Визуализация сосудистой Са 2 + Сигнализация Срабатывание паракринной Производные ROS

Краткое содержание

Эффективный способ получить представление о визуализации паракринной полученных АФК индукцию эндотелиальной Ca2 + сигнализация описано. Этот метод использует измерения паракринной производных АФК вызвало мобилизацию Са 2 + в сосудистых эндотелиальных клеток в культуре со-модели.

Аннотация

Окислительный стресс был замешан в целом ряде патологических состояний, в том числе при ишемии / реперфузионного повреждения и сепсис. Концепция окислительного стресса относится к аберрантных образования АФК (активные формы кислорода), которые включают O ₂ ^{• -,} Н ₂ О _2, и гидроксильные радикалы. Активные формы кислорода влияет множество клеточных процессов, включая передачу сигналов, клеточной пролиферации и гибели клеток ^1-6. АФК имеют потенциал для повреждения сосудов и клеток непосредственно органом, и может инициировать вторичных химических реакций и генетических изменений, которые в конечном итоге привести к усилению начальной РОС-опосредованного повреждения тканей. Ключевым компонентом усиления каскад, который усиливает необратимое повреждение ткани найма и активации циркулирующих воспалительных клеток. Во время воспаления, воспалительные клетки вырабатывают цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α (ФНО) и ИЛ-1, чтоактивации эндотелиальных клеток (ЭК) и эпителиальных клеток и дальнейшего расширения воспалительного ответа ^7. Сосудистой дисфункции эндотелия является признанным особенностью острого воспаления. Макрофаги способствуют дисфункции эндотелия при воспалении с помощью механизмов, остаются неясными. Активация макрофагов приводит к внеклеточной выпуск O ₂ ^{• -} и различных провоспалительных цитокинов, который вызывает патологические сигнализации в соседние ячейки ^8. NADPH оксидазы являются основным и главным источником АФК в большинстве типов клеток. В последнее время показано нами и другими ^9,10, что АФК производства NADPH оксидазы вызвать митохондриальную производства АФК в течение многих патофизиологических условиях. Поэтому измерения митохондриальной производства АФК не менее важно в дополнение к оценке цитозольного АФК. Макрофаги производства АФК по NADPH флавопротеидом фермент который играет главную роль в воспалении. После активации,фагоцитарной NADPH оксидазы производит обильное количество O ₂ ^{• -} которые имеют важное значение в механизме защиты организма ^11,12. Хотя паракринной производных O ₂ ^{• -} играет важную роль в патогенезе сосудистых заболеваний, визуализация паракринной РОС-индуцированных внутриклеточных сигнальных том числе Са ^{2 +} мобилизации до сих пор гипотезы. Мы разработали модель, в которой активированными макрофагами используются в качестве источника O ₂ ^{• -} для трансдукции сигнала на соседние эндотелиальные клетки. Используя эту модель, мы показываем, что макрофаг происхождения O ₂ ^{• -} привести к кальциевой сигнализации в соседних эндотелиальных клеток.

Протокол

Активные формы кислорода могут быть измерены в живых клеток с использованием окисления чувствительных красителей (1 & 2) или с помощью плазмиды датчиков (3 и 4) с помощью конфокальной микроскопии.

