Методическая статья

Пример подготовки Микобактерий туберкулеза Экстракты для ядерно-магнитного резонанса исследований Metabolomic

DOI:

10.3791/3673

⸱

3 сентября 2012 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Chemistry, University of Nebraska-Lincoln

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomic профиля Микобактерий туберкулеза Определяется после роста в бульоне культуры. Условия могут быть изменены, чтобы проверить влияние пищевых добавок, окислители, и противотуберкулезных препаратов на метаболический профиль этого микроорганизма. Порядок подготовки экстракт применяют как для 1D 1 H и 2D 1 H- 13 C-ЯМР-анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis является основной причиной смертности среди людей в глобальном масштабе. Появление как мульти- (МЛУ), так и экстенсивно-(ШЛУ) штаммов с лекарственной устойчивостью угрожает свести на нет нынешние усилия по борьбе с болезнью. Таким образом, существует острая необходимость в разработке лекарств и вакцин, которые были бы более эффективными, чем те, которые доступны в настоящее время. Геном M. tuberculosis известен уже более 10 лет, однако в наших знаниях о функции и сущности генов существуют значительные пробелы. С тех пор во многих исследованиях использовался анализ экспрессии генов как на транскриптомном, так и на протеомном уровнях для определения влияния лекарств, оксидантов и условий роста на глобальные паттерны экспрессии генов. В конечном счете, окончательная реакция на эти изменения отражается на метаболическом составе бактерии, включающем несколько тысяч низкомолекулярных химических веществ. Сравнение метаболических профилей дикого типа и мутантных штаммов, как нелеченных, так и обработанных конкретным препаратом, может эффективно обеспечить идентификацию мишени и может привести к разработке новых ингибиторов с противотуберкулезной активностью. Аналогичным образом, можно также оценить влияние двух или более состояний на метаболом. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) — это мощная технология, которая используется для идентификации и количественного определения метаболических промежуточных продуктов. В данном протоколе описаны процедуры подготовки экстрактов клеток M. tuberculosis для метаболомного анализа ЯМР. Клеточные культуры выращивают в соответствующих условиях и с требуемым уровнем биобезопасности 3, собирают урожай и подвергают механическому лизису при поддержании низких температур для максимального сохранения метаболитов. Клеточные лизаты восстанавливаются, фильтруются, стерилизуются и хранятся при сверхнизких температурах. Аликвоты из этих клеточных экстрактов наносятся на агар Миддлбрук 7H9 для колониеобразующих единиц для проверки отсутствия жизнеспособных клеток. После двух месяцев инкубации при температуре 37 °C, если жизнеспособных колоний не наблюдается, образцы забирают из камеры изоляции для последующей обработки. Экстракты лиофилизируют, ресуспендируют в дейтерированном буфере и вводят в ЯМР-прибор, захватывая спектроскопические данные, которые затем подвергаются статистическому анализу. Описанные процедуры могут быть применены как для одномерного (1D) 1Н ЯМР, так и для двумерного (2D) 1H-13 C ЯМР-анализа. Эта методология обеспечивает более надежную идентификацию метаболитов с малой молекулярной массой и более надежный и чувствительный количественный анализ метаболических составов клеточных экстрактов, чем хроматографические методы. Вариации описанной процедуры, следующие за стадией лизиса клеток, также могут быть адаптированы для параллельного протеомного анализа.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Текст протокола

