Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

Summary

Этот метод позволяет осуществлять мониторинг клеток в реальном времени и количественных измерений различных параметров миграции клеток, таких как скорость, перемещение и скорость. В отличие от традиционных методов, это реальный подход время не на основе конечных количественных измерений миграции, вместо этого она позволяет осуществлять мониторинг и расчет различных параметров непрерывно.

Abstract

Сотовые миграция представляет собой динамический процесс, который имеет важное значение для эмбрионального развития, восстановления тканей, иммунной системы, а также опухолевой инвазии ^{1, 2.} В направленной миграции клеток быстро двигаться в ответ на внеклеточный сигнал хемотаксиса, или в ответ на внутренние сигналы ³ предоставляемых базовых механизмов подвижности. Случайные миграция происходит, когда клетка обладает низкой внутренней направленности, что позволяет клеткам, чтобы исследовать их местным условиям.

Сотовые миграция представляет собой сложный процесс, в начальной клеточной реакции происходят поляризация и продолжается выступы в направлении миграции ^2. Традиционные методы измерения миграции, таких как миграция анализа Бойден камеры простой способ измерения хемотаксис в пробирке, который позволяет измерить миграцию как результат конечной точки. Однако, этот подход позволяет ни измерения отдельных параметров миграции, а также не позволит видеотехникакристаллизации морфологические изменения, которые клетка претерпевает в процессе миграции.

Здесь мы представляем метод, который позволяет нам отслеживать миграцию клеток в реальном времени с помощью видео - микроскопия промежуток времени. Поскольку миграция клеток и вторжения являются признаками рака, этот метод будет применяться в изучении рака миграции клеток и вторжение в пробирке. Случайные миграции тромбоцитов была рассматриваться в качестве одного из параметров тромбоцитов ⁴ функция, следовательно, этот метод также может быть полезно в изучении функции тромбоцитов. Этот тест имеет то преимущество, что быстрые, надежные, воспроизводимые и не требует оптимизации числа клеток. В целях сохранения физиологически благоприятные условия для клетки, микроскоп снабжен CO ₂ и температуры подачи термостата. Сотовые движение контролируется фотосъемки с помощью камеры устанавливается на микроскоп на регулярной основе. Сотовые миграция может быть вычислена путем измерения средней скорости иverage перемещения, который рассчитывается путем программного Slidebook.

Protocol

1. Подготовка плиты покрывают коллагеном

1. Развести коллаген в конечной концентрации 10 мкг / мл Opti-сувениры СМИ.
2. Пальто 6 хорошо пластин с коллагеном, добавляя 1,5 мл с шагом 1 в каждую лунку. Выдержите в течение ночи при 4 ° C.
3. На следующий день, мыть пластину 2 раза 1x фосфатного буфера (PBS) и хранить их в PBS.

2. Подготовка клетки и посев на 6-и плиты

Примечание: используйте теплую СМИ и PBS для обеспечения оптимальных условий для движения клетки

1. Рост MDA-MB-231 (инвазивный рак молочной железы клеточная линия) редко в Дульбеко изменения Eagl....

Discussion

В режиме реального времени случайного анализа миграции позволяет точно, чувствительный, анализ миграции клеток такие параметры, как скорость и перемещение. Этот метод не ограничивается до конца значение точки измерения, следовательно, количественные. Так, клетки контролируется в нормальной средой DMEM с сывороткой, это уменьшает вредное воздействие больше инкубации в сыворотке крови свободных средств массовой информации. Было показано, что миграция клеток зависит от форматирования и разрушение клетки контактов с субстра.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Близнецы Био-продукты	100-106
Opti-сувениры	Invitrogen	31985-070
Коллаген	BD	354231
Микроскоп с живой камеры сотового и автоматизированных этапе XY контроллер	Олимп	Olympus 1X81
Экологический контроль камеры	Neue	Neue живой клетки палаты	Наше имеет пользовательский построили прямоугольную верхнюю стеклянную пластинку соответствующие оптике через верхнюю часть камеры. Прямоугольной формы вмещает несколько хорошо пластины, используемые во многих из наших экспериментальныхц.
Автоматизированный XY этап	Предварительный	До Проскан	Это позволяет точно возвращения к множеству отобранных позиций XY во время микроскопии промежуток.
Камера		Hamamatsu EM камеры C9100
Программное обеспечение	Как правило приобрести через микроскоп поставщиков, таких как Olympus	Слайд Книга 5