1. Визуализация цитозольного АФК в клетках J774

1. Расти J774.1 мыши моноцитарных макрофагов (10 ⁶ клеток / мл) по стеклянным дном 35-мм блюда (Harvard аппарата) в течение 48 ч.
2. Вызов клеток с TLR агонисты (2 мкг / мл, Lipo-тейхоевые кислотно-TLR2 агонист; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3 агонист; 1 мкг / мл LPS-TLR4 агонист) в течение 6 ч при температуре 37 ° C.
   Примечание: Макрофаги рассматриваться в аналогичных условиях были использованы для совместной культуре модель Са ^{2 +} мобилизации.
3. Добавить окислительно-чувствительных красителя H ₂ DCF-DA (Invitrogen), чтобы дать конечной концентрации 10 мкМ в ECM (внеклеточной средой: 121 мМ NaCl, 5 мМ NaHCO _3, 10 мМ Na-HEPES, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ KH ₂ PO _4, 1,2 мМ MgSO _4, 2 мМ CaCl _2, 10мМ глюкозы и 2,0% декстрана, рН 7,4; все полученные от Sigma), содержащий 2% BSA в блюда и инкубировать клетки в течение 20 мин до визуализации в конфокальной микроскопии.
4. После загрузки красителя, визуализировать клетки размещены на контролируемой температурой этапе соответствующей системы визуализации. Мы используем Carl Zeiss LSM 510 Мета конфокальной системы визуализации в сочетании с аргоном лазерного ионного источника при возбуждении 488 нм для DCF флуоресценции с помощью 40x цель нефти ¹³ (рис. 1А и D).
5. Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1,44), свободно доступного программного обеспечения из Национального института здоровья (Rasband, WS, ImageJ, американского Национального института здравоохранения, Bethesda, штат Мэриленд, США, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Визуализация mROS в клетки J774

1. Расти J774.1 мыши моноцитарных макрофагов (10 ⁶ клеток / мл) по стеклянным дном 35-мм блюда (Harvard аппарата) в течение 48 ч.
2. Вызов клеток с лигандами TLR, чтобы побудить mROS производства (2 мкг / мл, Lipo-тейхоевые кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C.
3. Добавить митохондриального супероксида индикатор MitoSOX Красный (Invitrogen), чтобы дать конечной концентрации 5 мкМ в ECM, содержащий 2% BSA в блюда и инкубировать клетки в течение 30 мин при 37 ° С, чтобы загрузка MitoSOX Red.
4. После красителя загрузки, визуализации клеток на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета конфокальной микроскопии системы пара с аргонового ионного лазера источник в возбуждении 561 нм для MitoSOX Красной флуоресценции с помощью 40x цель масла (рис 1B и Е).
5. Для контрольных опытов, после загрузки добавить краситель PBS или ДМСО (отрицательный контроль) или 2 мкм антимицином (как митохондриальной супероксид-генератор-положительный контроль) в клетки до изображения образца, как это описано в п. 2.4 (рис. 1в).
6. Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1,44).

3. Visualizatiна из цитозольного АФК в стабильных Hyper-цито MPMVECs

1. Мы используем pHyPer-цито (Евроген) млекопитающих кодирования вектор экспрессии флуоресцентных Hyper датчик, который локализуется в цитоплазме и, в частности чувств submicromolar концентрация H ₂ O ₂ ^14.
2. Трансфекции мышей легких микрососудистой эндотелиальных клеток (MPMVECs) с pHyPer-цито вектор с использованием либо электропорации или трансфекции реагентов. Мы используем 10 х 10 ⁶ клеток и трансфекции с 10 мкг pHyPer-цито через электропорации использованием BioRad Гена генератора electroporator системы (250, 500 мкФ). Культура MPMVECs в среде DMEM с добавлением 10% FBS, заменимые аминокислоты, эндотелиальные дополнения роста и антибиотиков.
   Примечание: В соответствии трансфекции, плиты клетки при низкой плотности для облегчения роста колоний.
3. Замените среду с полной культуральной среде дополнена 500 мкг / мл G418, через 48 часов после трансфекции. Экран для клонов, которые имеют самый высокий процент H yPer положительных клеток и прохождение Hyper положительных клонов, чтобы увеличить количество Hyper-положительных клеток (рис. 2).
   Примечание: Мы используем серийные разведения клеток для клональной селекции отдельных клеток и экран для стабильной клетки высоко выражения Hyper.
4. Расти стабильной Hyper-цито MPMVECs на 0,2% желатин покрытием покровные (80% слияния). На следующий день вызов клеток с лигандами TLR (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C. Необработанные клетки служат в качестве контроля.
5. После лечения, смонтировать на покровные Attofluor ячейке камеры (Invitrogen). Добавить 1 мл предварительно нагревается Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), чтобы камера и место камеры на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета система конфокальной микроскопии. Наглядное представление и изображение флуоресценции изменения на возбуждение 488 нм, используя 40х цель нефти (рис. 3А и D).
6. Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1.44) (см. раздел 6).

