Методическая статья

Перенос генов в разработке мыши Внутреннее ухо по В Vivo Электропорация

DOI:

10.3791/3653

⸱

30 июня 2012 г.

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышь внутреннее ухо плакоды производных органа чувств чье развитие программа разработана во время беременности. Мы определяем Внутриутробно Перенос генов техника, состоящая из трех этапов: мышь вентральной лапаротомия, transuterine микроинъекции, и В естественных условиях Электропорации. Мы используем цифровой микроскопии видео, чтобы продемонстрировать критической экспериментальных эмбриологических методов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутреннее ухо млекопитающих содержит 6 различных сенсорных эпителиев: 3 кристы в ампулах полукружных каналов; макулы в макуле утрикула и саккулюса; и кортиев орган в закрученной улитке. Кристы и макулы содержат вестибулярные волосковые клетки, которые преобразуют механические стимулы для обеспечения специального чувства равновесия, в то время как слуховые волосковые клетки в кортиевом органе являются первичными преобразователями слуха 1. Спецификация судьбы клеток в этих сенсорных эпителиях и морфогенез полукружных каналов и улитки происходят во вторую неделю гестации у мыши и в значительной степени завершаются до рождения 2,3. Исследования развития внутреннего уха мыши обычно проводятся путем сбора трансгенных эмбрионов на различных эмбриональных или постнатальных стадиях для изучения молекулярной основы клеточных и/или морфологических фенотипов 4,5. Мы предполагаем, что перенос генов в развивающееся внутреннее ухо мыши in utero в контексте исследований усиления и потери функции представляет собой дополнительный подход к традиционному трансгенезу мышей для изучения генетических механизмов, лежащих в основе развития внутреннего уха млекопитающих6.

Экспериментальная парадигма для проведения исследований мисэкспрессии генов в развивающемся внутреннем ухе мыши, представленная здесь, состоит из трех основных этапов: 1) вентральная лапаротомия; 2) трансутеринная микроинъекция; и 3) электропорация in vivo. Вентральная лапаротомия представляет собой хирургическую технику с выживанием мыши, которая позволяет вывести матку наружу для получения экспериментального доступа к имплантированным эмбрионам7. Трансутеринная микроинъекция заключается в использовании скошенных стеклянных капиллярных микропипеток для введения экспрессионной плазмиды в просвет отоцисты. Электропорация in vivo — это применение прямоугольных импульсов постоянного тока для доставки экспрессионной плазмиды в клетки-предшественники8-10.

Ранее мы описывали данный метод переноса генов на основе электропорации и привели подробные примечания к каждому этапу протокола11. Экспериментальные эмбриологические методы работы с мышью бывает трудно освоить, используя только текстовые описания и статические изображения. В настоящей работе мы демонстрируем 3 этапа процедуры переноса генов. Что наиболее важно, мы используем цифровую видеомикроскопию, чтобы точно показать, как: 1) определить ориентацию эмбриона in utero; 2) переориентировать эмбрионы для точного введения инъекций в отоцисту; 3) микроинъектировать смесь ДНК с раствором красителя-маркера в отоцисту на эмбриональные дни 11.5 и 12.5; 4) провести электропорацию инъектированной отоцисты; и 5) маркировать электропорированные эмбрионы для постнатального отбора при рождении. Мы приводим репрезентативные примеры успешно трансфицированных внутренних ушей, иллюстрированный гид по наиболее распространенным причинам ошибок при таргетировании отоцисты, обсуждаем способы предотвращения типичных методологических ошибок и представляем рекомендации по написанию протокола по уходу за животными при переносе генов in utero.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Брюшной Лапаротомия

  1. Обезболить плотины, эмбрионы которых находятся в эмбриональном день 11.5 (E11.5; полдень в день вагинальным вилка обнаруженного день 0,5 эмбрионального развития) путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия раствор анестетика (7,5 мкл на грамм массы тела). Рабочий раствор анестетика: 180 мкл 50 мг / мл раствора натрия фенобарбитала, 100 мкл абсолютного этанола, 320 мкл 65 мг / мл водного сульфата магния (модулирует тонус матки) и 400 мкл пропиленгликоля (транспортное средство смешивается с водной и органической компонентов).
  2. Оценка полноты анестезией путем проведения испытаний вредных раздражителей: сжатие лапы, хвост щепотку, и мигают ответ на щеке и вибриссы ощупь. Применять мазь стерильной глазной для роговицы.
  3. Бритье брюшной мех из надлобковой области, грудной клетки при помощи ножниц и штраф лезвия (Остер № 40 лопасти). Лечить живот с 70% этанола, 10% повидон йод (Бетадин),70%-го этилового спирта, последовательно. Место мыши живота стороной вниз на стерильной драпировки, а затем установить на грелку или теплую плиту (37 ° C) в течение 2-5 минут.
  4. Надрезать кожу с живота на вентральной срединной линии с шаровым наконечником ножницами. Расширить разрез на 10-14 мм. Определить белой линии, асептического, белая полоса соединительной ткани вдоль брюшной средней линии брюшной стенки. Надрезать белой линии с шаровым наконечником ножницы и расширить разрез 10-14 мм. Сразу орошения брюшной полости с нагретого (37 ° С) раствором лактата Рингера.
  5. Воплощать два рога матки с кольцом щипцы без применения избыточного давления на имплантацию сайтов. Промывать вовне рога матки с нагретого, лактата раствор Рингера.

