красные сгустки измельчаются (также удалить жировые частицы, если имеется).
  4. Промыть слайды с DMEM восстановить оставшиеся клетки с обеих слайдов.
  5. Передача всей подвески ткани мягко через ячейки сетчатого фильтра (40 мкм нейлоновая сетка) в 50 мл коническую завинчивающейся крышкой трубки. Вымойте 10 см блюдо с селезенкой гомогенатах с 10 мл PBS и передачи при фильтрации.
  6. Центрифуга одного клеточные суспензии, 10 мин при температуре 375 мкг и отбросить супернатант. Флик ячейки гранул, чтобы разбить существующие сгустки клеток. Добавьте 5 мл ACK буфера (табл. 1) для лизиса эритроцитов. Выдержите 5 минут и снова центрифуге при 375 х г.
  7. Удалите супернатант и вновь приостановить гранулы, тщательно, но осторожно, в PBS с 2% ЭТС. Держите клетки при 4 ° C. Используйте пипеткуудаления мусора, если таковые имеются. Граф жизнеспособные клетки, используя автоматический счетчик клетки (Bio-Rad).
  8. Спином вниз PBS-ресуспендировали спленоцитов в 375 мкг в течение 4 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 4 мл полной DMEM (2 х 1 мл будет использоваться для IC анализа исходной суспензии, 0,6 мл использовать для последовательного пять раз растворение в анализе IC, 0,4 мл для вирусной ДНК и подготовка КПЦР, и 1 мл суспензии будет использоваться для оценки спонтанной реактивации латентного вируса после трех циклов замораживания-оттаивания)
  9. Подготовка серийного пять раз разведения (т.е. 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250) спленоцитов суспензии в дубликатов. Заполнять 15 мл конические пробирки с 2,4 мл DMEM и разбавьте 600 мкл суспензии спленоцитов в первой пробирке и хорошо перемешать. Передача 600 мкл от предыдущих трубку в следующем трубки и т.д. Не вихрь!
  10. Аспирируйте среды от подготовлены 6-а монослой клеток Веро. Семенной 1 мл серийно разбавленного спленоцитов на Vero клетках с каждого разведения duplicated (10 скважин будут использованы для 0, 1 / 5, 1 / 25, 1 / 125, 1 / 250 разведения).
  11. Инкубируйте пластин 8-12 часов при 37 ° С и 5% CO 2. Не превышать 24 часов. Аспирируйте подвески посеяны спленоцитов и нагрузки 4 мл наложения средств массовой информации (табл. 1) в каждую лунку. Инкубировать 6 дополнительных дней.
  12. Определить уровни селезенки инфекционных центров окраски плит с 0,2% (вес / объем) кристаллический фиолетовый, как показано в зубном налете анализа.

5. Количественная оценка вирусного генома

  1. Извлечение общей геномной ДНК из γHV68-инфицированных тканях, таких как рак легких и селезенки образцы в этом эксперименте. Используйте DNeasy крови и тканей Kit (Qiagen), следуя протоколу производителя.
  2. Определение концентрации ДНК каждого образца, чтобы обеспечить такое же количество ДНК используется для анализа КПЦР. Дизайн вирус-специфических праймеров (~ 200 б.п. ампликона является предпочтительным для анализа КПЦР). Мы использовали γHV68 ORF56-специфических праймеров (прямого праймера: 5 и пр.IME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3 '; обратный праймер: 5'-CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG-3') для этого анализа и β-актина праймеров (прямого праймера: 5'-cacccacactgtggcccatcat-3 'обратный праймер: 5'-gtgaggatcttcatgaggtagtc-3'), как контроль за реакцией КПЦР.
  3. Смешайте образец ДНК (100 - 500 нг хорошо), и соответствующие грунтовки с 2-х SYBR мастер смеси (Bio-Rad IQ SYBR Green Supermix). Используйте Bio-Rad ПЦР в реальном времени системы для количественного определения вирусной нагрузки в пораженных тканях. Выполните ПЦР на следующие условия: 95 ° C в течение 15 мин и 45 циклов 95 ° C в течение 30 мин, 60 ° С в течение 30 мин и 72 ° С в течение 30 мин, после чего кривая плавления анализ, как для вирусных и актина ампликонов.
  4. Для стандартной кривой для количественного определения вирусного генома, серийно разбавленного известные количества γHV68 bacmid ДНК с геномной ДНК, выделенной из неинфицированных клеток. Запуск КПЦР параллельно с ДНК извлекается из инфекцийТед тканей с использованием того же набора вирус-специфических праймеров.
  5. Настоящий вирусная нагрузка генома в тканях, как вирусная числа копий ДНК на единицу (например, 100 нг или 500 нг) геномной ДНК после актина нормализации.