itle "> 4. Визуализация митохондриальных АФК в стабильных Hyper-dMito MPMVECs

1. Мы используем pHyPer-dMito (Евроген) млекопитающих выражением вектора, кодирующего митохондрий ориентированных Hyper что локализуется в митохондриях и, в частности чувств submicromolar концентрация H ₂ O _2.
2. Трансфекции MPMVECs с pHyPer-dMito и генерировать стабильные Hyper-dMito MPMVECs следующие шаги, описанные в разделе 3.2-3.3.
3. Расти стабильной Hyper-dMito MPMVECs на 0,2% желатин покрытием покровные (80% слияния).
4. На следующий день вызов клеток с лигандами TLR (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C. Необработанные клетки служат в качестве отрицательного контроля. Добавить 2 мкм антимицином (митохондриального супероксида индуктор-положительный контроль) до визуализации образца.
5. После лечения, смонтировать на покровные Attofluor ячейке камеры (Invitrogen). Добавить 1 мл подогретого Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), чтобы камераи разместить камеры на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета системы визуализации конфокальной. Наглядное представление и изображение флуоресценции изменения на возбуждение 488 нм, используя 40х цель нефти (рис. 3В, С и Е).
6. Анализ изображений с помощью программного обеспечения ImageJ (1.44) (см. раздел 6).

5. Сотрудничество культуры модели для визуализации паракринной полученных АФК вызвало Са ^{2 +} сигнализации в эндотелиальных клетках

Для визуализации и измерения [Ca ^{2 +]} я изменениях мы используем Са ^{2 +} чувствительны флуоресцентного красителя флуоресценции-4 AM (Invitrogen).

1. Расти MPMVECs на 0,2% желатин покрытием 25 мм покровные стекла (80% слияния).
2. Инкубируйте клетки, выращенные на покровных при комнатной температуре в течение 30 мин в ECM, содержащий 2% BSA и 0,003% плуроник кислоты с 5 мкМ флуоресцентных-4 AM (Invitrogen) конечная концентрация разрешить загрузку флуоресцен-4 утра. После загрузки, мыть клетки с экспериментального решения томографии (ECM, содержащий 0.25% BSA), содержащий сульфинпиразон, чтобы минимизировать потери красителя.
3. После загрузки флуоресцентных-4, крепление на покровные Attofluor ячейке камеры (Invitrogen). Добавить 800μl предварительно нагревается экспериментального решения визуализации для камеры и разместить его на контролируемой температурой этапе Carl Zeiss LSM 510 Мета системы визуализации конфокальной.
4. В отдельной этикетке трубки неактивированной или активированными макрофагами изолированы от любого дикого типа или gp91 ^{phox-/ -} мышей (обработанные LPS в течение 6 ч) с клеточными трекера красной CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) в ECM, содержащий 2% BSA и 0,003% плуроник кислоты. Вымойте и ресуспендирования клеток с 200 мкл экспериментального решения визуализации.
5. Добавить помечены макрофагов к флуоресцен-4 утра загружены MPMVECs в камере сборки.
6. Запись зеленый и красный флуоресценции каждые 3 сек в течение 10-20 мин с использованием Carl Zeiss LSM510 Мета конфокальной микроскопии система с лазерным источником ионов аргона при возбуждении на 488 и 561 нм для флуоресцентных-4 утра и клетка трекера красной флуоресценции respectivelу (рис.4 переменного тока).
   Примечание: Кроме того, J774.1 клеточная линия может быть использована для выявления MPMVECs Са ^{2 +} мобилизации.
7. Анализ флуоресценции-4 изменений интенсивности флуоресценции использованием ImageJ программного обеспечения (1.44) (см. раздел 6).

