Оценка соматических Hypermutation в Рамос-клеток после Сверхэкспрессия или Нокдаун специфических генов

Краткое содержание

Мы опишем, как выполнять ретровирусных или лентивирусов инфекции гиперэкспрессия или shRNA содержащих конструкций в человеческой Рамос B-клеточной линии и как измерить соматических hypermutation в этих клетках.

Аннотация

Жизненный цикл B-клеток начинается с выработки антител с низким аффинитетом, которые образуются в результате V(D)J-рекомбинации. Однако при обнаружении патогена вариабельный (V) регион гена иммуноглобулина (Ig) подвергается соматической гипермутации (SHM), частота которой примерно в 100 000 раз выше, чем в остальной части генома, что приводит к образованию антител с высоким аффинитетом^1,2. Кроме того, рекомбинация переключения классов (CSR) позволяет вырабатывать антитела с различными эффекторными функциями в зависимости от типа иммунного ответа, необходимого для борьбы с конкретным патогеном. И CSR, и SHM инициируются активационным индуцированным цитидиндезаминазным ферментом (AID), который дезаминирует остатки цитозина в ДНК с образованием урацилов. Эти урацилы обрабатываются склонными к ошибкам путями репарации, что в конечном итоге приводит к возникновению мутаций и рекомбинации^1-3.

Наши нынешние представления о молекулярных деталях SHM и CSR основаны на совокупности исследований на мышах, первичных клетках, клеточных линиях и в бесклеточных экспериментах. Модели на мышах остаются «золотым стандартом», при этом генетический нокаут показал критическую роль многих факторов репарации (например, Ung, Msh2, Msh6, Exo1 и полимеразы η)^4-10. Однако не все гены доступны для исследований с использованием нокаута. Например, нокаут нескольких белков репарации двухцепочечных разрывов приводит к эмбриональной летальности или нарушает развитие B-клеток^11-14. Более того, иногда специфическая функция белка в SHM или CSR может быть маскирована более глобальными дефектами, вызванными нокаутом. Кроме того, поскольку эксперименты на мышах могут быть длительными, изменение экспрессии отдельных генов в клеточных линиях становится все более популярным первым шагом для идентификации и характеристики генов-кандидатов^15-18.

Ramos — клеточная линия лимфомы Беркитта, в которой конститутивно происходит SHM, — является популярной моделью для изучения SHM^18-24. Одним из преимуществ клеток Ramos является наличие встроенного удобного полуколичественного метода оценки SHM. Клетки дикого типа экспрессируют IgM, и по мере накопления мутаций некоторые из них приводят к прекращению экспрессии IgM. Таким образом, анализ потери IgM с помощью сканирования клеток с флуоресцентно-активированной сортировкой (FACS) обеспечивает быстрый считываемый показатель уровня SHM. Более количественная оценка SHM может быть получена путем прямого секвенирования генов антител.

Поскольку клетки Ramos трудно трансфицировать, мы создаем стабильные производные с повышенной или пониженной экспрессией отдельного гена путем инфицирования клеток ретровирусными или лентивирусными конструктами, содержащими кассету сверхэкспрессии или короткую шпилечную РНК (shRNA) соответственно. Здесь мы описываем способ инфицирования клеток Ramos и последующего использования этих клеток для исследования роли конкретных генов в процессе SHM (Рисунок 1).

