Характеристика T-клеточных эпитопов патогенов, вызывающих локальные инфекции, таких как вирус папилломы человека, представляет собой сложную задачу из-за ограниченного количества циркулирующих T-клеток. В данной работе описан метод, с помощью которого редкие T-клетки были изолированы и охарактеризованы, исходя из очень малого количества исходных клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование интерферона-γ энзимных Анализ Immunospot для характеристики Роман Т-клеточных эпитопов вируса папилломы человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Был разработан протокол для преодоления трудностей, связанных с выделением и характеристикой редких T-клеток, специфичных к патогенам, таким как вирус папилломы человека (ВПЧ), которые вызывают локализованные инфекции. Описываемые этапы включают идентификацию области (областей) белков ВПЧ, содержащих T-клеточный эпитоп (эпитопы) конкретного субъекта, селекцию пептид-специфичных T-клеток на основе секреции интерферона-γ (IFN-γ), а также выращивание и характеристику клонов T-клеток (Рис. 1). Субъектом 1 был пациент, у которого недавно по результатам биопсии была диагностирована плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия высокой степени, и которому в день забора T-клеток была проведена петлевая электрохирургическая эксцизия в целях лечения1. Область в белках E6 и E7 вируса папилломы человека 16-го типа (HPV 16), содержащая T-клеточный эпитоп, была идентифицирована с помощью анализа IFN-γ методом иммуноспот-анализа с помощью фермента (ELISPOT), проведенного с использованием перекрывающихся синтетических пептидов (Рис. 2). Данные этого анализа были использованы не только для идентификации области, содержащей T-клеточный эпитоп, но и для оценки количества эпитоп-специфических T-клеток, а также для их выделения на основе секреции IFN-γ с использованием коммерчески доступных магнитных шариков (набор для выделения CD8 T-клеток, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Отобранные секретирующие IFN-γ T-клетки разбавляли и выращивали по отдельности в присутствии смеси облученных фидерных клеток для обеспечения роста одной T-клетки на лунку. Эти клоны T-клеток проходили скрининг с помощью анализа IFN-γ ELISPOT в присутствии пептидов, перекрывающих идентифицированную область, и аутологичных B-лимфобластоидных клеток (LCL), трансформированных вирусом Эпштейна-Барр (полученных по методу Walls и Crawford)2, чтобы минимизировать количество необходимых клеток клона T-клеток. Вместо использования 1 x 105 клеток на лунку, что обычно применяется в анализах ELISPOT1,3, использовали 1 000 клеток клона T-клеток в присутствии 1 x 105 аутологичных LCL, что значительно сократило потребность в клетках клона T-клеток. Аутологичные LCL служили не только для презентации пептидных антигенов клеткам клона T-клеток, но и для поддержания высокой плотности клеток в лунках, что позволяло эпитоп-специфическим клеткам клона T-клеток секретировать IFN-γ. Это обеспечивает успешное проведение анализа IFN-γ ELISPOT. Аналогичным образом анализы IFN-γ ELISPOT использовались для характеристики минимальной и оптимальной аминокислотной последовательности CD8 T-клеточного эпитопа (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) и его элемента ограничения HLA I класса (B58). Анализ IFN-γ ELISPOT также проводили с использованием аутологичных LCL, инфицированных вирусом вакцины, экспрессирующим белок HPV 16 E6 или E7. Результат показал, что T-клеточный эпитоп E6 подвергается эндогенному процессингу. Было продемонстрировано перекрестное распознавание гомологичного T-клеточного эпитопа других типов ВПЧ высокого риска. Данный метод также может быть использован для описания эпитопов CD4 T-клеток4.
Протокол
С помощью анализа ИФН-γ методом ELISPOT с использованием линии CD8 Т-клеток, полученной от субъекта 1, было установлено, что область HPV 16 E6 46-70 содержит Т-клеточный эпитоп1 (Рис. 2), и специфические к эпитопу Т-клетки были отобраны на основе секреции ИФН-γ до начала выполнения данного протокола (Рис. 1).