6. Данные анализа с использованием программного обеспечения ImageJ

Передача изображений, полученных с конфокальной системы. LSM формат файлов для анализа данных. ZEN ZEN 2009 и 2010 программное обеспечение, поставляемое с LSM 510 Мета конфокальной микроскопии или LSM 710 многофотонной конфокальной микроскопии соответственно сохраняет файлы в формате. LSM формате. Мы рекомендуем использовать этот родной. LSM файлы для анализа изображения, как исходное качество сохраняется. Этот формат может быть напрямую открыт в программе анализа изображения Изображение J. следующие шаги представляют собой пример количественного анализа одного изображения. Никакие дополнительные плагины, необходимые для анализа данные.

1. Открыть. LSM или. TIFF файлы в изображения J программы с помощью File> Open
2. Перейдите на вкладку ИЗОБРАЖЕНИЕ> COLOR> КАНАЛЫ SPLIT и разделить зеленый и DIC каналов. Используйте изображения из зеленого канала для последующего анализа.
3. Двойной клик и выберите "Эллиптический кисти выбор" вкладки и установите значение пиксела до 20.
4. Для Hyper-цито изображения, нажмите на одну ячейку для определения площади круга измерений. Затем нажмите кнопку "M" для измерения интенсивности выбранной области. Значения сохраняются в новом окне результатов.
5. Следующая, удерживая клавишу "Shift" ключ нажать на другую ячейку, чтобы выбрать другую область, а затем, нажав кнопку "M" ключ. Интенсивность записывается в окне результатов. Повторите шаги 4-5 на 50 различных клеток.
6. Для Hyper г-мито изображения, установите значение пиксела до 10 в овальное выделение кистью. Регион интереса (ROI) должно быть вручную прослеживается в том числе митохондрии частности клеток.
7. Использование руки, следом область вокруг митохондрий, а затем нажмите кнопку "М". Повторите шаги 6-7 на 50 различных клеток.
8. Скопируйте меня значения из результатов окна и вставить в лист Excel или любое программное обеспечение для построения результаты. Мы используем либо SigmaPlot или GraphPad PRISM для построения данных граф.

7. Представитель Результаты

На рисунке 1 показана цитозольного и митохондриальных АФК на вызов с TLR лигандами. Представитель конфокальной изображения показывают увеличение DCF (цитозольного) и MitoSOX Красный (митохондрии) флуоресценции после 6 часов стимуляции. Флуоресценция изменения были нормализованы и выражается в раз измениться.

На рисунке 2 показан поколения стабильной Hyper-цито и Hyper-dMito эндотелиальных клеток. Мышь эндотелиальные клетки трансфицированных pHyPer-цито или pHyPer-dMito плазмиды конструкций с помощью электропорации. Клетки стабильно выражения плазмиды были отобраны с G418 в течение двух недель. После выбора, разбавленный клетки высевали в 96-луночных. Индивидуальные колоний были выделены и отображаемого для однородных выражения.

e_content "> На рисунке 3 показано измерение эндотелиальных цитозольного и митохондриальной Н ₂ О ₂ уровня. представителю конфокальной изображения показывают увеличение Hyper-цито (цитозольного) и Hyper-dMito (митохондрии) флуоресценции после 6 часов стимуляции. изменений интенсивности флуоресценции были нормализованы и выражается в раз измениться.

На рисунке 4 показана оценка макрофагов полученных АФК индуцированной эндотелиальной цитозольного Са ^{2 +} мобилизации. ЛПС-стимулированной макрофаги были добавлены на легочные клетки эндотелия микрососудов (PMVEC), которые были ранее загружены внутриклеточного Са ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} я) индикатор красителя Fluo-4. Применение дикого типа LPS-активированными макрофагами вызывали [Ca ^{2 +]} я ростом PMVECs, который был ослабленный нокаутом функциональных НАДФН-оксидазы (gp91 ^{phox-/ -).}

Рисунок 1. Visualizatiна макрофагов порожденных сотовой АФК и митохондриального супероксида. J774.1 клетки сталкиваются с проблемой TLR2, 3 и 4 лигандами (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10μg/ml, поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4). Течение 6 ч при 37 ° C. После обработки клетки были загружены () сотовой АФК индикатор (H ₂ DCF-DA, зеленая флуоресценция) или (В) митохондриального супероксида индикатор (красный MitoSOX; красной флуоресценции). (C) антимицином был использован в качестве положительного контроля для митохондриальных производство АФК. Изменений интенсивности флуоресценции оценивались с помощью конфокальной микроскопии. (D) и (Е) Количественный средней флуоресценции изменения.