Протокол

1. Подготовка образцов и клетки

1. Выполнить средний подготовки масштаба ДНК (midiprep) из гиперэкспрессия или shRNA содержащих конструкции и упаковки ретровирусных вектор pKat2 или лентивирусов векторов упаковки pVSV-G, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev ^25. Используйте 6 мкг ДНК для каждой конструкции и либо 4 мкг pKat2 (для ретровирусных инфекций) или 1,5 мкг ДНК для каждого из pVSV-г, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev упаковки векторов (для лентивирусов инфекций).
2. Подготовка Боск 23 средств массовой информации. Для трансфекции, использовать обе среды без изменений изменение Дульбеко Орла (DMEM), а также полное DMEM. Чтобы сделать полный DMEM, добавить 1% HEPES буфера, 1% пенициллин-стрептомицина-глютамин (PGS), а 10% новорожденных телячьей сыворотки (NCS), чтобы бутылка DMEM.
3. Подготовка Рамос СМИ. Для инфекции шаг, сделать полный RPMI-1640 (RPMI), добавив 1% HEPES, 1% PGS, и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), чтобы бутылка RPMI. За один шаг посева клетки, маке «условной» СМИ растущей Рамос клеток в полной RPMI в течение 2 дней, спиннинг вниз ячейки вниз при 400 Х г в течение 4 минут и фильтрацию супернатанта с 0,2 мкм фильтр в стерильные бутылки. Как и в других СМИ полную, обусловленные средства массовой информации хранится при температуре 4 ° С, пока это необходимо.
4. Сплит 3 х 10 ⁶ Боск 23 клеток в 100-мм пластины в 10 мл полной DMEM день до трансфекции, так что клетки будут на 50-60% слияния день трансфекции. Сделайте одну пластину клеток для каждого вектора вы планируете трансфекции. Важно, что клетки не были сохранены в культуре слишком долго, использование низких пассаж клеток или недавно талой клетки для трансфекции и инфекции шаги, чтобы гарантировать хорошее инфекции.
5. Включите управления для ваших экспериментов. Для трансфекции и инфекций, создать отрицательный контроль (untransfected или неинфицированных клеток) и положительного контроля (вирус, который выражает GFP и пуромицину гена устойчивости). Для shRNA нокдаун экспериментаментов, заразить хорошо защищенные или не имеют отношения контроля shRNA.

2. Трансфекции Боск 23 клетки

1. Теплый бутылки без изменений DMEM и полной DMEM при температуре 37 ° C.
2. Удаление информации из Боск 23 клетки и замените 5 мл полной DMEM. Вернуться клетки 37 ° C инкубаторе до использования в шаге 2.6.
3. Теплая бутылка FuGENE 6 при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего кратко вихря (<1 секунды).
4. Алиготе 600 мкл DMEM без поправки на 1,5 трубки микроцентрифужных мл.
5. Развести 30 мкл FuGENE 6 в 600 мкл DMEM без изменений, вихревые кратко (<1 секунды), а затем инкубируют при комнатной температуре в течение пяти минут. Будьте осторожны, чтобы пипетки прямо в средствах массовой информации. Не позволяйте FuGENE 6 сенсорным стороны трубки.
6. Добавить 6 мкг построить и либо 4 мкг pKat2 (ретровирусных инфекций) или 1,5 мкг каждого из pVSV-G, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev (лентивирусов инфекций) в DMEM / FuGENE 6 смеси, вихревые бри efly (<1 секунды), а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 25 минут.
7. Добавить ДНК / DMEM / FuGENE 6 микс Боск 23 клеток и возвращение к 37 ° C инкубаторе в течение 24 часов.
8. После 24 часов, добавляют 5 мл полной DMEM для трансфекции клеток и возвращение к 37 ° C инкубатора в течение еще 24 часов.

3. Сбор вирусных частиц

1. Урожай 10 мл СМИ из трансфицированных Боск 23 ячеек с 10 мл шприц.
2. Прикрепить 0,45 мкм фильтр до конца шприц и фильтра средств массовой информации в чистое 15 трубки полипропилена мл.
3. Используйте вирусный СМИ сразу или заморозить до 1 мл аликвот в 2 мл флаконах криогенных при температуре -80 ° C.
4. После сбора урожая вирусных СМИ, подтверждают, что эффективная трансфекция произошло в положительных клеток контроль СУИМ. Это может быть сделано для всех образцов, если построить содержит либо люминесцентные (например, GFP) или на поверхности клеток маркера (например, Thy1).