1. Лимитирующее разведение эпитоп-специфичных Т-клеток
- Приготовьте смесь кормильческих клеток, смешав облученные (4000 рад) аллогенные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) в концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл, облученные (4000 рад) аутологичные В-лимфобластоидные клетки, трансформированные вирусом Эпштейна-Барр (LCL), в концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл и облученные (4000 рад) клетки линии K562, экспрессирующие мембраносвязанный человеческий интерлейкин-15 и 4-1BB-лиганд (K562-mb15-41BBL), в концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл.5 клеток/мл, алогенные ЛКЛ, облученные (5000 рад), при концентрации 5 × 104 клеток/мл и фитогемагглютинин (PHA) в 0.1 μg/ml с использованием полной среды Исселя, содержащей 1 % смешанной человеческой сыворотки. Все манипуляции с клетками должны проводиться в стерильных условиях на протяжении всего протокола.
- Последовательно разбавьте выделенные Т-клетки, специфичные к эпитопу (Рис. 3) с использованием смеси кормовых клеток до достижения концентрации 0,5 клетки/100 μl или 5 клеток/1 мл. Используйте приблизительно 3 x 103 T-клетки, специфичные к эпитопу.
- Пластина 100 μl/well разделение разбавленных эпитоп-специфических Т-клеток в общей сложности на 30–60 планшетов с 96 круглодонными лунками с использованием многоканального пипеттора
- Инкубируйте планшеты в инкубаторе при 37 °C, 5 % CO2.
- На 5-й день добавить 100 μl полной среды Исселя, содержащей 20 ед/мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (rhIL-2)
- Визуально определите растущие клон Т-клеток в 96-луночных планшетах с круглым дном по крупным осадкам на дне.
- На 11–14 день приготовьте новую смесь кормовых клеток, смешав облученные (4000 рад) аллогенные ПБМК в концентрации 1 × 106 клеток/мл, алогенные ЛКЛ, облученные (5000 рад), в концентрации 1 × 105 клеток/мл и PHA в концентрации 0.1 μg/ml с использованием полной среды Исселя. Нанесите эту новую смесь кормовых клеток в 24-луночный планшет по 1 мл/лунку.
- Аспирируйте клетки Т-клонов индивидуально из каждой лунки с помощью микропипетки, способной удерживать около 200 μl объёма
- Разделите клоны Т-клеток по отдельности в 24-луночные планшеты, содержащие новую смесь кормовых клеток. Повторяйте, пока все клоны Т-клеток не будут перенесены.
2. Выявление клонов Т-клеток, специфичных к эпитопу, с помощью высокопроизводительного скринингового анализа методом ELISPOT (адаптировано из метода, описанного Ларссоном) и др.5 )
- Покройте 2 стерильные планшета для ELISPOT (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) 50 μl/well первичного анти-IFN-γмоноклональное антитело (клона D1K, Mabtech, Стокгольм, Швеция), разведенное до 5 μg/ml в стерильном фосфатном буферном растворе (PBS), пригодном для культивирования тканей, в течение не менее 1 ч 4 °C.
- Промойте лунки 150–200 мкл 1× буфера для мытья. 200 μl/well трехкратно повторить посев и удаление PBS
- Блокируйте неспецифическое связывание путем посева 50 μl/well разбавленной до 5 % RPMI 1640, в течение не менее 1 ч при 37 °C, 5 % CO2Удалите крупные пузырьки, проколов их стерильной иглой.
- Пластина 1 x 105 аутологичные ЛКЛ2 в 50 μl RPMI 1640 с 5% человеческой сывороткой на лунку
- Перемешайте клетки в каждой лунке 24-луночной плашки, содержащей клоны Т-клеток, с помощью пипетки объемом 1 мл. Перенесите 100 μl в каждую лунку в стерильную пробирку Эппендорф. Добавьте 500 μl по 1 мл RPMI 1640 с 5% смешанной человеческой сывороткой в каждую пробирку Эппендорф, центрифугировать в микропробирках при 3000 об/мин в течение 5 мин.
