Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

Summary

В этой статье мы рассмотрим использование магнитного пинцета, чтобы изучить влияние силы на ферментативную протеолиза на одном уровне молекулы хорошо подходит для распараллеливания образом.

Abstract

Генерация и детектирование механических сил вездесущий аспект физиологии клетки, имеет непосредственное отношение к раку метастазов ¹ атерогенеза ² и заживление раны ^3. В каждом из этих примеров, клеток и оказывают силы на свое окружение и одновременно ферментативно реконструируют внеклеточного матрикса (ECM). Влияние сил на ECM, таким образом, стать зоной значительный интерес в связи с его вероятной биологической и медицинской значение ^4-7.

Одноместный методы молекулы, такие как оптического захвата ^8, атомно-силовой микроскопии ⁹ и магнитного пинцета ^10,11 позволяют исследователям исследовать функции ферментов на молекулярном уровне, оказывая сил на отдельные белки. Из этих методов магнитного пинцета (MT) отличаются низкой стоимостью и высокой пропускной способностью. МТ оказывают силы в диапазоне ~ 1-100 пН и может обеспечить миллисекунды временным разрешением,качества, которые хорошо подходят к изучению ферментов механизм на одной молекуле уровне ^12. Здесь мы сообщаем хорошо подходит для распараллеливания MT анализ для изучения влияния силы на протеолиз отдельных молекул белка. Приведем конкретный пример протеолиза тримерной пептид коллагена матричной металлопротеиназы 1 (ММР-1), однако этот анализ может быть легко адаптирована для изучения других субстратов и протеаз.

Protocol

1. Подготовка Проточная ячейка

1. Покровные (# 1.5, 22x22 мм и 22x40 мм, VWR) будут чистить с помощью ультразвука.
   1. Добавить покровные к небольшой стеклянной тары способна удерживать покровные и установки в sonicator (см. шаг 2).
   2. Наполните контейнер с изопропанола и разрушать ультразвуком в ванне sonicator в течение 20 минут.
   3. Откажитесь от изопропанола и промыть покровные обильным количеством дистиллированной воды, производимых Barnsted аппарат MilliQ или аналогичное устройство. Заполните емкость с водой и разрушать ультразвуком в течение 20 минут.
   4. После обработки ультразвуком, высушите покровные в поток фильтруется от пыли воздух. Используйте только покровные, которые появляются чистые (т.е. без пятен).
   5. Осторожно пламени покровные в течение нескольких секунд, чтобы очистить их от любых оставшихся от пыли и влаги: пройти через покровные газового пламени производится с горелкой Бунзена, заботясь, чтобы не деформировать покровное из-за избыточного тепла. Этот шаг удаляет остаточные поверхностизагрязняющих веществ.
2. Использование двухсторонний скотч, приложите два покровных вместе. Отрежьте ленту ~ 3 см в длину и 0,3 см в ширину. Прикрепите ленту 22x40 мм покровным оставляя 1,6 см канал в середине. С помощью пипетки осторожно надавите на покровное для того, чтобы лента правильно соблюдать.

