Методическая статья

Количественный анализ случайных миграции клеток помощью замедленной видео микроскопии

DOI:

10.3791/3585

⸱

13 мая 2012 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, LSU School of Medicine, 2Department of Oral Biology, LSU School of Dentistry, 3Stanley S. Scott Cancer Center, LSU School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет осуществлять мониторинг клеток в реальном времени и количественных измерений различных параметров миграции клеток, таких как скорость, перемещение и скорость. В отличие от традиционных методов, это реальный подход время не на основе конечных количественных измерений миграции, вместо этого она позволяет осуществлять мониторинг и расчет различных параметров непрерывно.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сотовые миграция представляет собой динамический процесс, который имеет важное значение для эмбрионального развития, восстановления тканей, иммунной системы, а также опухолевой инвазии 1, 2. В направленной миграции клеток быстро двигаться в ответ на внеклеточный сигнал хемотаксиса, или в ответ на внутренние сигналы 3 предоставляемых базовых механизмов подвижности. Случайные миграция происходит, когда клетка обладает низкой внутренней направленности, что позволяет клеткам, чтобы исследовать их местным условиям.

Сотовые миграция представляет собой сложный процесс, в начальной клеточной реакции происходят поляризация и продолжается выступы в направлении миграции 2. Традиционные методы измерения миграции, таких как миграция анализа Бойден камеры простой способ измерения хемотаксис в пробирке, который позволяет измерить миграцию как результат конечной точки. Однако, этот подход позволяет ни измерения отдельных параметров миграции, а также не позволит видеотехникакристаллизации морфологические изменения, которые клетка претерпевает в процессе миграции.

Здесь мы представляем метод, который позволяет нам отслеживать миграцию клеток в реальном времени с помощью видео - микроскопия промежуток времени. Поскольку миграция клеток и вторжения являются признаками рака, этот метод будет применяться в изучении рака миграции клеток и вторжение в пробирке. Случайные миграции тромбоцитов была рассматриваться в качестве одного из параметров тромбоцитов 4 функция, следовательно, этот метод также может быть полезно в изучении функции тромбоцитов. Этот тест имеет то преимущество, что быстрые, надежные, воспроизводимые и не требует оптимизации числа клеток. В целях сохранения физиологически благоприятные условия для клетки, микроскоп снабжен CO 2 и температуры подачи термостата. Сотовые движение контролируется фотосъемки с помощью камеры устанавливается на микроскоп на регулярной основе. Сотовые миграция может быть вычислена путем измерения средней скорости иverage перемещения, который рассчитывается путем программного Slidebook.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка плиты покрывают коллагеном

  1. Развести коллаген в конечной концентрации 10 мкг / мл Opti-сувениры СМИ.
  2. Пальто 6 хорошо пластин с коллагеном, добавляя 1,5 мл с шагом 1 в каждую лунку. Выдержите в течение ночи при 4 ° C.
  3. На следующий день, мыть пластину 2 раза 1x фосфатного буфера (PBS) и хранить их в PBS.

2. Подготовка клетки и посев на 6-и плиты

Примечание: используйте теплую СМИ и PBS для обеспечения оптимальных условий для движения клетки

  1. Рост MDA-MB-231 (инвазивный рак молочной железы клеточная линия) редко в Дульбеко изменения Eagle среднего (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). В этом примере мы используем MDA-MB-231, однако, этот метод может быть применен к любой приверженец раковых и не раковых клеточных линий.
  2. Промойте клетки в два раза теплой 1x PBS и собирать по трипсинизации. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы суповторно, что клетки правильно отделяться от лечения трипсином.
  3. Сбор клеток путем добавления DMEM среде с 10% FBS, мягко спином вниз клетки в 1000 г в течение 5 минут. Ресуспендируйте осадок клеток осторожно DMEM среде с 10% ЭТС.
  4. Перерыв осадок клеток с помощью пипетки и осторожно. Важно, чтобы сломать клетку кластеров в отдельных клетках, насколько это возможно.
  5. Подсчитайте клетки и развести до конечной концентрации 50 000 кл / мл в DMEM среде с 10% ЭТС. Внесите 2 мл в каждую лунку.
  6. Инкубируйте планшет при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе на ночь, до начала покадровой микроскопии.
  7. Чтобы обеспечить достаточное пространство для миграции, создания раны помощью кончика пипетки, вымыть тарелку с 1X PBS для удаления мусора (образуются в результате раны) и добавить DMEM с 10% ЭТС. Проверка под микроскопом плавающие клетки. Если большое количество клеток с плавающей повторить промывку. Теперь пластина готова к установке намикроскоп для получения изображений.