- Аккуратно слейте жидкость из пробирок Эппендорфа, добавьте 110 μl по 1 мл RPMI 1640 с 5% человеческой сывороткой на пробирку, ресуспендируют клетки с помощью вихревой смеси.
- Пластина 50 μl каждую среду, содержащую определённый клон Т-клеток, независимо от количества клеток, для быстрого скрининга помещают в идентично расположенные лунки двух планшетов. Повторите для всех клонов Т-клеток. Исключение этапов подсчёта клеток позволяет одновременно тестировать большое количество клонов Т-клеток.
- Смешайте оставшуюся питательную среду из нескольких пробирок Эппендорф и засейте 50 μl каждый в следующие идентично расположенные лунки, которые будут использоваться в качестве положительных контрольных лунок, в которые будет добавлен ФГА.
- Добавить 50 μl в каждый лунок добавляли по RPMI 1640 с 5% смешанной человеческой сывороткой, который служил отрицательным контролем, без добавления клонов Т-клеток.
- Добавьте пептиды, содержащиеся в положительной области (Таблица 1) в 50 μl/well до конечной концентрации 10 μM/peptиде. Запасные растворы пептидов растворяют в концентрации 5 мМ каждый в 5–15% диметилсульфоксиде в фосфатном буфере (PBS) в зависимости от растворимости пептидов. В каждую лунку будет добавлено 200 μl в объёме50 μl блокирования, 50μl ЛКЛ 50μl клоны Т-клеток, и 50μl пептидов
- Добавить 50 μl PHA (конечная концентрация 10 μg/mlв положительные контрольные лунки
- Добавить 50 μl в отрицательный контрольный образец добавляли RPMI 1640 с 5% смешанной человеческой сывороткой
- Инкубировать в течение ночи при 37 °C, 5 % CO2.
- Промойте лунки 150–200 мкл 1× PBS. 200 μl/well трехкратно повторить промывку PBS с 0,05% Tween-20 путем нанесения и удаления раствора
- Добавить 50 μl с PBS, содержащим 1 μg/ml биотин-конъюгированного антитела к ИФН-γ моноклональное антитело (клон 7B-6, Mabtech) и инкубируйте при 37 °C, 5 % CO2 в течение 2 ч. Удалите крупные пузырьки, проколов их иглой.
- За 20 мин до окончания 2-часовой инкубации приготовьте авидин-связанную биотинилированную пероксидазу H (набор Vectastain Elite ABC; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), добавив по 2 капли раствора А и раствора В в 5 мл PBS, содержащего 0,1 % Tween-20.
- Промойте лунки 150– 200 μl/well трехкратно повторить промывку PBS с 0,1 % Tween-20 путем заливки и удаления раствора
- Пластина 50 μl/well биотинилированного пероксидазы хрена Н и инкубируйте при 37 °C, 5 % CO2 в течение 1 ч. Удалите крупные пузырьки, проколов их иглой.
- Промойте лунки 150– 200 μl/well трехкратно повторить промывку PBS с 0,1% Tween-20 путем заливки и удаления раствора
- Пластина 50 μl/well цветного реагента, называемого стабильным диаминобензидином (DAB), при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите крупные пузырьки, проколов их иглой.
- Промойте лунки 150– 200 μl/well дважды повторить ещё два раза.
- Дайте планшету полностью высохнуть.
- Подсчитайте пятна с помощью стереомикроскопа или автоматического считывающего устройства ELISPOT (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Германия).
3. Подтверждение эпитоп-специфической природы клонов Т-клеток с помощью анализа ELISPOT (Рис. 4)
- Выберите Т-клеточные клоны, хорошо растущие в культуре. Проведите анализ с помощью ELISPOT, как описано выше, за исключением того, что используют 1 x 105 аутологичные ЛКЛ и 1 x 103 Клетки клонов Т-клеток будут высеваться в каждую лунку вместе с одним из трех пептидов, содержащихся в данном регионе (Таблица 1) при 10 μMПроводите анализ в двух или трех повторах.