2. Transuterine Микроинъекция

  1. Изготовление толстостенных, боросиликатного стекла капиллярной пипетки микроинъекции со следующими характеристиками: 12-16 μм и наружным диаметром 20 градусов фаски. На Саттер P-97 Съемник пипетки с небольшим нить окна, используйте следующие программы: тепло = тест рампы и 3 единицы; давление = 200; тянуть = 0, скорость = 46; время = 100). С Саттер BV-10 beveler, используйте 104C (золото) абразивный диск для большого диаметра пипетки. Ресуспендируйте выражение плазмида на 3-4 мкг / мкл кальция бесплатно фосфатный буферный раствор (рН 7,2-7,4). Добавить зеленый кристаллический быстро к концентрированному ДНК, вихревые мягко в течение 30 секунд, а спина в 10000 г на 10 секунд. Минимальная сумма быстро зеленый требуется визуально отслеживать эффективность инжекции определяется эмпирически. Засыпки скошенной пипеткой с ДНК / быстрый зеленый раствор. Подключите загруженных пипетки микроинъекции в пипетку владельца давление инжектора (Picospritzer использовании> 99% чистого азота в качестве источника газа).
  2. Transilluminate матки с низкой интенсивностью, галогенная лампа для визуализации эмбриона в его имплантации. Определить BEATing сердца, головного мозга пузырьки, конечности почки, зарождающийся 4-го желудочка задний мозг и глаза. Промывать матки каждые 2 минуты с нагретого, лактата раствор Рингера для поддержания гидратации. Применить мягкое давление на матку переориентировать эмбрион и определить анатомические ориентиры, указанных выше.
  3. Восток эмбриона для выявления первичных вен головы которых передние и задние ветви фланге мезенхимальных территории, на которой проживает отоциста. Отоциста надлежащее не видно на просвет матки. Отоциста находится на полпути между передней и задней ветвей основной вен головы, которая, наряду с основной ствол вены, образуют форму стойками или стойками на американском футбольном поле. Отоциста находится на полпути между стойками.
  4. Вставьте инъекции пипетки через матку в траекторию в соответствии с предполагаемым расположение отоциста. Импульсный microinjector раз после прохождения Утэрнам визуализировать красителя трассирующими и приблизительное расположение кончика пипетки. Предварительный пипетки под контролем микрометра и пульс снова оценить глубину. Дальнейшее продвижение пипетки в боковой мезенхимы голову и пульс несколько раз. Успешное таргетинг отоциста покажет конической формы эндолимфатического канал сверху и гребешка оболочку форма вестибюля. Отпустите давление на матку, удалите из пипетки эмбриона / матки в одно движение, и сразу орошения матки с нагретого, лактата раствор Рингера.