Этот протокол выдвигает на первый план адаптации методологии ЯМР M. туберкулез (класс III агента). Таким образом, уровень биобезопасности 3 (BSL3) практики необходимо следовать при проведении M. туберкулез исследований в ежегодной сертифицированной лаборатории. Воздействие лаборатории генерируемых аэрозолей является наиболее важным опасности, с которыми сталкивается персонал, работающий с этими микроорганизмами. Следующие процедуры проводятся в нашем институте и вариации могут существовать на основе рекомендаций институциональным биобезопасности комитета. Общие средства защиты персонала будет состоять из Tyvek костюм, пышные шапки, пинетки, N95 респиратор, защитные очки, рукава, и две пары нитриловые перчатки. Работа с участием М. туберкулез культур и / или манипуляции с открытым М. туберкулез контейнеров осуществляется в тип А2 или В2 бокс биологической безопасности. Пластиковые покрытых фильтровальной бумаги помещают на Working поверхности. Все материалы / расходные материалы необходимо утилизировать или удалены из объекта должны быть размещены в двух биологически сумки и обеззараживания в автоклаве. Рабочие поверхности и оборудование, которые используются в пределах шкафа (FastPrep-24 лизис гомогенизатор, спектрофотометр, ведерко со льдом и т. д.) должны быть продезинфицированы после каждого сеанса работы с 1% Amphyl (туберкулоцидным, бактерицидное, фунгицидное, и вирулицидной агента). M. туберкулез культуры должны быть поставлены под двойная защитная оболочка для транспортировки крупногабаритного оборудования находится за пределами бокс биологической безопасности, такие как морозильные камеры, инкубаторы, центрифуги, холодильники. Центрифугирование проводится с закрытыми чашками безопасности и уплотнительное кольцо винта верхней трубы. Для дальнейшего анализа за пределами лаборатории BSL3, бесклеточной экстракты фильтруют через фильтр 0,2 мкм или микроорганизмов, тепла убит при 95 ° С в течение 15 мин. 2 Образцы помещали чтобы убедиться в отсутствии колониеобразующих единиц до отстранения от сдерживания.

