Использование интерферона-γ энзимных Анализ Immunospot для характеристики Роман Т-клеточных эпитопов вируса папилломы человека

Краткое содержание

Характеристика T-клеточных эпитопов патогенов, вызывающих локальные инфекции, таких как вирус папилломы человека, представляет собой сложную задачу из-за ограниченного количества циркулирующих T-клеток. В данной работе описан метод, с помощью которого редкие T-клетки были изолированы и охарактеризованы, исходя из очень малого количества исходных клеток.

Аннотация

Был разработан протокол для преодоления трудностей, связанных с выделением и характеристикой редких T-клеток, специфичных к патогенам, таким как вирус папилломы человека (ВПЧ), которые вызывают локализованные инфекции. Описываемые этапы включают идентификацию области (областей) белков ВПЧ, содержащих T-клеточный эпитоп (эпитопы) конкретного субъекта, селекцию пептид-специфичных T-клеток на основе секреции интерферона-γ (IFN-γ), а также выращивание и характеристику клонов T-клеток (Рис. 1). Субъектом 1 был пациент, у которого недавно по результатам биопсии была диагностирована плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия высокой степени, и которому в день забора T-клеток была проведена петлевая электрохирургическая эксцизия в целях лечения¹. Область в белках E6 и E7 вируса папилломы человека 16-го типа (HPV 16), содержащая T-клеточный эпитоп, была идентифицирована с помощью анализа IFN-γ методом иммуноспот-анализа с помощью фермента (ELISPOT), проведенного с использованием перекрывающихся синтетических пептидов (Рис. 2). Данные этого анализа были использованы не только для идентификации области, содержащей T-клеточный эпитоп, но и для оценки количества эпитоп-специфических T-клеток, а также для их выделения на основе секреции IFN-γ с использованием коммерчески доступных магнитных шариков (набор для выделения CD8 T-клеток, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Отобранные секретирующие IFN-γ T-клетки разбавляли и выращивали по отдельности в присутствии смеси облученных фидерных клеток для обеспечения роста одной T-клетки на лунку. Эти клоны T-клеток проходили скрининг с помощью анализа IFN-γ ELISPOT в присутствии пептидов, перекрывающих идентифицированную область, и аутологичных B-лимфобластоидных клеток (LCL), трансформированных вирусом Эпштейна-Барр (полученных по методу Walls и Crawford)², чтобы минимизировать количество необходимых клеток клона T-клеток. Вместо использования 1 x 10⁵ клеток на лунку, что обычно применяется в анализах ELISPOT^1,3, использовали 1 000 клеток клона T-клеток в присутствии 1 x 10⁵ аутологичных LCL, что значительно сократило потребность в клетках клона T-клеток. Аутологичные LCL служили не только для презентации пептидных антигенов клеткам клона T-клеток, но и для поддержания высокой плотности клеток в лунках, что позволяло эпитоп-специфическим клеткам клона T-клеток секретировать IFN-γ. Это обеспечивает успешное проведение анализа IFN-γ ELISPOT. Аналогичным образом анализы IFN-γ ELISPOT использовались для характеристики минимальной и оптимальной аминокислотной последовательности CD8 T-клеточного эпитопа (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) и его элемента ограничения HLA I класса (B58). Анализ IFN-γ ELISPOT также проводили с использованием аутологичных LCL, инфицированных вирусом вакцины, экспрессирующим белок HPV 16 E6 или E7. Результат показал, что T-клеточный эпитоп E6 подвергается эндогенному процессингу. Было продемонстрировано перекрестное распознавание гомологичного T-клеточного эпитопа других типов ВПЧ высокого риска. Данный метод также может быть использован для описания эпитопов CD4 T-клеток⁴.

Протокол

С помощью анализа ИФН-γ методом ELISPOT с использованием линии CD8 Т-клеток, полученной от субъекта 1, было установлено, что область HPV 16 E6 46-70 содержит Т-клеточный эпитоп¹ (Рис. 2), и специфические к эпитопу Т-клетки были отобраны на основе секреции ИФН-γ до начала выполнения данного протокола (Рис. 1).

1. Лимитирующее разведение эпитоп-специфичных Т-клеток

1. Приготовьте смесь кормильческих клеток, смешав облученные (4000 рад) аллогенные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) в концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл, облученные (4000 рад) аутологичные В-лимфобластоидные клетки,....

Обсуждение

Традиционно иммунологи пытались охарактеризовать новые Т-клеточные эпитопы путем стимуляции интересующих Т-клеток in vitro и проведения эксперимента с лимитирующим разведением для изоляции клонов Т-клеток, специфичных к эпитопу. Затем клоны Т-клеток характеризовали с помощью анализа высвобождения хрома ^8,9. Однако многие попытки оказывались неудачными, поскольку частота Т-клеток могла быть слишком низкой для изоляции или из-за недостаточного количества клеток клона Т-клеток для завершения характеризац.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для выделения T-клеток CD8	Miltenyi Biotec	130-094-156
Фитогемагглютинин	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2mg/vial
Среда Иссела (Yssel’s medium)	Gemini Bio Products	400-102	1% объединенная сыворотка крови человека
96-луночный планшет с круглым дном	BD Biosciences	08-772-17
Рекомбинантный IL-2 человека	R&D Systems	202-IL-050	50μg
24-луночный планшет	Corning	07-200-84
Фосфатно-солевой буферный раствор	Cellgro	MT-21-031-CV
Первичные моноклональные антитела к IFN-γ (D1K)	Mabtech	3420-3-1000
Биотинилированные моноклональные антитела к IFN-γ (7B-6)	Mabtech	3420-6-1000
Планшет Multiscreen HA ELISPOT	EMD Millipore	MAHA S45 10
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	D2650	флакон 100 ml
Объединенная сыворотка крови человека	Atlanta Biologicals	S40510H	Термоинактивированная
RPMI 1640	Cellgro	MT-10-040-CV
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Набор Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	NC9313719
Стабильный диаминобензидин	Open Biosystems	MBI 1241
Ридер AID EliSpot Reader Classic	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06