4. Определение того, подвергается ли эпитоп эндогенной обработке (Рис. 5)
- Отберите хорошо растущие клон Т-клеток. Проведите анализ методом ELISPOT, как описано выше, за исключением того, что на каждую лунку высевают 1 x 105 аутологичных LCL, инфицированных рекомбинантным вирусом вакцинии, экспрессирующим белок ВПЧ 16 E6, E7 6 (до анализа) или не инфицированных (дикого типа, штамм WR) (множественность инфицирования 5 в течение 1 ч), и 1 x 103 клеток клона Т-клеток.
5. Характеристика минимальной и оптимальной последовательности Т-клеточного эпитопа (Рис. 6a, 6b и 6c)
- Выберите Т-клеточные клоны, хорошо растущие в культуре. Проведите анализ с помощью ELISPOT, как описано выше, за исключением того, что используют 1 x 105 аутологичные ЛКЛ и 1 x 103 Клональные Т-клетки высевали в лунку на планшете вместе с одним из серии перекрывающихся 9-мерных пептидов, покрывающих данную область (Таблица 1) при 10 μM (Рис. 6a).
- Проведите анализ ELISPOT, как описано выше, за исключением того, что используют 1 x 105 аутологичные ЛКЛ и 1 x 103 Клональные Т-клетки будут высеваться в каждую лунку вместе с одним из серии пептидов различной длины (Таблица 1) при 10 μM (Рис. 6b).
- Проведите анализ ELISPOT, как описано выше, за исключением того, что используют 1 x 105 аутологичные ЛКЛ и 1 x 103 Клетки клонов Т-клеток будут засеяны в каждую лунку вместе с несколькими пептидами, наиболее вероятно содержащими минимальную и оптимальную аминокислотную последовательность. Эти пептиды будут протестированы в диапазоне концентраций от 10-5 от M до 10-10 МРис. 6в).
6. Определение ограничивающего элемента с помощью анализа ELISPOT (Рис. 7)
- Выберите Т-клеточные клоны, хорошо растущие в культуре. Проведите анализ методом ELISPOT, как описано выше, за исключением того, что используют 1 x 103 Количество клонированных Т-клеток на лунку будет посеваться вместе с минимальным и оптимальным пептидом 10 μMТакже высевают по 100 000 аллогенных ЛКЛ на лунку, несущих одну или две молекулы HLA класса I, общие с изучаемым субъектом.
7. Исследование перекрестной реактивности клонов Т-клеток, специфичных к эпитопу, на гомологичные аминокислотные последовательности других высокоонкогенных типов ВПЧ (Рис. 8)
- Выберите Т-клеточные клоны, хорошо растущие в культуре. Проведите анализ с помощью ELISPOT, как описано выше, за исключением того, что используют 1 x 103 Клетки клонов Т-клеток будут высеваться в каждую лунку вместе с пептидами (10 μM) содержащих гомологичные аминокислотные последовательности из других высокоонкогенных типов ВПЧТаблица 2По 100 000 аутологичных LCL на лунку, а также аллогенных LCL, экспрессирующих ограничивающие молекулы HLA класса I, также высевают в соответствующие лунки.