itle "> 4. Заражение В-клетки

1. Семенной 2 мл 2 х 10 ^{5 клеток} / мл Рамос клеток в полной RPMI в 6-луночный планшет за 24 часа до инфекции. Опять же, не забудьте использовать низкий проход числа клеток или недавно талой клетки, чтобы обеспечить хороший инфекции.
2. Если вы используете замороженные аликвоты вируса, оттепель вирусных СМИ быстро при температуре 37 ° C.
3. Смешайте 1 мл вирусной СМИ с 3 мкл 10 мг / мл polybrene. Конечная концентрация polybrene должно быть 10 мкг / мл в общем объеме 3 мл.
4. Добавить вирус / polybrene смеси для клеток и хорошо перемешать с помощью пипетки. Как упоминалось ранее, одной скважины должны использоваться в качестве неинфицированных контроля; добавить 1 мл полной RPMI и 3 мкл polybrene для этого хорошо, а не 1 мл вируса. Будьте уверены, чтобы заразить хорошо соответствует отрицательный контроль. Мы также заразить хорошо с GFP-содержащая вектор, для определения инфекции эффективность СУИМ.
5. Центрифуга 6-луночный планшет в 3000 г Х в течение 90 минут при комнатной температуре.
6. Вернуться пластину37 ° C инкубаторе в течение 48 часов.
7. Через 48 часов спином вниз инфицированных клеток в 15 мл полипропиленовые трубки при 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре. Удалить СМИ стремление, будучи уверенным, чтобы не мешать осадок клеток. Ресуспендируют клеток в свежей RPMI.
8. Подтвердить эффективность инфекции в положительном образце контроля СУИМ. Как и прежде, вы можете сделать это для всех образцов, если построить содержит либо люминесцентные (например, GFP) или на поверхности клеток маркера (например, Thy1).
9. Начать выбор из мобильных телефонов (при необходимости). Наши shRNA содержащих конструкции содержат кассеты пуромицин сопротивления. Мы выбираем shRNA-инфицированных Рамос клеток с 0,25 мкг / мл пуромицин. Мы считаем, что производные клетки Рамос иногда показывают изменены восприимчивость к пуромицин и, следовательно, мы выполняем убить кривые для оптимизации концентрации пуромицин для каждой производной. Кроме лечения неинфицированных клетках управления с пуромицин чтобы подтвердить, что выбор эффективной.

<р = класс "jove_title"> 5. Одноместный посева ячейки

Одноместный посева может быть выполнена одним из двух способов: FACS сортировки или вручную.

1. FACS: Используйте FACS сортировщик с пластиной для крепления к семени 1 клетку / лунку в 96-луночного планшета предварительно заполнены 100 мкл 40% RPMI/40%, что обусловлено media/20% FBS. Этот метод дает намного больше одной ячейки клонов на чашку.
2. Вручную: Граф клеток. Развести аликвоту клеток до 10 клеток / мл в 40% RPMI/40%, что обусловлено media/20% FBS. Используйте 10 мл разбавленного клеток для каждой пластины посеяны. Различные клоны покажет переменная восстановления на данном этапе, поэтому было бы полезно создать несколько пластин при различных концентрациях (от 3 до 20 клеток / мл). Используйте тот, который производит меньше наросты, чтобы избежать клонов, возникающих из нескольких клеток). Использование многоканальной пипеткой семян 96-луночных планшетах с 100 мкл разбавленного клеток.
3. Место пластинки в 37 ° C инкубаторе в течение 2 недель.
4. Проверка отдельных скважин недеформированнойГ микроскопом, чтобы подтвердить наличие клетки в один прекрасный день после посева. Отдельные клетки может быть сложно найти из-за необходимости сосредоточить внимание на правильную глубину. Сосредоточение внимания на номера также запечатлен на дне 96-луночного планшета должна помочь. Клетки легче найти, когда посеяны на сортировщик FACS поскольку большинство скважин клетки.
5. Через 2 недели, рост колоний может быть едва видно невооруженным глазом, глядя на пластины снизу. Они намного легче увидеть под микроскопом. Колонии как правило, растут по краям хорошо, и как правило, наиболее колоний в пластину растут по отношению к этому краю в разных скважинах. Марк скважин с надежным ростом клеток и передачи клеткам 24-луночных планшетах в 1 мл RPMI и вернуться к 37 ° С инкубатор.
6. Поддерживать клетки в 1 х 10 ⁵ до 1 х 10 ^{6 клеток} / мл. Изменение средств массовой информации, крутя клетки при 400 X г в течение 4 минут при комнатной температуре и удалении СМИ по мере необходимости. Заменить на 1 мл свежей RPMI.
7. После нескольких гн я роста, передача клетки 6-луночного планшета и продолжать расти в 37 ° C инкубатора.
8. Через 3 недели, анализ клонов для IgM потери (как описано ниже).
9. Продолжайте расти клетки в течение еще 2 недель, а затем анализировать клонов снова в 5 момент времени в неделю.