3. Установка микроскопа и автоматизированной обработки изображения

Есть несколько изображений программные пакеты, которые контролируют микроскоп для автоматического получения изображения. Здесь мы используем Slidebook 5,0 обработки изображений и автоматическое приобретение осуществляется на микроскопе Olympus (Olympus IX81), связанной с EM-C9100 Hamamatsu камерой, которая отлично подходит для живых клеток приложений, где скорость сбора и минимальное фототоксичности имеет первостепенное значение. Система включает в себя этап верхней палаты экологического контроля (Neue живой клетки) и автоматизированных этапе XY контроллер (До Проскан). Изображения, полученные с 10X UPLANFL Ph1/0.30 цели, в ярком режиме поля, используя определенный промежуток времени. Следующий протокол описывает получения изображений.

  1. Включите микроскоп, фотоаппарат, и живые изображения аппарата клетки. Установите пластину на микроскопические стадии. Обложка пластинки Сотовые окружающей Neue Онлайнэкологической управление камерой, которая связана с CO 2 питания и датчиков температуры. Установите термостат при температуре 37 ° C и CO 2 на уровне 5%.
  2. SlideBook программное обеспечение позволяет полностью автоматизировать объективный выбор, выбор длины волны и легкое переключение между флуоресцентным и яркие методы поле. Для того, чтобы настроить различные параметры фокусировки, открытые SlideBook программы> перейдите к меню> выберите управление фокусом, нажав> figure-protocol-1 и выберите следующие параметры:
    1. В разделе «Цель окна" определить цели, выбор из выпадающего окна. Обратите внимание, что мы используем этапе цель и вручную выбрать соответствующий кольцо этап в конденсаторе. При использовании системы с автоматизированными конденсатор, это автоматически будет установлен через программу. Кроме того, если ни одна из целей башни, ни конденсатор автоматизированы они должны каждый быть выбран ручнойют.
    2. В «Набор фильтров" коробке:
      1. Выберите настройки, чтобы направить световой поток в любой окуляр или камеру из выпадающего списка, чтобы увидеть доступные фильтры ("Live" на окуляр "Широкоугольные" для камеры в нашей системе).
      2. Выберите подходящий фильтр для светлого освещения (в нашем настройки, эта опция называется "ДВС", который представляет собой открытую позицию на пути света светлого).
      3. Выбор источника света, нажав кнопку "Открыть Светлый", чтобы открыть яркие выдержки области.
  3. Для просмотра образца под окуляр, выберите яркие поле фильтра (положение "6" в нашей системе) на турели. После первоначального просмотра образца через окуляр, чтобы найти соответствующие поля и принести образец в центре внимания (шаги 3.2.1 3.2.2.3). Переместить фильтр башни изменить путь света в камеру для захвата изображения (положение "1" в нашей системе).
  4. Автоматизированный этап позволяет выбирать различные XY координациюТЭС для захвата нескольких областях, представляющих интерес в приобретении изображений. В программном обеспечении SlideBook, перейдите в центре управления, выберите "XY", выбрать разные позиции, хотя глаза кусок, затем нажмите кнопку "уставки" замок в каждом месте для захвата изображения (рис. 1).
  5. Точная настройка фокуса камеры изображения, просматривать на экране. Это может быть достигнуто путем либо с помощью ручного управления на микроскоп или компьютер управления, который может настроить фокус в гораздо шагом мельче.
  6. Используя элементы управления в "Фокус управления" окна настройки Z позицию на сцене. Для достижения наилучших результатов, сосредоточиться на плоский сотовый выступов вблизи контакта с пластиной.
  7. Чтобы помочь с фокусировкой использовать ползунок для регулировки экспозиции, чтобы быть в соответствующем диапазоне фокусировки. Если несколько позиций XY были отобраны, настроить фокус для каждого отдельного положения: В фокусе управления> XY> Визит точки. Примечание: это делается, чтобы убедиться, тыс.на месторождениях правильно ориентированы на оптимальный снимок.
  8. Используйте программное обеспечение для настройки параметров захвата окна. В SlideBook, откройте захвата, выбрав figure-protocol-2 в строке меню. См. Рисунок 2. Затем проверьте следующие параметры.
    1. Проверьте Захват типа> как промежуток времени.
    2. Проверьте набор фильтров: Широкое поле: DIC (для яркого изображения поля).
    3. "Захват Временной интервал" является число временных точек, которые будут захвачены (она может варьироваться, в зависимости от типа клеток). Продолжительность составляет общая протяженность времени для экспериментов. Единицы измерения времени [в миллисекундах (мс), секундах (с), минут (м) или часов (час)] может быть выбран из выпадающего меню.
    4. "Интервал" является задержка между началом одного timepoint и в начале следующего timepoint. При вводе в двух из этих значений, третье поле будет рассчитана автоматически.
    5. Несколько захвата XY: выберите "мультисписок точек "более чем на 1 XY позиции.
    6. Имя файла. В данном примере, мы назвали его '231 '.
  9. Чтобы избежать неожиданных выключение компьютера в связи с несколькими изображениями, использовать «катушку вариант" для сохранения файла. Это не является обязательным, однако настоятельно рекомендуется. Для этого, по захвату Contro л> выберите Advanced> Spool> Захват памяти и сохранить в файл очереди после каждого момента времени. Просмотрите папку для сохранения файлов слайд книги (рис. 3). Созданный фильм можно будет импортировать в указанном месте. Шаги микроскопа установки были суммированы в файл 3,1 .