8. Типичные результаты
Субъект 1, о котором идет речь, — 22-летняя афроамериканка с недавней историей высокозлокачественного плоскоклеточного интраэпителиального поражения, диагностированного при биопсии. Она была направлена на лечение методом петлевой электрокоагуляции в день сбора Т-клеток1. Анализ с помощью ELISPOT её линии CD8 Т-клеток показал, что в области HPV 16 E6 46-70 (каждая область тестируется с использованием 3 перекрывающихся 15-мерных пептидов) содержится Т-клеточный эпитоп (Рис. 2). Количество эпитоп-специфичных Т-клеток, отобранных на основе секреции IFN-γ, составило 1,2 × 105. После проведения разведения в условиях ограничивающей разбавленности (Рис. 3) на одной пятой части отобранных клеток было получено 262 клонов Т-клеток. Остальные отобранные клетки не использовались, поскольку первая попытка клонирования Т-клеток оказалась успешной. Высокопроизводительный скрининг с помощью анализа ELISPOT, проведённый на 94 клонах, выявил 62 положительных по скринингу клона, которые легко можно идентифицировать макроскопически на планшете ELISPOT. Остальные клоны Т-клеток не тестировались, поскольку первый анализ ELISPOT позволил идентифицировать пептид-специфичные клоны Т-клеток. Восемь хорошо растущих положительных по скринингу клонов были повторно протестированы с каждым из трёх 15-мерных пептидов, покрывающих данную область, по отдельности (Рис. 4). Все клоны Т-клеток оказались положительными с пептидом HPV 16 E6 51-65, 6 из 8 клонов были положительны с пептидом E6 46-60, и ни один из клонов не дал положительной реакции с пептидом E6 56-70. Тестирование с использованием аутологичных LCL, инфицированных рекомбинантным вирусом вакцины, экспрессирующим белок HPV 16 E6 или E7, показало, что клоны Т-клеток распознают эндогенно обрабатываемый эпитоп E6 (Рис. 5). Тестирование с серией перекрывающихся 9-мерных пептидов, покрывающих область HPV 16 46-65 (Таблица 1), показало наилучшую реакцию с пептидом E6 53-61 (Рис. 6a). Были протестированы два 10-мерных пептида, содержащих пептид E6 53-61, два 8-мерных пептида, входящих в пептид E6 53-61, и один 11-мерный пептид, содержащий оба 10-мерных пептида, и пептид E6 52-61 (10-мер) был определён как минимальная и оптимальная последовательность, наиболее стабильно проявляющая активность (Рис. 6b). Однако пептид E6 53-61 (9-мер) вызывал столь же сильную реакцию с клоном Т-клеток №79. Этот клон Т-клеток был протестирован с этими двумя пептидами в более широком диапазоне концентраций, и пептид E6 52-61 (10-мер) сохранял положительную реакцию значительно эффективнее, чем пептид E6 53-61 (9-мер), при более низких концентрациях пептида (Рис. 6c). Более длинный пептид E6 52-62 (11-мер) не тестировался, поскольку целью было определить кратчайшую последовательность, демонстрирующую надёжный ответ. Было установлено, что пептид E6 52-61 (10-мер) содержит минимальную и оптимальную последовательность.
Ограничивающая HLA-молекула класса I для CD8-Т-клеточного эпитопа может быть исследована с помощью анализа ELISPOT, в котором используются аллогенные ЛКЛ, экспрессирующие одну или две HLA-молекулы класса I, общие с данным субъектом. Однако результаты для Субъекта 1 оказались неоднозначными из-за высокого фонового сигнала в анализе ELISPOT. Ограничивающая HLA-молекула класса I для Субъекта 1 была впоследствии идентифицирована как B58 с использованием анализа высвобождения хрома (данные не показаны). Рис. 7 показывает пример от другого субъекта [Субъект А, у которого было обнаружено распознавание минимальной и оптимальной последовательности Е6 75-83 (KFYSKISEY), описанной Вангом и др.]7Высокая положительная реакция наблюдается с LCL, экспрессирующими молекулы B62 и Cw3, в то время как фоновая положительная реакция показана с LCL, экспрессирующей Cw3. Анализ высвобождения хрома подтвердил, что молекула B62 является ограничивающим элементом для субъекта А7.
Некоторые участки генома ВПЧ хорошо консервативны, и гомологичные последовательности участка ВПЧ 16 E6 52-61 присутствуют в 13 других высокоонкогенных типах ВПЧ (Таблица 2). Сильное перекрёстное распознавание (>50% образующих пятна единиц по сравнению с пептидом ВПЧ 16 E6 52-61) было показано для 8 из 13 высокоонкогенных типов ВПЧ (Рис. 8).
Рисунок 1. Общая схема, иллюстрирующая серию экспериментов по выявлению новых Т-клеточных эпитопов. В данной статье описывается протокол, начиная с третьего блока сверху.