6. Анализ: IgM потери (3 недели и 5 недель)

1. Алиготе 5 х 10 ^{5 клеток} из каждой лунки на 1,5 трубки микроцентрифужных мл и спина ячейки вниз при 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре. Используйте клетки от каждого из контроля и shRNA-нокдауна скважин, а также один образец для неокрашенных контроля.
2. Вымойте клеток в 1 мл ФСБ, а затем снова спина при 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
3. Ресуспендируют в 50 мкл PBS (неокрашенных контроль) или PBS + 1:20 разбавление PE-меченых α-человеческий IgM антитела. Инкубируйте на льду в течение 1 часа.
4. Спиновые ячейки вниз на 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
5. Мойте слоктя в два раза с 1 мл ФСБ и спин на 400 Х г в течение 4 минут каждый раз при комнатной температуре.
6. Удалить супернатант и ресуспендируют в 100 мкл PBS. Передача ресуспендировали окрашенных клеток к трубке СУИМ.
7. Анализ клеток с использованием машины СУИМ.
8. Сравните процент IgM ^- клетки, из управления по сравнению с shRNA разобранном клеток. Как было отмечено выше, IgM потери измеряются FACS является надежным полу-количественная мера ГИМ в клетках Рамос.

7. Анализ: Подтвердите нокдауна количественными RT-PCR (5 недель)

1. Алиготе 3 х 10 ^{6 клеток} из каждой лунки и спином вниз на 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
2. Подготовка РНК из аликвоту клеток. Мы используем TRIzol в соответствии с рекомендациями производителя.
3. Подготовка кДНК из РНК преп. Мы используем 2 мкг РНК и Надстрочный II в соответствии с рекомендациями производителя.
4. Выполните количественной ПЦР с использованием кДНК подтвержденийм нокдауна. Мы используем GAPDH как нормализация контроля и SYBR БЫСТРО комплект КПЦР в 10 мкл Общий объем реакции.

8. Анализ: геномные последовательности (5 недель)

1. Алиготе 5 х 10 ^{6 клеток} из каждой лунки и спином вниз на 400 Х г в течение 4 минут при комнатной температуре.
2. Изолировать от геномной ДНК этих клеток. Мы используем геномной ДНК SV Мастер очистки комплект в соответствии с рекомендациями производителя.
3. ПЦР усиливают геномной ДНК для Ig генов V ¹⁹ (табл. 1) и любые другие гены интерес использованием ДНК-полимеразы KAPA HiFi. Мы используем эту полимераза из-за его низкой ошибок ставки, но и любой высококачественный ПЦР-полимераза должна быть приемлемой.
4. Гель очищают продуктов ПЦР на 1% агарозном геле использованием добычу QIAquick гель комплект.
5. Некоторые полимеразы добавить один дезоксиаденозина () остаток на концах 3 'ПЦР-продуктов, в то время как другие не делают. Эти 3 'хвосты необходимы для TOPO Т.А.Клонирование шаг. Полимеразной KAPA HiFi не оставляет 3 'хвосты. Хвост продуктов ПЦР путем инкубации 25 мкл гель-очищенного продукта ПЦР с 3 мкл 10x реакции Taq буфер, 1 мкл 10 мМ дНТФ, и 1 единица Taq-полимеразы при 72 ° С в течение 30 минут.
6. Клон гель-очищенной ПЦР продуктов с использованием клонирования TOPO TA комплект. Преобразование продуктов реакции TOPO в предоставленный Е. DH5α палочка-T1 ^R компетентных клеток и пластину на LB / агара, содержащий 100 мкг / мл ампициллина и дополнены с 1,6 мг X-гал в соответствии с рекомендациями производителя.
7. Отправить отдельных колоний для секвенирования.
8. Выполните последовательность анализа для определения типа и местоположения мутации.

9. Представитель Результаты:

Как отмечалось ранее, мы используем положительный контроль вирусный вектор, который выражает и GFP, а также пуромицину гена устойчивости. Как правило, мы видим 50-75% GFP ^{+ клеток} через два дняпосле трансфекции. В наших инфекциями, мы обычно видим 50-70% клетки GFP ⁺ два дня после заражения, но до выбора. После выбора завершена,> 95% клеток GFP ^+.