4. Обработки изображений и анализа миграции: Расчет скорости и перемещения

В этом примере, обработка изображений производится SlideBoОК 5, 6 5.0. Существуют и другие программы, такие как ImageJ 7 для обработки и анализа изображений.

  1. Импорт SlideBook файлы, созданные с изображениями различных областях в различные моменты времени. К меню> в меню Image> Import> Авто книги катушку> выберите нужный файл (рис. 4а).
  2. Здесь наша цель отслеживать движение отдельных клеток. Это можно сделать с помощью автоматического отслеживания или индивидуального сопровождения. В этом примере мы использовали ручной слежения, так как это облегчает исключает артефакты легко, который является более сложным с автоматического отслеживания.
  3. Откройте файл SlideBook, в которых мы должны выполнить слежения. В меню выберите Mask> Протокол частиц отслеживания> Руководство частиц отслеживания протокола (рис. 4б). На экране появится окно с начальным и конечным моментами времени (рис. 4в).
  4. Бегип отслеживать движение отдельных клеток, нажав кнопку в центре каждой клетки (ядра). Отслеживать около 10 клеток из каждого фильма и по крайней мере трех различных фильмов должны быть выбраны из разных мест, так что около 30 клеток будут проанализированы с одного эксперимента. Каждый эксперимент следует повторить три раза. Для обеспечения объективного подхода, выделите ячейки из разных мест, таких как некоторые клетки от передней, средней, углы и т.п. Нажмите "OK", когда отслеживание осуществляется.
  5. Случайные миграции могут быть проанализированы с помощью измерения изменений скорости и т.д., скорости или смещения Для анализа данных, в меню> выберите маску> частица отслеживания> частица отслеживания протокола. Выберите параметры отслеживания, как описано ниже: (рис. 5а):
    1. Трек с - выбор параметров, которые вы хотите отслеживать из выпадающего списка. В этом примере мы использовали, центр района (координаты центра ОбьJect).
    2. Нажмите кнопку "отслеживать и продолжить». После отслеживания завершен, это автоматически перейдет к следующему шагу.
  6. Выберите нужный статистику по каждому пути, такие, как перемещение и средней скорости (см. рис 5б):
    1. Средняя скорость - общее пройденное расстояние, деленное на время прохождения этого расстояния.
    2. Всего Водоизмещение - общее расстояние, пройденное объектом.
    3. Нажмите кнопку "Рассчитать и продолжить", если вы хотите, чтобы перейти к следующему шагу, или просто выбрать "Рассчитать", если вы хотите просмотреть статистику, не переходить к следующему шагу. Будет создан файл, который может быть сохранен в текстовый файл и в дальнейшем могут быть экспортированы в Excel.
  7. Для того, чтобы отслеживать объекты, используя автоматизированный протокол слежения, сначала маска должна быть создана.
    1. Выберите Mask> сегмента Image> сегмент окно будет появляться> выбрать до порога достигается такой, что сентябрьarating один объект от других> нажмите Применить> ОК (рис. 5в). Шаг 4.5.1 то же самое.
    2. Удаление объектов меньше, чем - Этот флажок, чтобы выборочно удалить объекты меньше заданного размера. Введите размер в поле ввода и выбрать один микрон или пиксели в качестве единицы. Это используется для удаления артефактов, часто вызваны мусора.
    3. Минимальное движение - ввести минимальное количество времени, моменты, которые необходимо отслеживать для того, чтобы определить пути.
    4. Максимальное движение - Введите максимальное движение, которое можно ожидать от любого объекта из одного момента времени к следующему.
    5. Шаги для анализа данных, такие же, как руководство слежения (см. шаги 4.5.2 на 4.6.2).