Рисунок 2. Проведение анализа методом ELISPOT для выявления области (областей), содержащей Т-клеточный эпитоп. Сто тысяч CD8+ Т-клеток стимулировали in vitro на лунку высевали вместе с тремя перекрывающимися пептидами длиной по 15 аминокислотных остатков (10 μM каждый), перекрывающих каждый регион белков ВПЧ 16 Е6 и Е7. Данный пример от субъекта 1 показал наличие Т-клеточного эпитопа в области Е6 46–70. Столбцы представляют стандартные ошибки средних значений.
Рисунок 3. Схема разведения эпитоп-специфичных Т-клеток с использованием смеси кормовых клеток до концентрации 0,5 клетки на лунку.
Рисунок 4. Анализ ELISPOT, проведённый для выявления субрегионов, содержащих Т-клеточный эпитоп, с индивидуальным тестированием трёх пептидов длиной по 15 аминокислот. Данный пример от субъекта 1 показал наличие эпитопа в субрегионах E6 46-60 и E6 51-65. Столбцы представляют стандартные ошибки средних значений.
Рисунок 5. Анализ методом ELISPOT, проведённый для проверки, представляется ли Т-клеточный эпитоп эндогенно. Данный пример от субъекта 1 показал, что Т-клеточные клон признавали эндогенно обрабатываемый эпитоп E6. Столбцы представляют стандартные ошибки средних значений.
Рисунок 6. Проведение анализов ELISPOT для определения самой короткой и оптимальной последовательности пептида Т-клеточного эпитопа. При наличии использовались одни и те же клонированные линии. (a) Анализ ELISPOT, проведённый с использованием перекрывающихся 9-мерных пептидов. Данный пример от субъекта 1 показал, что эпитоп находится в субрегионе E6 53-61. (b) Анализ ELISPOT, проведённый для определения минимальной и оптимальной последовательности пептида с использованием пептидов различной длины. Данный пример показал, что наиболее стабильной самой короткой и оптимальной последовательностью был пептид E6 52-61, за ним следовал пептид E6 53-61. (c) Анализ ELISPOT, проведённый для подтверждения, какой пептид содержит минимальную и оптимальную последовательность. Пептид E6 52-61 сохранял положительный результат при более низких концентрациях и был определён как самая короткая и оптимальная последовательность. Столбцы представляют стандартные ошибки среднего значения.
Рисунок 7. Анализ ELISPOT, проведенный для идентификации ограничивающей молекулы HLA класса I. Данный пример подтверждает, что молекула B62 является ограничивающим элементом для клонов CD8 Т-клеток субъекта А, распознающих эпитоп HPV 16 E6 75-837. Это было подтверждено анализом высвобождения хрома. Столбцы представляют стандартные ошибки средних значений.
Рисунок 8. Анализ методом ELISPOT, проведённый для оценки перекрёстной реактивности клонов Т-клеток, специфичных к последовательности 52–61 вируса папилломы человека 16-го типа, в отношении схожих последовательностей из других высокоонкогенных типов ВПЧ (таблица 2). Данный пример от субъекта 1 показал значительную перекрёстную реактивность (>50 % от уровня положительной реакции на пептид ВПЧ 16 52–61) в 8 из 13 исследованных других высокоонкогенных типов ВПЧ. Столбики отражают стандартные ошибки средних значений.
| Тип ВПЧ | Аминокислотные остатки* | Последовательность |
| 16 | E6 46-60 (15) | RREVYDFAFRDLCIV |
| 16 | E6 51-65 (15) | DFAFRDLCIVYRDGN |
| 16 | E6 56-70 (15) | DLCIVYRDGNPYAVC |
| 16 | E6 52-62 (11) | FAFRDLCIVYR |
| 16 | E6 52-61 (10) | FAFRDLCIVY |
| 16 | E6 53-62 (10) | AFRDLCIVYR |
| 16 | E6 46-54 (9) | РРЕВИДФАФ |
| 16 | E6 47-55 (9) | РЕВИДФАФР |
| 16 | E6 48-56 (9) | EVYDFAFRD |
| 16 | E6 49-57 (9) | VYDFAFRDL |
| 16 | E6 50-58 (9) | YDFAFRDLC |
| 16 | E6 51-59 (9) | DFAFRDLCI |
| 16 | E6 52-60 (9) | ФАФРДЛЦИВ |
| 16 | E6 53-61 (9) | AFRDLCIVY |
| 16 | E6 54-62 (9) | FRDLCIVYR |
| 16 | E6 55-63 (9) | RDLCIVYRD |
| 16 | E6 56-64 (9) | DLCIVYRDG |
| 16 | E6 57-65 (9) | LCIVYRDGN |
| 16 | E6 53-60 (8) | AFRDLCIV |
| 16 | E6 54-61 (8) | FRDLCIVY |
* Количество аминокислот указано в скобках.