В качестве представителя эксперименты, мы показываем последствия гиперэкспрессией помощи или сбить ремонт фактора в клетках Рамос. В частности, мы трансфицированных ретровирусных вектор гиперэкспрессия для AID связаны через сайт IRES к Thy1.1 вместе с упаковкой ретровирусных вектор pKat2 в Боск 23 клеток. Вирус средах отфильтровывают и затем используются для заражения клетки Рамос. Оба дикого типа (WT) и гиперэкспрессией AID (AID ^{привет)} клетки одной клетки посеяны и выросли на 3 недели, после чего они были проанализированы на экспрессии генов с QRT-PCR (рис. 2) и IgM потери FACS (рис. 3 ). Для окрашивания FACS, клетки инкубировали с обоими 1:20 разбавленный PE-меченых α-человеческий IgM антитела, а также 1:400 разбавляется FITC-меченого α-крыса CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) антител. В отдельном эксперименте, лентивирусов, содержащие либо не имеет значения shRNA (контроля) или shRNA против высококачественные репарации ДНК фактор ожидаемого для защиты от ГИМ были сделаны в Боск 23 клеток, а затем инфицированных в клон ПОМОЩИ ^привет клеток Рамос. Опять же, экспрессии генов (рис. 4) и IgM потерь (рис. 5) были проанализированы в одном клонов клетки после 3 недель. Так как ремонт фактор, как полагают, обеспечивают защиту от мутаций при ГИМ, мы видим увеличение IgM потери и ГИМ в отсутствие фактора. Если бы мы разобранном фактор, участвующий в создании ШМ-мутации, связанные с, мы увидели бы снижение IgM потери вместо этого.

Как и ожидалось, наши QRT-PCR результаты показывают заметный рост ПОМОЩИ выражение после заражения клеток с гиперэкспрессией вектор AID (рис. 2), в то время как уровни фактора репарации ДНК капля в присутствии целевых shRNA против этого фактора (Рис. 4 ). Поскольку индивидуальные clonэс может варьироваться, вы можете увидеть некоторые различия в уровне экспрессии генов. Потому что экспрессия генов может меняться, необходимо, чтобы подтвердить выражение в каждый клон вы планируете анализировать дальше. Различные shRNAs против того же гена могут оказывать различное воздействие на экспрессию генов, так что вы должны экран несколько shRNAs чтобы определить, какие имеет наибольшее влияние. Нокдаун может быть также подтвержден на уровне белка методом иммуноблотинга. Кроме того, индивидуальные клоны могут сильно варьироваться в уровнях IgM потери. Некоторые клоны могут продемонстрировать "джекпот" эффект, когда IgM мутация произошла в одном из первых клеточных делений - например, вы увидите,> 50% IgM потери просто потому, что одна из ячеек стали IgM ^- в два-клеточной стадии. Влияние этих клонов сведена к минимуму путем расчета среднего за несколько клонов одной клетке.

Рисунок 1. Схема для транс-инфекцию, инфекцию и анализ IgM потери. См. текст для деталей.

Рисунок 2. ПОМОЩИ экспрессией в клетках Рамос. WT и помощь ^привет Рамос клетки одной клетки клонированных и выращивали в течение 3 недель, после чего ПОМОЩИ выражение в отдельных клонов измерялась QRT-PCR. GAPDH выражение было использовано для нормализации. WT был установлен в 1. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.

Рисунок 3. IgM Увеличение потерь в клетках ПОМОЩИ ^привет по сравнению с WT клеток. Поверхность IgM измеряли FACS на 3 очка время недели, и процент потерь IgM был рассчитан для WT и клеток ПОМОЩИ ^{привет.} (А) представитель FACS участок WT клон и клон ПОМОЩИ ^{привет.} ПОМОЩЬ гиперэкспрессия VЭктор имеет ПОМОЩИ связаны с Thy1.1 через сайт IRES, так Thy1.1 выражение используется в качестве суррогата ПОМОЩИ выражения. (В) Количественное определение IgM потери в несколько WT и помощь ^привет клонов. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.

