Мы описываем набор тестов для анализа уровня экспрессии гистонов H1 компоновщика. мРНК отдельных генов H1 количественно измеряемых случайных грунтовка на основе обратной транскрипции следует ПЦР в реальном времени, в то время как белок количественно H1 гистонов достигается за счет анализа ВЭЖХ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Анализ экспрессии млекопитающих Linker-гистонов подтипы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Компоновщик гистона H1 связывается с нуклеосом частиц ядра и компоновщик ДНК, способствуя складной хроматина высшего порядка в структуре. H1 имеет важное значение для развития млекопитающих 1 и регулирует конкретные экспрессии генов в естественных условиях 2-4. Среди высоко консервативных белков гистонов, семья гистонов H1 компоновщик является наиболее разнородную группу. Есть 11 подтипов H1 у млекопитающих, которые дифференциально регулируется в процессе развития и в разных типах клеток. Эти подтипы H1 включает 5 соматических H1s (H1a-е), замена H1 0, 4 половых клеток конкретного подтипа Н1, и H1x 5. Наличие нескольких подтипов H1, которые отличаются в ДНК сродство хроматина и уплотнение способностью 6-9 обеспечивает дополнительный уровень модуляции функции хроматина. Таким образом, количественный анализ экспрессии отдельных подтипов H1, как мРНК и белков, необходимых для лучшего понимания регулирования высшегопорядок структуры хроматина и функции.
Здесь мы опишем набор тестов предназначен для анализа уровня экспрессии отдельных подтипов H1 (рис. 1). экспрессию мРНК различных генов вариант H1 измеряется набор высокочувствительных и количественные обратной транскрипции-ПЦР (QRT-PCR) анализы, которые быстрее, точнее и требуют гораздо меньше образцов по сравнению с альтернативным подходом Северной блоттинга. В отличие от большинства других клеточных сообщения мРНК, мРНК для большинства генов гистонов, в том числе большинство H1 генов, не имеют длинный хвост полиА, но содержат стволовые структуры петли на 3-нетранслируемой области (УТР) 10. Таким образом, кДНК готовят из общей РНК путем обратной транскрипции с использованием случайных праймеров, а не олиго-дТ праймеров. Realtime анализы ПЦР с праймеров, специфичных для каждого подтипа Н1 (табл. 1) выполняется для получения высокой количественного определения мРНК отдельных подтипом H1с. Экспрессия генов домашнего хозяйства анализируются в качестве контроля для нормализации.
Относительное содержание белков каждого подтипа Н1 и стержневых гистонов получается путем обратной фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) анализ всех гистонов извлечены из клеток млекопитающих, 11-13. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и элюирования условиях, описанных здесь, дают оптимальное разделение подтипов H1 мыши. По количественному профиля ВЭЖХ, вычислить удельный вес отдельных подтипов H1 H1 в семье, а также определить H1 в нуклеосомы отношения в клетках.
Протокол
1. Подготовка проб РНК и добыча
- Прежде, чем добыча РНК, все рабочие поверхности и пипетки следует протереть 70% этанола и обрабатывают РНКазы обеззараживания решения, такие как РНКазы Зап. Эта практика снижает шансы РНКазы загрязнения и деградации РНК. Надевайте перчатки для всех процедур.
- Чтобы извлечь ДНК из тканей мышей, анализировать орган интерес эвтаназии мыши и стирать ткань в ледяной фосфатного буфера (PBS: 0,13 М NaCl, 5 мМ фосфат натрия двузамещенный гептагидрат, 5 ммоль натрия дигидрофосфат гептагидрат, рН 7,4) . Немедленно приступить к добыче РНК в пункте 1.4. Если свежей ткани не должны быть обработаны для выделения РНК, образцы ткан....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Набор тестов, представленные здесь включить всесторонний анализ уровня экспрессии млекопитающих компоновщик гистонов подтипов. Правильно спроектированные QRT-ПЦР обеспечивают высокую чувствительность и точность измерений сообщений РНК с любого млекопитающего гистонов гены H1. Важной частью QRT-ПЦР для компоновщика гистонов генов подтипа является подготовка кДНК с использованием случайных грунтовка на основе обратной транскрипции. мРНК гистонов самых генов, в том числе большинство генов H1, не содержат длинный поли-хвост.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта от НИЗ GM085261 и Коалиция Грузии Рак Уважаемые премии ученого (к YF).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| РНКазы Зап | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol реагентов | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Абсолютный этанол | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy комплект мини | Qiagen | 74104 | |
| Я дезоксирибонуклеазы | Сигма | AMP-D1 | |
| Microseal 96-луночного ПЦР пластины | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| 'B' Microseal клей уплотнения | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Сахароза | Агрос Organics | AC40594 | |
| Фосфат натрия двузамещенный гептагидрат (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Американская Биоаналитическая | AB01915 | |
| Натрия дигидрофосфат гептагидрат (NaH 2 PO 4 · 7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Полное мини ингибитора протеиназ коктейль таблетки | Roche Applied Science | 11836153001 | |
| ЭДТА | Сигма | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl (ФМСФ) | Американская Биоаналитическая | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | Американская Биоаналитическая | AB01425 | |
| Хлорид калия (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Трис [гидроксиметил аминометан] | Американская Биоаналитическая | AB02000 | |
| Хлорид магния (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Серная кислота (H2SO4) | VWR | VW3648-3 | |
| Гидроксид аммония (NH 4 OH) | Агрос Organics | AC42330 | |
| Анализ белка Брэдфорд | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Ацетонитрил | EMD | AX0145-1 | |
| Трифторуксусной кислоты (ТФК) | JTBaker | 9470-01 |
Ссылки
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chrom....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