2. Магнитные установки пинцет и калибровка

1. Магнитный пинцет были установки с использованием постоянных редкоземельных магнитов, как описано выше ^10,12. Алюминиевый L-кронштейн был построен с 1 отверстие диаметром мм и установлен на вертикальной Z-переводчик (Thorlabs) для модуляции высоты пинцетом. Два постоянных редкоземельных магнитов были прикреплены к кронштейну на каждой стороне отверстие для создания магнитной ловушки (рис. 1).
2. Препарата ДНК: ДНК фага лямбда надписью на 5 'и 3' концы с биотином и дигоксигенин (IDT ДНК, Сан-Диего, Калифорния) был использован для калибровки магнитногомагнитного пинцета.
   1. Смешать 50 мкл 4 нм λ-ДНК с 2 мкл 40 нМ биотин сопряженных олигонуклеотида и тепла при температуре 60 ° С в течение 10 минут. Затем медленно охлаждаться при комнатной температуре в течение 1 часа.
   2. Добавить ДНК-лигазы в соответствии со спецификацией производителя и перевязывать при комнатной температуре в течение 3 часов.
   3. Добавить 2 мкл 400 нМ дигоксигенин сопряженных олигонуклеотида и инкубируют при комнатной температуре в течение 45 минут.
   4. Добавить 1,5 мкл 10 мМ АТФ и продолжать перевязки дигоксигенин сопряженных олигонуклеотида в λ-ДНК в течение 3 часов.
   5. Удалите излишки олигонуклеотидов и ДНК-лигазы с использованием 100 кДа спина фильтры (микроконтроллер Ultracell YM-100). В общей сложности в 1000 раз буфера обмена в ТЕ буфере достаточно, чтобы удалить лишнюю олигонуклеотидов. Примечание: Важно не использовать спин скорости> 500xG, потому что это приведет к сдвига ДНК.
   6. Изучить образцы ДНК с помощью электрофореза на 0,7% агарозном геле для того, чтобы ДНК яНе денатурировали или стриженого.
   7. Измерение концентрации ДНК. Использование Nanodrop UV-VIS-спектрометра (Thermo Scientific) рекомендуется, так как имеющийся объем образца может быть очень мала.
3. Подготовить поток клеток, как описано в разделе 1.
4. Для крепления ДНК проточной ячейки, добавить анти-дигоксигенин антитела (IgG овец, 1 мкг мл ^-1; Roche Bioscience, Мангейм, Германия) и позволить ему присоединиться к стеклянной поверхности на 15 минут.
5. Пассивации поверхности проточной ячейки для предотвращения неспецифического прилипания ДНК, добавив 2 мг мл ^-1 BSA, 0,1% Твин-20 в 1x PBS. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут.
6. Повторите шаг 2.5.
7. Добавить 50 рм fuctionalized λ-ДНК и позволяют прикрепить к покровным в течение 15 минут.
8. Смыть избыток ДНК 1x PBS.
9. Добавить покрытых стрептавидином суперпарамагнитных бисером (1 мкм = бисер 2 мкг мл ^-1; 2,8 мкм бисера = 20 мкг мл ^-1
10. Смойте лишний бисер с 1x PBS.
11. Магнитные калибровки пинцет
    1. Перемещение постоянных магнитов в положение, которое находится далеко от поверхности образца (> 15 мм).
    2. Положите подготовленную клетку потока в микроскоп.
    3. Перемещение постоянных магнитов в положении над проточной ячейки.
    4. Выберите фокальной плоскости λ-ДНК функциональными бисером, сосредоточив внимание на бусы от обоих стеклянных поверхностей. Правильный фокальной плоскости, в которой желаемое бисера ярких центра.
    5. Возьмите видео из бисера движения на 80 Гц или больше на 500 кадров.
    6. Перемещение магнита ближе к поверхности образца. Для расстояний более 5 мм, перемещение с шагом в 1 мм. Для расстояния между мм 1 и 5, двигаться в 0,5 мм шагом. Для расстояния менее 1 мм, перемещение с шагом 0,25 мм.
    7. Повторите шаги 2.11.5 и 2.11.6 при каждом новом положении магнита.
    8. Для каждого типа данныхустанавливать, отслеживать центре бусин с помощью 2D подходит Гаусса.
    9. Вычислить силу через броуновское колебаний с помощью:

    
    где & _B T Больцмана тепловой энергии, L-длина λ-ДНК, и 2> разница в тяжести положения.

    10. Подтверждение правильности силы, проверяя силу расчет через силу, пригодную спектр Лоренца для того, чтобы найти Rolloff частоты. Прикладные силы, связанные с Rolloff частотой соотношением:

    
    Там, где ƒ ₀ Rolloff частоты, является шарик радиуса и μ является вязкость жидкости ^12.

3. Коллаген пептид Приложение к Проточные ячейки

Для того чтобы обеспечить конкретный пример применения нашей методологии, мы описываем последние работы в нашей лаборатории, характеризующий протеолиза тримерной пептид модели коллаген. Мы ожидаем, что это общий подход может быть широко применен в других белков и полинуклеотидов.