5. Представитель Результаты

Примером случайного анализа миграции как количественно с точки зрения скорости и перемещения (рис. 6). После экспорта файл то Excel, данные отображается с использованием окна и усы сюжет. Статистический анализ сравнения общим водоизмещением и среднюю скорость движения между основной и контрольной осуществляется с помощью теста Манна-Уитни. Тестовый образец показывает увеличение средней скорости по сравнению с контролем. Тестовый образец показывает увеличение общего смещения по сравнению с контролем.

Фильм контроля и испытаний: Управление MDA-MB-231 и тест MDA-MB-231 клеток высевали на коллаген ночь. Покадровый видео микроскопа была выполнена под микроскопом Olympus, связанной с EM-Хамамацу камеры. Изображения взяты с интервалом в 1 час в общей сложности 18 часов во время случайных миграции. Пожалуйста, смотрите фильм 1 и фильм 2 случайные миграции управления и испытания образцов.

Микроскоп установки:

figure-protocol-3
Рисунок 1. Настройка нескольких точек на изображении захватить.

figure-protocol-4
Рисунок 2. Шагов изображающие захвата контроля. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

figure-protocol-5
Рисунок 3. Как сохранить несколько изображений.

dflinebreak "> Обработка изображений и анализа миграции.

figure-protocol-6
Рисунок 4а. Шаги для импорта изображений для анализа данных.

figure-protocol-7
Рисунок 4б. Шаги для анализа данных с использованием частиц отслеживания протокола.

figure-protocol-8
Рисунок 4c. Окна изображающие путь длиной гусеничных частиц.

Этапы анализа данных.

figure-protocol-9
Рисунок 5а. Шаги изображающие параметры частиц протокол слежения.

figure-protocol-10
На рисунке 5б. Выбор пути статистику для анализа.

figure-protocol-11
На рисунке 5в. Шаги для создания маски для автоматического отслеживания протокола.

figure-protocol-12
Рисунок 6. Средняя скорость движения (рис.6а) и смещения (рис. 6б) строится на участке усы. Тестовый образец показывает увеличение скорости и перемещения как по сравнению с контролем.

Кино

Фильм 1. Миграция контрольных клеток. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Фильм 2. Миграция тест клеток. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Управление MDA-MB-231 и тест MDA-MB-231 клетки высевают редко на коллаген для ночлега. Покадровый видео микроскопа была выполнена под микроскопом Olympus, связанной с EM-Хамамацу камеры. Изображения взяты с интервалом в 1 час в течение 18 часов во время случайных миграции. Пожалуйста, смотрите фильмы случайных миграции для контроля и испытаний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В режиме реального времени случайного анализа миграции позволяет точно, чувствительный, анализ миграции клеток такие параметры, как скорость и перемещение. Этот метод не ограничивается до конца значение точки измерения, следовательно, количественные. Так, клетки контролируется в нормальной средой DMEM с сывороткой, это уменьшает вредное воздействие больше инкубации в сыворотке крови свободных средств массовой информации. Было показано, что миграция клеток зависит от форматирования и разрушение клетки контактов с субстра...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Amanda Struckhoff для начальной помощь в проведении эксперимента. Эта работа была поддержана грантом от NIH 5RO1CA115706.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
DMEM Thermo Scientific SH30243.01
FBS Близнецы Био-продукты 100-106
Opti-сувениры Invitrogen 31985-070
Коллаген BD 354231
Микроскоп с живой камеры сотового и автоматизированных этапе XY контроллер Олимп Olympus 1X81
Экологический контроль камеры Neue Neue живой клетки палаты Наше имеет пользовательский построили прямоугольную верхнюю стеклянную пластинку соответствующие оптике через верхнюю часть камеры. Прямоугольной формы вмещает несколько хорошо пластины, используемые во многих из наших экспериментальныхц.
Автоматизированный XY этап Предварительный До Проскан Это позволяет точно возвращения к множеству отобранных позиций XY во время микроскопии промежуток.
Камера Hamamatsu EM камеры C9100
Программное обеспечение Как правило приобрести через микроскоп поставщиков, таких как Olympus Слайд Книга 5

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
  2. Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
  3. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  4. Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
  5. Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
  6. Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
  7. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
  8. Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
  9. Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
  10. Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
  11. Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
  12. Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
  13. Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
  14. Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Slidebook

Похожие статьи