Оценка соматических Hypermutation в Рамос-клеток после Сверхэкспрессия или Нокдаун специфических генов

Summary

Мы опишем, как выполнять ретровирусных или лентивирусов инфекции гиперэкспрессия или shRNA содержащих конструкций в человеческой Рамос B-клеточной линии и как измерить соматических hypermutation в этих клетках.

Abstract

B клетки начинают свою жизнь с низкоаффинными антителами, образующимися при рекомбинации V(D)J. Однако при обнаружении патогена вариабельная (V) область гена иммуноглобулина (Ig) мутирует примерно в 100 000 раз больше, чем остальная часть генома, посредством соматической гипермутации (SHM), что приводит к образованию высокоаффинных антител^1,2. Кроме того, рекомбинация переключателей классов (CSR) производит антитела с различными эффекторными функциями в зависимости от типа иммунного ответа, который необходим для конкретного патогена. Как CSR, так и SHM инициируются активационно-индуцированной цитидиндезаминазой (AID), которая дезаминирует остатки цитозина в ДНК для производства урацилов. Эти урацилы обрабатываются подверженными ошибкам формами путей репарации, что в конечном итоге приводит к мутациям и рекомбинации^1-3.

Наше текущее понимание молекулярных деталей SHM и CSR основано на комбинации исследований на мышах, первичных клетках, клеточных линиях и бесклеточных экспериментах. Мышиные модели остаются золотым стандартом с генетическими нокаутами, демонстрирующими критическую роль для многих факторов репарации (например, Ung, Msh2, Msh6, Exo1 и полимераза η)^4-10. Однако не все гены поддаются нокаутным исследованиям. Например, нокауты нескольких двухцепочечных белков репарации разрыва являются эмбрионально летальными или нарушают развитие В-клеток^11-14. Более того, иногда специфическая функция белка в СГМ или КСО может быть замаскирована более глобальными дефектами, вызванными нокаутом. Кроме того, поскольку эксперименты на мышах могут быть длительными, изменение экспрессии отдельных генов в клеточных линиях становится все более популярным первым шагом к идентификации и характеристике генов-кандидатов^15-18.

Рамос — клеточная линия лимфомы Беркитта, которая конститутивно подвергается СГМ — была популярной моделью клеточной линии для изучения СГМ^18-24. Одним из преимуществ ячеек Рамоса является то, что в них встроена удобная полуколичественная мера СГМ. Клетки дикого типа экспрессируют IgM, и по мере того, как они приобретают мутации, некоторые из мутаций сбивают экспрессию IgM. Таким образом, анализ потери IgM с помощью флуоресцентно-активируемого сканирования клеток (FACS) обеспечивает быстрое считывание уровня SHM. Более количественное измерение SHM может быть получено путем прямого секвенирования генов антител.

Поскольку клетки Рамоса трудно трансфицировать, мы производим стабильные производные, которые увеличивают или понижают экспрессию отдельного гена, заражая клетки ретровирусными или лентивирусными конструкциями, которые содержат либо кассету сверхэкспрессии, либо короткую шпильку РНК (shRNA) соответственно. В этой статье мы описываем, как мы заражаем клетки Рамоса, а затем используем эти клетки для исследования роли конкретных генов в СГМ (рис. 1).

Protocol

1. Подготовка образцов и клетки

1. Выполнить средний подготовки масштаба ДНК (midiprep) из гиперэкспрессия или shRNA содержащих конструкции и упаковки ретровирусных вектор pKat2 или лентивирусов векторов упаковки pVSV-G, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev ^25. Используйте 6 мкг ДНК для каждой конструкции и либо 4 мкг pKat2 (для ретровирусных инфекций) или 1,5 мкг ДНК для каждого из pVSV-г, pMDLg / pRRE и pRSV-Rev упаковки векторов (для лентивирусов инфекций).
2. Подготовка Боск 23 средств массовой информации. Для трансфекции, использовать обе среды без изменений изменение Дульбеко Орла (DMEM), а также полное DMEM. Чтобы сделать полный DMEM, добавить 1% ....

Discussion

Как обсуждалось ранее, клеточная линия моделей для антител диверсификации стали популярным отправной точкой для выявления новых белков, которые влияют на различные шаги в процессе антител диверсификации. Мы приведем здесь способ использования вирусной инфекции либо нокдауна или гиперэкспрессией белка в Рамос B-клеточной линии, а затем изучить влияние на ГИМ.

Для этих исследований, мы используем как WT Рамос и AID ^привет Рамос клеток. WT клетки могут быть использованы для изучения .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
6-подальше TC обработанные пластины	Гранулирование	3516
10 мл BD Luer-Loksyringes	BD Медицинские	309604
24-подальше TC обработанные пластины	Гранулирование	3526
96-подальше плоской нижней полистирола TC обработанных микропланшетов	Гранулирование	3596
100 мм TC обработанных блюд культуры	Гранулирование	430167
Acrodisc шприц фильтры, 0,45 мкм	Pall Life Sciences	4604
Агар	Teknova	A7777
Агароза	GeneMate	E-3120-500
Ампициллин	Сигма	A0166	100 мг / мл в воде
BD FACSCanto II потока цитометр	BD Biosciences		или аналогичный
BD Сокол труб круглого сечения нижней полистирола	BD Biosciences	352054	для FACS
Боск 23 клетки	АТСС	CRL-11270
CO 2 инкубатор способны 37 ° C
DMEM (среда Дульбекко изменение Орла)	Сигма	D6429
FBS (эмбриональной телячьей сыворотки)	Близнецы Био-продукты	100-106
FITC α-крыса CD90/mouse CD90.1 антител	BioLegend	202503	FITCα-Thy1.1
FuGENE 6 Трансфекция реагент	Roche	11814443001
HEPES буферного раствора	Invitrogen	15630-080
KAPA HiFi ДНК-полимеразы	KAPA Biosystems	KK2101
LB бульоне (лизогении бульон - А. Р. Лурия) Порошок	Difco	240230
МИССИЯ TRC shRNA бактериальных фондовом глицерина	Сигма		shRNA векторов
NCS (новорожденного телячьей сыворотки)	Близнецы Био-продукты	100-504
PBS (фосфатный буферный раствор)	Invitrogen	70011	разбавленного до 1 раза в воде
PE α-человеческий IgM антитела	BioLegend	314508
PGS (пенициллин, стрептомицин-глютамин раствора)	Близнецы Bio-PГСМ	400-110
Polybrene (hexadimethrine бромид)	Сигма	107689	10 мг / мл в воде
PureYield плазмиды системы Midiprep	Promega	A2495
Пуромицин	Сигма	P8833	250 мкг / мл в воде
QIAquick гель добычи комплект	QIAGEN	28706
Рамос (РА 1) клетки	АТСС	CRL-1596
RPMI-1640	Сигма	R8758
Надстрочный II	Invitrogen	18064-022
SYBR БЫСТРО КПЦР комплект	KAPA Biosystems	KK4601
Taq-ДНК-полимераза	Invitrogen	18038-042
ТОПО Т. А. Клонирование комплект	Инвитропоколения	K4520-01
TRIzol	Invitrogen	15596-026
Мастер С. В. Геномная ДНК система очистки	Promega	A2361
X-Gal [5-бром-4-хлор-3-indoyl-β-D-galatopyranoside]	Growcells	C-5687	40 мг / мл в ДМСО