Методическая статья

Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет

DOI:

10.3791/3520

⸱

25 июля 2012 г.

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, Stanford University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы рассмотрим использование магнитного пинцета, чтобы изучить влияние силы на ферментативную протеолиза на одном уровне молекулы хорошо подходит для распараллеливания образом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Генерация и детектирование механических сил вездесущий аспект физиологии клетки, имеет непосредственное отношение к раку метастазов 1 атерогенеза 2 и заживление раны 3. В каждом из этих примеров, клеток и оказывают силы на свое окружение и одновременно ферментативно реконструируют внеклеточного матрикса (ECM). Влияние сил на ECM, таким образом, стать зоной значительный интерес в связи с его вероятной биологической и медицинской значение 4-7.

Одноместный методы молекулы, такие как оптического захвата 8, атомно-силовой микроскопии 9 и магнитного пинцета 10,11 позволяют исследователям исследовать функции ферментов на молекулярном уровне, оказывая сил на отдельные белки. Из этих методов магнитного пинцета (MT) отличаются низкой стоимостью и высокой пропускной способностью. МТ оказывают силы в диапазоне ~ 1-100 пН и может обеспечить миллисекунды временным разрешением,качества, которые хорошо подходят к изучению ферментов механизм на одной молекуле уровне 12. Здесь мы сообщаем хорошо подходит для распараллеливания MT анализ для изучения влияния силы на протеолиз отдельных молекул белка. Приведем конкретный пример протеолиза тримерной пептид коллагена матричной металлопротеиназы 1 (ММР-1), однако этот анализ может быть легко адаптирована для изучения других субстратов и протеаз.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Проточная ячейка

  1. Покровные (# 1.5, 22x22 мм и 22x40 мм, VWR) будут чистить с помощью ультразвука.
    1. Добавить покровные к небольшой стеклянной тары способна удерживать покровные и установки в sonicator (см. шаг 2).
    2. Наполните контейнер с изопропанола и разрушать ультразвуком в ванне sonicator в течение 20 минут.
    3. Откажитесь от изопропанола и промыть покровные обильным количеством дистиллированной воды, производимых Barnsted аппарат MilliQ или аналогичное устройство. Заполните емкость с водой и разрушать ультразвуком в течение 20 минут.
    4. После обработки ультразвуком, высушите покровные в поток фильтруется от пы....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает новое применение классических единой методике молекулы. Магнитный пинцет позволяет средней и высокой пропускной одной молекулы анализов в экономически эффективным способом. Однако, как и все экспериментальные методы существуют проблемы и потенциальные подводные камни.

Ограничения магнитного пинцета

По сравнению с оптической ловушке пространственным и временным разрешением в аппарат MT низка. Кроме того, сил, возникающих при простом MT описаны.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Карьера Burroughs Wellcome премии в Научно-интерфейс (ARD), Национального института здравоохранения через Новая программа Новатор премии NIH директора 1-DP2-OD007078 (ARD), Уильям Bowes младший Стэнфордского стипендий (ASA ) и Стэнфордского института сердечно-сосудистой Младший Predoctoral стипендий (x). Авторы выражают благодарность Джеймсу Spudich для кредитования микроскопии оборудования.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу
Micro остекление # 1.5 (22x22) VWR 48366-067
Micro остекление # 1.5 (22x40) VWR 48393-048
Лямбда ДНК Invitrogen 25250-010
T4 ДНК-лигазы Invitrogen 15224-041
Микроконтроллер Ultracel YM-100 Millipore 42413
Anti-дигоксигенин Roche Diagnostics 11-333-089-001
Твин-20 Сигма P9416-100мл
Anti-тус антител Invitrogen 46-0603
Бычьего сывороточного альбумина Сигма B4287-5-го поколения
Dynabeads М-280 стрептавидином Invitrogen 658.01D
Dynabeads MyOne T1 стрептавидином Invitrogen 658.01D
р-Aminophenylmercuric ацетат Calbiochem 164610
Биотин-малеимид Sigma Aldrich B1267
Биотин помечены олиго IDT ДНК Заказной синтез
Дигоксигенин помечены олиго IDT ДНК Заказной синтез
Коллагенпептид гена ДНК 2,0 Заказной синтез
MMP-1 кДНК Гарвардский плазмиды базы данных
г-переводчик Thorlabs MTS50
Servo контроллер для переводчика Thorlabs TDC001

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

1

Похожие статьи