  1. Передача 110 мл Middlebrook 7H9 полную среду, содержащую полисорбат 80 (твин 80, чтобы предотвратить слипание) бульон (MADC-TW) или подходящую среду в 250 мл колбу Эрленмейера. Triplicate культуры обычно выращивают в условиях, когда с использованием 13 С-метаболитов, и десять идентичных культур выращиваются для профилирования 1D 1 H ЯМР. В течение двух условий (например, с и без добавления препарата), двойной объем культуры в повторных можно выращивать и разбит на два одинаковых культур. Все реагентов и растворов рецепты приведены в конце протокола.
  2. Инокулировать бульон с 0,150 мл M. туберкулезом 50% глицерина акций (позволяют таять на льду). См. Примечание 1 ниже.
  3. Пусть культуры растут при температуре 37 ° C встряхивании при 100 оборотов в минуту в течение приблизительно 6 дней (OD 600 0,6-0,8). См. примечание 2 ниже.
  4. Если нет антибиотиков, альтернативные дополнения или другие виды лечения необходимы, культуры готовы быть собраны. Если лечение используется, продолжаютнепосредственно к шагу 5. Удалить 0,5 мл пробы из каждой колбы, передать трубку микроцентрифужных и место при 4 ° С для титрования культуры и контроль качества: загрязнение тесты, фенотипический анализ, ПЦР-тестов. См. примечание 3 ниже. На данный момент, переходите к шагу 6.
  5. Удалить из колбы шейкере и выполнения требуемого лечения (например, добавить препарат или метаболит). Место колб обратно в шейкере и инкубировать в течение дополнительного периода времени (например, 6-18 часов). В конце этого времени, взять другую аликвоту 1,0 мл и определяют OD 600. Удалить 0,5 мл пробы из каждой колбы, передать трубку микроцентрифужных и место при 4 ° С для титрования культуры и контроль качества.
  6. Место культур на льду в течение 5 мин. После этого шага, оставил клетки на льду в течение всего оставшегося протокол. Урожай культур путем центрифугирования при 2000 х г и 4 ° C в течение 15 мин в 50 мл труб с помощью настольной центрифуге. Каждая культура требует четыре пробирки с 25 мл каждый (в общей сложности 100 мл, необходимых для получения адекватного отношения сигнал-шум для 2D 1 H-13 C-ЯМР-экспериментах, где только 50 мл в культуре необходимы для 1D 1 H ЯМР экспериментов).
  7. Промойте каждую ячейку гранул в два раза ледяной DDH 2 O (примерно 15 мл в первый раз и 10 мл во второй раз) на центрифугирования параметрам, описанным выше. Для второго мытья, объединить 10 мл аликвоты в ту же трубу перед формованием. Ресуспендируют осадок клеток в конечном объеме 1,0 мл DDH 2 O (нужно настроить для объема осадок клеток). Если суспензии отдельных клеток бесплатно слипания желательно на этом этапе клетки могут быть кратко ультразвуком и / или прошли через 27-иглу в три раза. Кроме того, осадок клеток могут быть заморожены при температуре -80 ° C и хранят до дальнейшей обработки. В последнем случае, замороженные шарики размораживают на льду до ресуспендирования. Ресуспендируют ячейки гранул в конечном объеме 1,0 мл DDH 2 O, как указано выше.
  8. TransfeГ ячейки 1,0 мл суспензии винт 2,0 мл крышкой пробирку, содержащую Лизирующий матрицы B (0,1 мм сфер кремнезема). Поместите FastPrep-24 лизис гомогенизатор внутри шкафа биобезопасности. Поместите образцы в держатель образца, обеспечивая сохранение говорил пластину на верхней части трубки. Процесс образцов в течение 60 секунд в гомогенизаторе при скорости вращения 6 метров / сек.
  9. Побочные образцов в микроцентрифуге при 15000 х г и 4 ° C в течение 10 мин для осаждения мусора клеток и целых клеток.
  10. Удалите супернатант и пароль образца через шприц фильтр (0,2 мкм) в стерильную пробирку. Плита 0,1 мл образца (или представитель фракции образца, как, например, 10%) на MADC агар чтобы убедиться, что нет никаких жизнеспособных клеток. Следователи также может проводить более одной стадии фильтрации и / или проверить наличие жизнеспособных клеток в экстрактах с использованием живого-мертвого процедуры окрашивания, чтобы предотвратить или выявить любые потенциальные проблемы биобезопасности. Замораживание образцов в этаноле сухой лед ванны для храненияпри -80 ° C, пока они не будут готовы к лиофилизировали и обрабатываются в центр ЯМР.
  11. После 2 месяцев, проверить пластин для проверки отсутствия колониеобразующих единиц. Если нет КОЕ найдены образцы могут быть взяты из лаборатории BSL3. Дальнейший анализ проводится в стандартных ЯМР-центр, который обычно обслуживает несколько пользователей и действует на основании каких-либо конкретных требований сдерживания.
  12. Lyophilize образцов досуха, затем ресуспендируют в 0,7 мл буфера ЯМР и передачи микроцентрифужных трубку. Центрифуга в течение 3 мин при 13000 х г. Удалить 0,6 мл и переносят в 5 мм ЯМР-трубку. Кроме того, лиофилизированных образцов может быть отправлен на внешний объект как не заразны регулярные образцы.
  13. ЯМР данные собираются немедленно. Несмотря на все меры предосторожности, активные ферменты могут все еще присутствовать и образец, как правило, не стабильны в течение длительного периода времени. Изменения в спектре ЯМР заметны, когда образцы оставляют при комнатной температуре или при температуре 4 ° С мруды, чем 1 неделя. Кроме того, данные ЯМР коллекции чередовались между необработанной и наркотиков обработанных культурах, где Образцы выбираются случайным образом из каждой категории. Это позволяет избежать ненужных предубеждений, потому что определенной категории было больше задержка перед спектров ЯМР были собраны. Смещения в данных может произойти, если спектров ЯМР для всех необработанных образцов были собраны, а затем следуют препарата обработанные образцы. Если образцы не могут быть немедленно анализируют методом ЯМР, пробы должны храниться в 1 мл Эппендорфа при температуре -80 ° C.
  14. После установки образцов в BACS-120 образца чейнджер, калибровку прибора, который включает в себя несколько шагов рутины, такие как замок, прокладки, настройки и оптимизации 90 ° длительность импульса, требует, чтобы максимизировать качество результатов. Одном образце используется для калибровки 90 ° длительности импульса и настраивать инструмент для остальных образцов. Замок, прокладок и ЯМР сбора данных для каждого образца автоматизированной Усинг ICONNMR и gradshim.
  15. 1D 1 H ЯМР-спектр собираются с использованием Bruker zgesgp последовательность импульсов с водой подавлении возбуждения скульптуры. В общей сложности 32k точек данных с размаху ширину 5482.5Hz, 128 сканирований, и 16 фиктивных сканирования используется. 2D 1 H-13 C HSQC спектр собираются с использованием Bruker hsqcetgp последовательности импульсов. В общей сложности из 2048 точек данных с размахом ширина 5000,0 Гц собирают вдоль прямой 1 измерение H, и 64 точек данных с размаху ширину 18864,9 Гц вдоль косвенные измерения C 13. Спектр собранных с 128 сканирований и 16 сканирований манекен для получения хорошего сигнала к шуму.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Блок-схема экспериментальной процедуры изображено.