Рисунок 4. Нокдаун ремонт фактора в клетках ПОМОЩИ ^{привет.} Клетки были заражены либо не имеет значения shRNA контроль (контроль) или наших shRNA интереса (shRNA), и одна ячейка заполнена. Через 3 недели, экспрессия генов в отдельных клонов измерялась QRT-PCR. GAPDH выражение было использовано для нормализации. WT был установлен в 1. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.

Рисунок 5. Увеличение IgM потериВ ПОМОЩЬ ^привет клеток с разобранном уровней ремонт фактор. Поверхность IgM в нескольких клонов измерялась FACS на 3 очка время недели, и процент потерь IgM был рассчитан в клетках еще ПОМОЩЬ гиперэкспрессией. Средний значение указано. * Указывает А. П. Значение <0,01 в пересчете на одностороннее Стьюдента-тест.

Таблица 1. Primer последовательности для генов Ig ^19: постоянная См регионе, тяжелая цепь V области (V _H) и легкой цепи V области (V _L).

Обсуждение

Как обсуждалось ранее, клеточная линия моделей для антител диверсификации стали популярным отправной точкой для выявления новых белков, которые влияют на различные шаги в процессе антител диверсификации. Мы приведем здесь способ использования вирусной инфекции либо нокдауна или гиперэкспрессией белка в Рамос B-клеточной линии, а затем изучить влияние на ГИМ.

Для этих исследований, мы используем как WT Рамос и AID ^привет Рамос клеток. WT клетки могут быть использованы для изучения ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
6-подальше TC обработанные пластины	Гранулирование	3516
10 мл BD Luer-Loksyringes	BD Медицинские	309604
24-подальше TC обработанные пластины	Гранулирование	3526
96-подальше плоской нижней полистирола TC обработанных микропланшетов	Гранулирование	3596
100 мм TC обработанных блюд культуры	Гранулирование	430167
Acrodisc шприц фильтры, 0,45 мкм	Pall Life Sciences	4604
Агар	Teknova	A7777
Агароза	GeneMate	E-3120-500
Ампициллин	Сигма	A0166	100 мг / мл в воде
BD FACSCanto II потока цитометр	BD Biosciences		или аналогичный
BD Сокол труб круглого сечения нижней полистирола	BD Biosciences	352054	для FACS
Боск 23 клетки	АТСС	CRL-11270
CO 2 инкубатор способны 37 ° C
DMEM (среда Дульбекко изменение Орла)	Сигма	D6429
FBS (эмбриональной телячьей сыворотки)	Близнецы Био-продукты	100-106
FITC α-крыса CD90/mouse CD90.1 антител	BioLegend	202503	FITCα-Thy1.1
FuGENE 6 Трансфекция реагент	Roche	11814443001
HEPES буферного раствора	Invitrogen	15630-080
KAPA HiFi ДНК-полимеразы	KAPA Biosystems	KK2101
LB бульоне (лизогении бульон - А. Р. Лурия) Порошок	Difco	240230
МИССИЯ TRC shRNA бактериальных фондовом глицерина	Сигма		shRNA векторов
NCS (новорожденного телячьей сыворотки)	Близнецы Био-продукты	100-504
PBS (фосфатный буферный раствор)	Invitrogen	70011	разбавленного до 1 раза в воде
PE α-человеческий IgM антитела	BioLegend	314508
PGS (пенициллин, стрептомицин-глютамин раствора)	Близнецы Bio-PГСМ	400-110
Polybrene (hexadimethrine бромид)	Сигма	107689	10 мг / мл в воде
PureYield плазмиды системы Midiprep	Promega	A2495
Пуромицин	Сигма	P8833	250 мкг / мл в воде
QIAquick гель добычи комплект	QIAGEN	28706
Рамос (РА 1) клетки	АТСС	CRL-1596
RPMI-1640	Сигма	R8758
Надстрочный II	Invitrogen	18064-022
SYBR БЫСТРО КПЦР комплект	KAPA Biosystems	KK4601
Taq-ДНК-полимераза	Invitrogen	18038-042
ТОПО Т. А. Клонирование комплект	Инвитропоколения	K4520-01
TRIzol	Invitrogen	15596-026
Мастер С. В. Геномная ДНК система очистки	Promega	A2361
X-Gal [5-бром-4-хлор-3-indoyl-β-D-galatopyranoside]	Growcells	C-5687	40 мг / мл в ДМСО