6. Представитель Результаты:

На рисунке 1 представлена ​​общая схема экспериментов для измерения γHV68 инфекции у мышей в естественных условиях. Представитель результаты вируса титры в легких во время острой инфекции из γHV68, как это определено доска анализа, были показаны на рисунке 2А. Мутантного штамма γHV68 содержащие нефункциональные вирусных Bcl-2 (vBcl-2) реплицируются на уровне, сопоставимом с диким типом γHV68 в легких после 7 дней интраназального заражения BALB / с мышей (6 - 7 мышей в группе). Никаких статистически значимых различий в легких титры вируса были обнаружены между двумя группами. Эти данные показывают, что vBcl-2 не является решающим фактором для острой инфекции из γHV68 вмышей. Тем не менее, на 28 postinfection дней титр vBcl-2 мутант вируса в селезенке упал 6 - до 10 - раза по сравнению с WT, если судить по инфекционным центром анализа (рис. 2В), предполагая, что vBcl-2 мутант вируса γHV68 неисправен в поддержании селезенки задержкой после заражения. В соответствии с уменьшенным инфекционных титров центр, вирусная нагрузка генома vBcl-2 мутант вируса значительно сниженным по сравнению с WT вирусов на 28-й день в повторных экспериментах, как показано на рис 2С. Тесная взаимосвязь между вирусной нагрузкой генома и частота скрытого HV68vBcl-2 мутант вируса реактивации исключая виво в латентной стадии инфекции подчеркивает задержки недостаток этого мутанта вирусной инфекции.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема для измерения γHV68 инфекции у мышей с помощью зубного камня, инфекционный центр, и КПЦР анализаs.

Рисунок 2
Рисунок 2. Литические и латентной инфекции WT и мутантных γHV68 вирусов в естественных условиях. Острый репликации (А) WT и мутантных vBcl-2 γHV68 вирусов в легких мышей BALB / C мышей на 7 точек на дюйм (день после инфекции) определялось доска анализа. (В и С) селезенки инфекционных центров (B) и вирусной нагрузки генома (C) в селезенке зараженных мышей измеряли на 28 точек на дюйм инфекционными анализа центре и КПЦР, соответственно. Красные линии, средние значения указанных значений. нс, не имеет значения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

γHV68 был широко использован в качестве модели для понимания патогенеза человека γ-HVS 2,4,5. В этом протоколе, мы описали три обычно используются методы, в том числе доска тест для инфекционного титра вируса, IC анализ на вирусную нагрузку скрытой, и КПЦР вирусной нагрузки генома, для оценки острой и латентной инфекции из γHV68 после интраназального прививки у мышей.