Таблица 1. Последовательности аминокислот пептидов Е6 ВПЧ 16, использованных для определения минимальной и оптимальной антигенной пептидной последовательности.
| Тип ВПЧ | Остатки A A* | Последовательность |
| 16 | E6 52-61(10) | FAFRDLCIVY |
| 18 | E6 47-56 (10) | FAFКDLFVVY |
| 31 | E6 45-54 (10) | FAFTDLTIVY |
| 33 | E6 45-54 (10) | FAFADLТВVY |
| 35 | E6 45-54 (10) | FAЦИDLCIVY |
| 39 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 45 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 51 | E6 45-54 (10) | VАФТЕИКIVY |
| 52 | E6 45-54 (10) | FLFТDLRАйви |
| 56 | E6 48-57 (10) | ФАТЭКLKLVY |
| 58 | E6 45-54 (10) | FVFADLРIVY |
| 59 | E6 47-56 (10) | FAFNDLFIVY |
| 68 | E6 47-56 (10) | FAFGDLNVVY |
| 73 | E6 45-54 (10) | FAFSDLCIVY |
* Количество аминокислот указано в скобках.
^ Остатки аминокислот, отличающиеся от таковых в эпитопе HPV-16 E6 52-61, выделены жирным шрифтом.
Таблица 2. Последовательности аминокислот пептидов высоконкрурентных типов ВПЧ, гомологичных CD8 Т-клеточным эпитопам ВПЧ 16 E6 52-61, протестированных для оценки перекрёстного распознавания.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Традиционно иммунологи пытались охарактеризовать новые Т-клеточные эпитопы путем стимуляции интересующих Т-клеток in vitro и проведения эксперимента с лимитирующим разведением для изоляции клонов Т-клеток, специфичных к эпитопу. Затем клоны Т-клеток характеризовали с помощью анализа высвобождения хрома 8,9. Однако многие попытки оказывались неудачными, поскольку частота Т-клеток могла быть слишком низкой для изоляции или из-за недостаточного количества клеток клона Т-клеток для завершения характеризац...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют конфликтов интересов, подлежащих раскрытию.
Благодарности
Данное исследование было поддержано грантом American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) и грантами NIH (R01 CA143130 и UL1RR029884).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Набор для выделения T-клеток CD8 | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Фитогемагглютинин | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/vial |
| Среда Иссела (Yssel’s medium) | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% объединенная сыворотка крови человека |
| 96-луночный планшет с круглым дном | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| Рекомбинантный IL-2 человека | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| 24-луночный планшет | Corning | 07-200-84 | |
| Фосфатно-солевой буферный раствор | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| Первичные моноклональные антитела к IFN-γ (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| Биотинилированные моноклональные антитела к IFN-γ (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Планшет Multiscreen HA ELISPOT | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Диметилсульфоксид | Sigma-Aldrich | D2650 | флакон 100 ml |
| Объединенная сыворотка крови человека | Atlanta Biologicals | S40510H | Термоинактивированная |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Набор Vectastain Elite ABC | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| Стабильный диаминобензидин | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| Ридер AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
Ссылки
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L. Lymphocytes: A practical approach. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable. Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).
- Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).
- Larsson, M. A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals. AIDS. 13, 767-777 (1999).
- Nakagawa, M. Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia. J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).
- Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable. Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).
- Evans, M. Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6. J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).
- Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro. J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).
- Varadarajan, N. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins. Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein. J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).
- Brown, S. A. T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).
- Masemola, A. M. Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa. J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).
- Walker, B. D., Korber, B. T. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