1. Пептид коллагена модель состоит из N-терминал 6x Его-теги для очистки, а затем 5 раз тус тег (ГПЗ) ₁₀ для обеспечения формирования тройной спирали коллагена α1 остатки 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), которые образуют MMP- 1 сайт узнавания, последовательность foldon (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL) и С-концевой KKCK чтобы облегчить маркировку с биотин-малеимид. Foldon происходит от Т4-фаг белка fibritin и стабилизирует тримеры коллагена модели, когда сливается либо в N - и С-конца ^13,14.
2. Пептид коллагена и MMP-1 белки были высказаны и очищенный, как описано выше ^4,15.
3. Добавить анти-тус (15 мкг мл ^-1) в камеру поток и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы анти-тус приложить к поверхности проточной ячейки.
4. Пассивации проточной ячейки для предотвращения неспецифического вложений белков с использованием 5 мг мл ^-1 BSA таким же образом, как описано в пункте 2.5.
5. Добавить 150 пМ коллагеновых пептидов и позволяют прикрепить к антител через тус теги течение 45 минут.
6. Смыть избыточного коллагена использованием PBS буфера.
7. Добавить стрептавидин покрытых бисером суперпарамагнитных (1 мкм = бисер 2 мкг мл ^-1 и 2,8 мкм бисера = 20 мкг мл ^-1) и позволяет им придают молекулы коллагена в течение 45 минут. 1 мкм бисер должен быть разведен в нужной концентрации в PBS. 3 бисер мкм должна быть отделена от решения с помощью сильных магнитов, то resolubilized в PBS. Этот процесс следует повторить 3 раза. Мы заметили, что этот шаг имеет важное значение для GEт 3 мкм бисером связываться с поверхностно-иммобилизованных коллагеновых пептидов.

4. Анализ группы Протеолиз

1. Как только поток ячейка в сборе с пептид коллагена и магнитных бус, изображение потока ячейки в магнитной ловушке при низких, ~ 1 сила пН. По нашему опыту, субпопуляции бусы иногда слабо соблюдаются на поверхность в неспецифических моды. Применение скромных сил гарантирует, что эти шарики не будут освобождены.
2. Добавить активировать фермент поток клетки. В этом случае MMP-1 был предварительно активировать, добавив 3,5 мм APMA (4-aminophenylmercuric ацетат) и инкубировали при 37 ° C в течение 3 часов. Активация была проверена с помощью SDS-PAGE.
3. Как только поток клетки вновь внесен в магнитное устройство пинцет, записать в видео охватывающие несколько полей зрения, как правило, приносит несколько сотен прилагается бисера. Это будет т = 0.
4. Повторите тот же процесс записи нескольких полей зрения (при возвращении тО том же поле зрения) в регулярных точках времени, пока все бусины отделить или не далее протеолиза является заметной.
5. Кинетический анализ данных
   1. Посчитайте бусины в различных полей зрения в различные моменты времени и среднем их. Нормализация количества бисера, разделив среднее количество бусин в каждый момент времени на количество бусин в т = 0. Это гарантирует, что мы можем сравнить скорость протеолиза из различных экспериментов, так как абсолютное число бусин будет отличаться от эксперимента к эксперименту.
   2. Построить отношения в зависимости от времени. В этом случае, мы установили его экспоненциальный спад плюс константа.

   
   где f (T) представляет собой отношение бисером прилагается (или молекулы коллагена unproteolyzed), т есть время, есть доля из бисера прикреплены к коллагена троса, б является распад константа скорости, и весть доля из бисера, которые прикреплены неспецифически.

   3. Тот же опыт повторяется на различных сил и MMP-1 концентраций выяснения влияния силу коллагена протеолиза ММП-1.

5. Представитель Результаты

Выше протокол описывает роман использование магнитного пинцета (рис. 1) для изучения влияния силу ферментативного протеолиза. Мы калиброванный пинцет для 1 мкм и 3 мкм бисера с использованием как величина наблюдаемого броуновского колебаниям и расчет спад частоты при изменении магнит позиции (рис. 2). В экспериментах сила протеолиза, установка аналогичного исключением того, что ДНК заменяется на коллаген (рис. 3, 4). Нормированного числа оставшихся шариков могут быть построены как функции времени, чтобы найти протеолиза ставки (рис. 5), и этот процесс может бытьповторяются для различных ферментов концентрации и сил.

Рисунок 1. Схема магнитной ловушке процесс калибровки (не в масштабе). Два постоянных редкоземельных магнитов создают магнитное поле, которое тянет на суперпарамагнитных шарик. Перевод магнит вверх и вниз регулирует применять силу. Шарики загружаются с помощью обычного светлого поля микроскопа свет, проходящий через отверстие между двумя магнитами вставке. Снимок сделан с целью 40x воздуха. Резкое, круглые пятна соответствуют бисера прикреплены к поверхности покровного. Вне фокуса объектов отдельные бусины.