3. В естественных условиях Электропорация

  1. Промывать матки раствором лактата Рингера. Решение Свеженанесенный лактата Рингера необходимо электрически пару весло стиля электроды к матке. Смочите вольфрамовой поверхности электродов с лактата Рингера. Центр вводится отоциста на пути электродов. Мягко сжатие матки с электропорации годовыхddles. Катод находится в контакте с боковой стенки матки вводят в отоциста и анод находится в контакте с стенке матки, прилегающих к uninjected отоциста. Запуск поезда квадратных пульсовой волны с ножным переключателем педали электропоратора. Электропорация параметры: 5, 50 мс импульсы на 43 вольт в импульсе и 950 мс межимпульсным задержки. Сразу орошения матки после импульсов поступает. Запись текущей доставлены в ткани: 60-100 mAmps достаточно для трансфекции слухового эпителия прародителей. Вводите и electroporate 4-6 E11.5 эмбрионов в плотине.
  2. Выполнение второго, независимого transuterine микроинъекции водных люминесцентные декстрана (Alexa Fluor 488, если выражение плазмида кодирует красный флуоресцентный белок или Алекс Fluor 594, если выражение плазмида кодирует зеленый флуоресцентный белок) в 4-й желудочек тех эмбрионов, внутренняя уши точно вводить не менее 60 mAmps текущего импульса в де-сель в электропорации. Люминесцентные декстран будет обнаружить при рождении в задний мозг и позволяют выбор щенков, чей внутренний слух манипулировать во время эмбриогенеза (см. 3.5).
  3. Промывать рога матки с лактата Рингера. Вставьте рога матки в брюшную полость. Промойте полости матки с 2-4 мл нагретого, лактата раствор Рингера и позволяют переполнения для слива из разреза на стерильной драпировки. Замените драпировки с сухим, стерильным материалом. Ушивания брюшной стенки с не режущей иглы и 6-0 рассасывающиеся нити. Мы предпочитаем работает стежка, блокируя все остальные строчки, как брюшной стенки и кожу.
  4. Сухой мех плотин и управление нестероидные противовоспалительные, такие как мелоксикам в виде подкожных инъекций. Вернуться плотины на подогретую клетке восстановление на стерильной драпировки. Мониторинг и запись плотины "дыхания, проходимость разреза, и влагалище кровавые выделения. Кровотечение раповторно, но если они присутствуют, и ослабевает, усыпить плотины в то время как она все еще под наркозом. Обратите внимание, когда она приходит в сознание и пытается передвигаться. Вернуться плотины мыши колонию, когда она проявляет признаки есть и пить и начал строить гнездо. Как правило, это происходит в течение 12 часов.
  5. При рождении (постнатальный день 0), флэш-задний мозг области каждого щенка в помете обнаружить люминесцентные декстран помощью stereofluorescence рассечения микроскоп с GFP или Texas Red набор фильтров по мере необходимости. Вернуться на кормящих плотины только щенков, которые отображают задний мозг маркировки.

4. Представитель Результаты

figure-protocol-1
Рисунок 1. Электропорация-опосредованного переноса генов в развивающихся улитки. E11.5 отоциста вводили с выражением плазмиды, кодирующей расширения зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и электропорации (импульс трав параметрах: пять, 43 вольт импульсов 50 мс / импульс и 950 мс межимпульсным задержки). А) представитель внутреннее ухо от послеродовой день 6 (Р6) щенок которого отоциста вводили и электропорации в E11.5 демонстрируя EGFP выражении от основания до середины поворота улитки. Боковой стенке улитки был отстранен от середины поворота и вершина всего. E11.5 предшественников, которые приводят к вершине, не трансфицированных. B) Всего крепление иммунной из улитки (A) с маркером клетки волос, миозин 7а (Myo7a), показывает, что EGFP выражение следует траектории органа Корти и грубо локализуется в волосковых клеток, несущих сенсорного эпителия. C) представитель внутреннее ухо от E18.5 эмбрион которого отоциста вводили и электропорации в E11.5. Лазерной конфокальной проекция показывает EGFP выражение в Myo7a-положительных волосковых клеток. D) лазерный конфокальный проекцию улитки сенсорного эпителия из E18.5 органа Корти указывает EGFP expressioл во внутренних волосковых клеток (IHC), наружных волосковых клеток (НВК), внутренний phalangial клеток (МПК), столб клеток (ПК), и клетки Дейтерса (постоянного тока). Шкалы (В) относится к (А).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перенос генов в развивающихся мыши внутреннего уха: мышь внутреннее ухо развивается из слуховой плакоды в течение первой недели постимплантационных развитии 12,13. В эмбриональном день 9,5 (E9.5), плакоды был инвагинировать и превратился в заполненных жидкостью пузырьков называется отоциста 2. Otic предшественников в пузырьков приводит к сенсорной и nonsensory клеток в зрелые внутреннего уха, а также нейроны, которые иннервируют механически чувствительных волосковых клеток в вестиб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим издательство Humana Press за разрешение опубликовать рисунок по изготовлению микроинъекционной пипетки, который первоначально был представлен на странице 130 в источнике 11; Ларри Длугаса и Стивена Вонга из отделения образовательных коммуникаций OHSU за видеосъемку; Ларри Длугаса за дизайн и монтаж видео; Адама М. О'Куинна, старшего дизайнера Trion/Envirco, за разработку нашей специализированной горизонтальной ламинарной установки и Леса Голдсмита за предоставление технической схемы; Виктора Монтерросо, MV, MS, PhD, и Тома Чаткупта, DVM, из отделения сравнительной медицины OHSU за помощь в разработке протокола ухода за животными, хирургических методов и режима профилактической анальгезии; Марселя Перре-Жантиля, DVM, MS, за предоставление методического материала по методам ветеринарного наложения швов; Эдварда Порсова, MS, за проектирование нашей компьютерной рабочей станции для видеомикроскопии в Adobe Premiere Pro; а также Лии Уайт и Джонасу Хинкли из LNS Captioning (Портленд, Орегон). Данная работа была поддержана грантами Национального института глухоты и других нарушений коммуникации: DC R01 008595 и DC R01 008595-04S2 (для JB) и P30 DC005983 (базовый грант Орегонского центра исследований слуха, главный исследователь Питер Гиллеспи).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Micro стерилизации дело ROBOZ RS-9900a 8X8.5X1.25 дюймов
Мяч наконечником ножницы Изобразительных средств наук 14109-09
Кольцо щипцы Изобразительных средств наук 11106-09 4,8 ID/6mm OD
Пинцет Адсон тканей Изобразительных средств наук 11027-12
Иглы водитель Изобразительных средств наук 12502-12
Лоток аллергии Шприц Becton Dickison 305536
Шов 6-0 Syneture GL-889 0,7 метрических желудочно-кишечный шов
Лактата Рингера инъекций USP Бакстер 2B2323
Быстрый зеленый Sigma Aldrich F7258
Боросиликатного стеклянного капилляра Гарвардский аппарата 30-0053
Nembutal раствора натрия OVATION Фармацевтическая продукция Inc НДЦ 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Пропиленгликоль Fisher Scientific P355-1
Этанол Sigma Aldrich E7023-500
Мелоксикам Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Микропипетки Puller Саттер инструменты P-97 FB255B поле нити, консультации Внесите Cookbook из инструментов Саттер
Микроэлектродные Beveler Саттер инструменты BV-10 104C диск фаски на большой пипетки, обратитесь к руководству пользователя для скашивания теории
Микропипетки держатель Warner Instruments MP-S15T Для 1,5 внешний диаметр пипетки и женского порт давления для труб Picospritzer.
Пинцет стиле электрод Protech International, Inc CUY650P5 5 мм, внешний диаметр
Площадь волна электропоратора Protech International, Inc CUY21EDIT Педали рекомендуемых
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Педали рекомендуемых
Руководство управления Микроманипулятор Гарвардский аппарата 640056
Горизонтальная ламинарный поток чистой поверхности Envirco Пользовательские модификации LF 630-10554. См. дополнительную информацию на капот схеме.
Leica stereofluorescence рассечения microcope с Lumencor двигатель SOLA свет Бартельс и Stout и Lumencor MZ10F с Lumencor двигатель SOLA свет Footpedals сосредоточиться MZ10F и для запуска двигателя SOLA свет рекомендуется
Alexa Fluor 594 Декстран Invitrogen D22913 10mg/ml, водный
Alexa Fluor 488 Декстран Invitrogen D22910 10mg/ml, водный
Enviro-DRI Пастырь особого ПапERS www.ssponline.com