ЯМР буфер

Раствор 50 мМ фосфата калия баффER 50 мкМ ТСГУ:

  • 2,17 г К 2 НРО 4 (фосфат калия двузамещенный)
  • 1,70 г KH 2 PO 4 (фосфат калия однозамещенный)
  • 7,86 мг Натрий-3-Trimethylsilylpropionate (ТСГУ-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98%))
  • Растворите в 500 мл "100%" D 2 O
  • Окончательное решение должно быть при рН 7,2 (поправки)

MADC-TW или MOADC-TW (1 л)

  • 4,7 г Middlebrook 7H9 бульон базы
  • 900 мл DDH 2 O
  • 2 мл глицерина
  • Смешайте компоненты и автоклаве в течение 25 мин. Прохладный жидкость на ощупь и добавьте следующие решения:
  • 100 мл ADC при подготовке MADC или 100 мл OADC при подготовке MOADC
  • 2,5 мл 20% Tween 80 (альтернативно, 1 мл без обменной 20% Тилоксапол)
  • 10 мл 1% циклогексимид

ADC (1 л)

  • 20 г D (+)-Глюкоза
  • 50 г BSA доляV
  • 8,5 г NaCl
  • 800 мл DDH 2 O
  • Растворите вместе, регулировать громкость до 1 л и стерилизуют при 0,2 мкм фильтр. Хранить при температуре 4 ° C.

Кроме того, для подготовки OADC (1L), добавьте все компоненты, перечисленные выше плюс 50 мл 1% олеиновой кислоты (рецепт ниже составляет 250 мл партии). Растворите вместе, регулировать громкость до 1 л и стерилизуют при 0,2 мкм фильтр. Бутылка должна быть завернуты в алюминиевую фольгу и хранить при 4 ° C.

  • 2,5 г олеиновой кислоты
  • 250 мл 0,2 М NaOH
  • Оттепель олеиновой кислоты (затвердевает при охлаждении) путем нагревания при 55 ° C в течение 10 минут и добавьте в раствор NaOH и тепла при перемешивании в течение 60 мин. Хранить в стерильные стеклянные бутылки, которые завернуты в алюминиевую фольгу. Печать бутылки с парафином и хранят при 4 ° C.

Если предпочтительнее, вы можете приобрести коммерческую BD BBL Middlebrook АЦП или OADC с каталазы обогащения.

1% Циклогексимид (100 мл) сильная>

  • 1 г циклогексимид
  • 100 мл DDH 2 O

Растворить и стерилизовать с 0,2 мкм фильтр. Хранить при температуре 4 ° C. Внимание: циклогексимид является токсичным так обращаться с крайней осторожностью.

20% (V / V) Tween 80 (100мл)

  • 20 мл Tween 80
  • 80 мл DDH 2 O

Кроме того, вес 20 г Tween 80 (около 18,9 мл, плотность 1,06 г / мл), подготовить 20% вес / объем раствора. Тепло решение до 55 ° С в течение 30 мин до растворения, и смешать полностью. Стерилизовать жидкость с 0,2 мкм фильтр. Хранить окончательное решение при комнатной температуре.

20% (V / V) Тилоксапол (100 мл)

  • 20 мл Тилоксапол
  • 80 мл DDH 2 O

Кроме того, вес 20 г Тилоксапол (около 18,2 мл, плотность 1,1 г / мл), подготовить 20% вес / объем раствора. Тепло решение до 55 ° С в течение 30 мин до ди-ssolve, и смешивать полностью. Стерилизовать жидкость с 0,2 мкм фильтр. Хранить окончательное решение при комнатной температуре.

Примечание 1: Глицерин запасов M. туберкулезом, получают с использованием следующих протоколов.

Чулок М. туберкулез

  • Расти M. туберкулез в 50 мл MADC к насыщению (OD 600 = 1,5 до 2,0) при 37 ° C при встряхивании условиях (100 оборотов в минуту). В зависимости от штамма, это займет 7-14 дней.
  • Побочные образцов при 2000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин с культурой гранул. Удалить супернатант.
  • Ресуспендируют в 6 мл стерильного 50% глицерина.
  • Алиготе 1,5 мл на 4 Corning флаконы криогенные и этикетки надлежащим образом.
  • Сразу вспышки замораживания флаконов в этанол / сухой лед и хранят при температуре -80 ° C.