Рисунок 2. Схематическое изображение генерации стабильная экспрессия эндотелиальных клеток и цитозольного митохондриальной показатели АФК.

Рисунок 3. V. isualization эндотелиальных цитозольного и митохондриальной Н ₂ О ₂ уровня MPMVECs стабильно, выражающие () Hyper-цито или (В) Hyper-dMito были оспорены с TLR2, 3 и 4 лигандами (2 мкг / мл, липотейхоевый кислотно-TLR2; 10 мкг / мл, Поли (I: C)-TLR3; 1 мкг / мл LPS-TLR4) в течение 6 ч при 37 ° C. (C) антимицином был использован в качестве положительного контроля для митохондриальных производство АФК. После лечения изменений интенсивности флуоресценции оценивались с помощью конфокальной микроскопии. (D) и (Е) Количественный средней флуоресценции изменения.

Рисунок 4. Макрофаги полученных АФК вызывают нарушение эндотелиальных клеток Са ^{2 +} мобилизации. (А) Схематическое изображение эндотелиальных клеток / макрофагов совместно культуре модель исследования. (B) свежевыделенных мышиных макрофагов с обеих WT и gp91phox нулевых мышей (Jackson Laboratory) были активированы до 1 мкг / мл LPS в течение 6 ч. Macrophages были помечены ячейки-трекер Red (красный) и добавил на Fluo-4 загружаются PMVECs (зеленый) для оценки паракринной O ₂ ^{• -.} сигнализации (C) LPS-активированными макрофагами изолированы от WT мышей вызвало большие и быстрые Са ^{2 +} мобилизацию В PMVECs по сравнению с макрофагами мышей gp91phox пустым. Подтверждение активации макрофагов была продемонстрирована ранее.

Обсуждение

Описанный здесь метод позволяет быстро и количественного измерения активных форм кислорода в живых клетках, либо с помощью окисления чувствительных красителей или плазмиды датчиков. Агонисты TLRs (звонок-подобных рецепторов) являются соединениями, которые стимулируют клетки через TLRs присутствует на поверхности клеток и вызывают сигнальные пути вниз по течению ^15. В нашем протоколе, мы использовали три различных TLR агонисты а именно, Lipo-тейхоевые кислотно-TLR2 агонист; поли (I: C). TLR3-агонистов; LPS-TLR...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагент	Компания	Номер по каталогу
Attofluor ячейке камеры	Invitrogen	A7816
Антимицином	Sigma Aldrich	A8674
DMEM низкий средний глюкозы	Invitrogen	10567-014
Эндотелиальная дополнением фактора роста (ЭКГ)	Северная часть штата	02-102
Эмбриональной бычьей сыворотки	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
Желатин	Sigma Aldrich	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma Aldrich	L4516
LTA	Sigma Aldrich	L2515
MitoSOX Красный	Invitrogen	M36008
Opti-MEM я Уменьшение среднего сыворотки	Invitrogen	51985091
Pen / Strep (10x)	Invitrogen	15140163
pHyPer-цито	Евроген	FP941
pHyPer-dMito	Евроген	FP942
Поли (I: C)	Sigma Aldrich	P0913
Призма программного обеспечения 5,0	GraphPad Software, Inc
SigmaPlot 11,0	Systat Software, Inc
Трипсин-EDTA (10x)	Invitrogen	15400054
Т-25 Колбы	Гранулирование	430639
Т-75 Колбы	BD Сокол	353136
96-и ТС микро-луночного планшета	BD Сокол	353072
Дзен 2009 программное обеспечение	Carl Zeiss 510 Мета конфокальной микроскопии