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
  2. Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
  3. Kelley, M. W. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat. Rev. Neurosci. 7, 837-849 (2006).
  4. Ohyama, T. BMP signaling is necessary for patterning the sensory and nonsensory regions of the developing mammalian cochlea. J. Neurosci. 30, 15044-15051 (2010).
  5. Pan, W., Jin, Y., Stanger, B., Kiernan, A. E. Notch signaling is required for the generation of hair cells and supporting cells in the mammalian inner ear. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15798-15803 (2010).
  6. Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Mitchell, J. C., Ricci, A. J., Brigande, J. V. Functional auditory hair cells produced in the mammalian cochlea by in utero gene transfer. Nature. 455, 537-541 (2008).
  7. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, The National Academy Press. (2010).
  8. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).
  9. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44, 5-14 (2006).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Brigande, J. V., Gubbels, S. P., Woessner, D. W., Jungwirth, J. J., Bresee, C. S. Electroporation-mediated gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol. Biol. 493, 125-139 (2009).
  12. Morsli, H., Choo, D., Ryan, A., Johnson, R., Wu, D. K. Development of the mouse inner ear and origin of its sensory organs. J. Neurosci. 18, 3327-3335 (1998).
  13. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta. Otolaryngol. , Suppl 285. 1-77 (1971).
  14. Sheffield, A. M. Viral vector tropism for supporting cells in the developing murine cochlea. Hear Res. 277, 28-36 (2011).
  15. Bedrosian, J. C. In vivo delivery of recombinant viruses to the fetal murine cochlea: transduction characteristics and long-term effects on auditory function. Mol. Ther. 14, 328-335 (2006).
  16. Reisinger, E. Probing the functional equivalence of otoferlin and synaptotagmin 1 in exocytosis. J. Neurosci. 31, 4886-4895 (2011).
  17. Magnani, E., Bartling, L., Hake, S. From Gateway to MultiSite Gateway in one recombination event. BMC Mol. Biol. 7, 46(2006).
  18. Perret-Gentil, M. Principles of Veterinary Suturing. , The University of Texas at San Antonio. Forthcoming.
  19. Oesterle, A. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , Sutter. (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

11 5GFP

Похожие статьи