Примечание 2: Бактериологические штамм H37Rv (-80 ° C складе до 1,5 лет) в 70 мл MADC СМИ дает OD 600 </ SUB> около 0,6 после 5 дней роста при 37 ° C при встряхивании условиях (100 оборотов в минуту) в Innova 40 Shaker.

Примечание 3: Для проверки культуре загрязнения, следователи могли привить культуру аликвоты на стандартные богатой средой и проверки отсутствия роста после инкубации в течение ночи. Регулярно, культуры высевают на агар MADC для наблюдения морфологии колонии и изучать по фазово-контрастной микроскопии. При желании, культур могут быть проверены методом ПЦР с использованием IS 6110 праймеров, как описано 3.

2. Представитель Результаты

Образец, который хорошо подготовлен даст ЯМР-спектр похож на тот, изображенный на рисунке 2. Этот спектр является представление M. туберкулез диких бассейн метаболического типа. Определены метаболиты которые прямо или косвенно связаны с D-аланин пути. Кроме того, величины интенсивностей пиков пропорциональна концентрации метаболитов представитьВ клеточный экстракт. Поэтому изменения в интенсивности пиков между необработанными культурами, медикаментозное лечение, и мутантные штаммы могут указывать возмущения в метаболиты и метаболические пути. М. туберкулез 1D 1 H ЯМР-спектры были собраны на Bruker Avance 500 МГц спектрометре оснащены тройным резонансом, Z-оси градиента криозонда. Спектр содержит ок. 400 пиков, из которых можно было идентифицировать и количественно 40-50 метаболитов, в том числе аминокислоты, нуклеотидные прекурсоров, а также гликолиза и лимонной кислоты промежуточные. BACS-120 смены образца с программным обеспечением Bruker икона была использована для автоматизации сбора данных ЯМР. 1D 1 H ЯМР-спектры были собраны с помощью возбуждения скульптуры от 4 до эффективного удаления растворителя и поддержания плоской базовой линии, исключая любую необходимость базовой коллекции, которые могут вызывать артефакты в последующем анализе главных компонент (PCA) или ортогональной частичных наименьших квадратов дискриминантного анализа (OPLS- DA). А 1D 1 Н-ЯМР-спектр собранных при 25 ° C с шириной спектра 5482,5 Гц и 32 точек данных. В общей сложности 16 фиктивных сканирований и 128 сканирований были использованы для получения спектра. 1D ACD Labs ЯМР процессор программное обеспечение было использовано для полуавтоматической обработки всех 1D 1 H ЯМР спектров. Спектры преобразования Фурье, поэтапно, и ссылки на ТСГУ пика (0,0 промилле). Пакет NMRpipe программного обеспечения была использована для индивидуальной обработки 2D 1 H-13 C-ЯМР-спектры и проанализированы с NMRDraw. Bruker FID файл данных сначала преобразуются в формат файла узнать по NMRpipe, а затем спектра преобразования Фурье, фаза исправлены, и нулями. Наблюдаемые пики ЯМР в 1D 1 H ЯМР-спектр и 2D 1 H-13 C-ЯМР-спектр назначены на специфических метаболитов с использованием 1 Н и 13 С химическим сдвигом допуски 0,05 и 0,50 промилле, соответственно, и Мэдисон Metabolomics консорциума базы данных (MMCD ) 6 и правам метаболом базы данных. 7 В частности, 1D и 2D ЯМР-спектров вручную отобранные пик, где пик список ЯМР химических сдвигов затем загружены на человека метаболом базы данных. Метаболиты определенных прав База данных метаболом назначены на ЯМР-спектр на основе как максимальное количество совпадающих ЯМР резонансов и принадлежности к метаболической сети. Каждое соединение или метаболит, как правило, имеет несколько пар CH и, соответственно, несколько резонансов ЯМР. Таким образом, чем больше этих ЯМР резонансы, которые наблюдаются в экспериментальных спектров ЯМР, тем больше вероятность метаболита присутствует. Кроме того, выявление нескольких метаболитов, ассоциированных с тем же пути увеличивает вероятность правильного назначения. Наличие метаболитов и метаболических путях проверяются Энциклопедия Киотского генов и геномов (KEGG) 8 и MetaCyc баз данных. 9 Mycobacterium smegmАтис является полезной модели системы для М. туберкулеза и других микобактериальных патогенов. Как описано в другом месте, образцы M. smegmatis также может быть нарушена путем обработки ультразвуком 10.