Доска анализа широко используется для определения титра вируса в инфицированных клетках или тканях, но оптимальные...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Авторы хотели бы признать, технические консультации и поддержку от Ren Солнца (Университет Калифорнии, Лос-Анджелес) и Seungmin Хван (Вашингтонский университет). Эта работа финансировалась Бакстер Фонд Национальных Институтов Здоровья грантов (R01 и R21 CA140964 AI083841 к C. Liang).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материал Имя Подготовка процедур
Метилцеллюлоза (MC) наложение среда для вирусного анализа доска
  1. Тепло ~ 250 мл дистиллированной воды в ТЦ бутылки до> 80 ° C (кипячения в течение 3 мин в микроволновой печи)
  2. Добавить постепенно 2,5 г MC порошок в нагретую воду, помешивая, на слабом огне до полного растворения.
  3. Автоклав сразу в течение 15 мин при температуре жидкого цикла.
  4. Перемешивание автоклавного СМИ MC при 4 ° С в течение ночи.
  5. Комбинат MC 250 мл среды с 2 х 200 мл MEM (Gibco-BRL) + 50 мл ФБС, чтобы дать 500 мл СМИ наложения.
Fix / пятно среда для анализа доска 0,2% (вес / объем) кристаллического фиолетового в 20% этанола.
ACK буфера Лизис NH 4 Cl 0,15 М, KHCO 3 10 мм, 0,1 мм ЭДТА
Полное DMEM Дульбеко изменение Орла среда(DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS; Invitrogen), 2 мМ L-глутамина, и 1% пенициллин-стрептомицина (Gibco-BRL).

Таблица 1. Конкретные носители, используемые в настоящем протоколе

Название реагента Компания Номер по каталогу
Кетамин Sigma-Aldrich K2753
Ксилазин Sigma-Aldrich X1251
Метилцеллюлоза Sigma-Aldrich M0512-250
2 х MEM Life Technologies 11935
Сотовый фильтр BD Faclon 352340
Omni ткани гомогенизатор OMNI Международного TH115
DNeasy крови и тканей Kit КИПпоколения 69504
iQTM SYBRH Зеленый Supermix BioRad 170-8882
CFX96 ПЦР в реальном времени системы Bio-Rad 184-5072
Сотовые счетчик Bio-Rad 145-0001
Sorvall SA-600 Thermo Scientific 096-124022

Таблица 2. Конкретные реактивы и оборудование

Ссылки

  1. Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
  2. Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
  3. Flano, E., Husain, S. M., Sample, J. T., Woodland, D. L., Blackman, M. A. Latent murine gamma-herpesvirus infection is established in activated B cells, dendritic cells, and macrophages. J. Immunol. 165, 1074-1081 (2000).
  4. Sunil-Chandra, N. P., Efstathiou, S., Nash, A. A. Murine gammaherpesvirus 68 establishes a latent infection in mouse B lymphocytes in vivo. J. Gen. Virol. 73, 3275-3279 (1992).
  5. Simas, J. P., Swann, D., Bowden, R., Efstathiou, S. Analysis of murine gammaherpesvirus-68 transcription during lytic and latent infection. J. Gen. Virol. 80, 75-82 (1999).
  6. Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J. Clin. Invest. 120, 939-949 (2010).
  7. Wen, K. W., Damania, B. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV): molecular biology and oncogenesis. Cancer. Lett. 289, 140-150 (2009).
  8. E, X. Viral Bcl-2-mediated evasion of autophagy aids chronic infection of gammaherpesvirus 68. PLoS. Pathog. 5, e1000609-e1000609 (2009).
  9. Marques, S., Efstathiou, S., Smith, K. G., Haury, M., Simas, J. P. Selective gene expression of latent murine gammaherpesvirus 68 in B lymphocytes. J. Virol. 77, 7308-7318 (2003).
  10. McCausland, M. M., Crotty, S. Quantitative PCR technique for detecting lymphocytic choriomeningitis virus in vivo. J. Virol. Methods. 147, 167-176 (2008).
  11. Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. B cells regulate murine gammaherpesvirus 68 latency. J. Virol. 73, 4651-4661 (1999).
  12. Weck, K. E., Kim, S. S., Virgin, H. I., Speck, S. H. Macrophages are the major reservoir of latent murine gammaherpesvirus 68 in peritoneal cells. J. Virol. 73, 3273-3283 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Инфицирование штаммом Gamma HV68метод бляшеканализ инфекционных центрованализ методом кПЦРинтраназальное введениегомогенат легкихзабор селезенкиизмерение вирусного титралатентная инфекцияострая инфекция
Измерение γHV68 инфекции у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.