Рисунок 2. Земельные калиброванного силу в зависимости от магнит расстояние от поверхности образца на 1 мкм (слева) и 2,8 мкм (справа) шарикс. Данные подходят для эмпирической функции , Где х-расстояние от магнита. = 31.8, б = 5,61 и с = 4,39 на 1 мкм бисером и = 140, В = 3,10 и с = 1,86 для 3 бисер мкм. Эти значения являются специфическими для нашего конкретного инструмента и геометрии эксперимента, и каждый прибор должен быть откалиброван в отдельности. Погрешности в каждой точке представляет собой около 10% изменчивости в приложенной силы на борта к борту основе, в связи с изменчивостью размер гранул. Силы, приложенной пропорционально объему бисер, бусины и объем варьируется ~ 9% больше, чем средняя (в зависимости от производителя спецификации).

Рисунок 3. Группы протеолиза анализа установки (не в масштабе). Тример коллагена модель крепится к поверхности покровного стекла через мУс / анти-тус сопряжения. Стрептавидин покрытых бисером суперпарамагнитных крепятся к коллагена тримеров с помощью биотин-стрептавидин связи. Активированный MMP-1 сокращения коллагена в течение долгого времени, в результате чего бисер оторваться от поверхности и отойти от фокальной плоскости.

Рисунок 4. Схема мультфильма протеолиза в зависимости от времени. Мультфильм показывает пример поле зрения в течение долгого времени, как протеолиз происходит. Со временем, MMP-1 сокращения коллагена и бисером отключения и отойти от фокальной плоскости под воздействием магнитного поля.

Ставки на рисунке 5. Протеолиза в зависимости от приложенной силе ^16. Показаны данные, собранные на уровне 1,0 PN (3 мкМ MMP-1, черный), 6,2 PN (3 мкМ MMP-1, красный) и 13 рп (0,2 мкМ MMP-1, магНТА). Ставки протеолиза (подходит параметров): 0,22 ± 0,02 мин ^-1 (1 пН), 0,46 ± 0,09 мин ^-1 (6,2 PN), и 2,08 ± 0,18 мин ^-1 (13 PN). Часть из бисера unproteolyzed на большие моменты времени (> 15 минут) остается примерно постоянным на ~ 0.25 в различных экспериментах. Планки погрешностей соответствуют Пуассона статистика, отражающая число наблюдений в каждый момент времени. Ошибка в каждый момент времени для бисера п п ^ ^1/2. Ошибка в часть из бисера прикреплены была рассчитана по ошибке propagation.1 бисером мкм были использованы для 1.0 и 6.2 рк рк экспериментов и 2,8 мкм бисером были использованы в течение 13 экспериментов пН.

Discussion

Этот протокол описывает новое применение классических единой методике молекулы. Магнитный пинцет позволяет средней и высокой пропускной одной молекулы анализов в экономически эффективным способом. Однако, как и все экспериментальные методы существуют проблемы и потенциальные подводные камни.

Ограничения магнитного пинцета

По сравнению с оптической ловушке пространственным и временным разрешением в аппарат MT низка. Кроме того, сил, возникающих при простом MT описаны...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Micro остекление # 1.5 (22x22)	VWR	48366-067
Micro остекление # 1.5 (22x40)	VWR	48393-048
Лямбда ДНК	Invitrogen	25250-010
T4 ДНК-лигазы	Invitrogen	15224-041
Микроконтроллер Ultracel YM-100	Millipore	42413
Anti-дигоксигенин	Roche Diagnostics	11-333-089-001
Твин-20	Сигма	P9416-100мл
Anti-тус антител	Invitrogen	46-0603
Бычьего сывороточного альбумина	Сигма	B4287-5-го поколения
Dynabeads М-280 стрептавидином	Invitrogen	658.01D
Dynabeads MyOne T1 стрептавидином	Invitrogen	658.01D
р-Aminophenylmercuric ацетат	Calbiochem	164610
Биотин-малеимид	Sigma Aldrich	B1267
Биотин помечены олиго	IDT ДНК	Заказной синтез
Дигоксигенин помечены олиго	IDT ДНК	Заказной синтез
Коллагенпептид гена	ДНК 2,0	Заказной синтез
MMP-1 кДНК	Гарвардский плазмиды базы данных
г-переводчик	Thorlabs	MTS50
Servo контроллер для переводчика	Thorlabs	TDC001