figure-protocol-2
Рисунок 2. 1D 1 H ЯМР-спектр микобактерий туберкулеза клеточного экстракта. ЯМР пиков, связанных с представителем метаболитов помечены. Сокращения являются следующие: AMP, аденозин фосфат моно; α-кг, α-КГ, Glu, глутамат, и Ала, аланин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Значительное число исследований были проанализированы транскриптомных и протеомных профилей M. туберкулезом в различных в пробирке и в естественных условиях. 11-16 конечном счете, изменения в экспрессии генов и активность фермента приводит к изменениям в концентрации малых молекул молекулярные веса. Полное описание этих соединений составляет метаболом. Таким образом, эффекты лекарственных препаратов и различных условий роста на метаболических путей может сопровождаться metabolomic а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории д-ра Барлетта и д-р держав за полезные замечания при разработке протокола. Мы благодарим Wendy Остина за полезные обсуждения и редактирование рукописи. Работа, описанная в этой рукописи была профинансирована за счет грантов семян пилот каждого следователя, перечисленные выше из Университета Небраски-Линкольна окислительно-восстановительного центра биологии (родитель грант № NCRR 2P20RR 017675, Д. Беккер, PI). Кроме того, мы благодарим доктора Офелия Чакона для предоставления средств из своего гранта R21 (1R21AI087561-01A1) для исследования материалов и частичная поддержка зарплата г-н Halouska, чтобы стандартизировать методы ЯМР включены в эту публикацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название Реагенты / Оборудование Компания Номер по каталогу Комментарии
ADC обогащению BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 образца Changer Bruker
Bruker Avance ЯМР Bruker 500 МГц
Бычьего сывороточного альбумина Fisher Scientific BP1600-100 Доля V
Центрифугировать Beckman Coulter Allegra X-15R Настольные
Центрифуги трубы Гранулирование 430291 50 мл стерильной полипропилена
Криогенная Флаконы Гранулирование 430488 2,0 мл стерильного полипропилена
Cycloheximide Научно AG C-1189 Токсичный
D (+) - Глюкоза ACROS 41095-0010
Оксид дейтерия Sigma Aldrich 617385
Коническая колба Эрленмейера VWR 89095-266 Стерильные, плоское основание, поликарбонат, 0,22 мкм PTFE мембраны вентилируемый колпачок
Flash Freeze колба VWR 82018-226 750 мл
Замораживание сушилка VWR 82019-038 4,5 л Настольные
Глицерин GibcoBRL 15514-029
Инкубатор Нью-Брансуик Innova 40 Настольный шейкер
Лизирующий матрицы B MP Biomedicals 6911-100
Лизис машины MP Biomedicals ФаastPrep-24
Микроцентрифуга Eppendorf 5415D Настольные
Микроцентрифуга Beckman Coulter Микроцентрифуге 22R Настольные
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
ЯМР труб Norell ST500-7 5 мМ
OADC обогащению BD BBL Middlebrook 212351
Олеиновая кислота Сигма O1008
Калия фосфат двузамещенный VWR BDH0266
Фосфат калия однозамещенный VWR BDH0268
Ротор - микроцентрифуге 22R Beckman Coulter F241.5P Герметичные и полипропилена
Ротор - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 С био-сертифицированную крышки
Хлористый натрий Fisher Scientific S271-3
Натрий-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4 Cambridge Изотопный DLM-48
Спектрофотометр Beckman Coulter DU-530
Спектрофотометр кювет Спасательный трос LS-2410 1,5 мл полистирола, 2 ясно сторон
Шприц Becton Dickinson 309585 Стерильные, 3 мл Luer-Lok
Шприц фильтр Nalgene 190-2520 0,2 мкм стерильные ацетата целлюлозы
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1(2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. , Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. , (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. , (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

31H2H 13C

Похожие статьи