Методическая статья

Паразита индуцированные генетически Руководствуясь аутоиммунные болезни Шагаса сердца в куриный модели

17.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3716

⸱

29 июля 2012 г.

 ,  ,  , 
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, University of Brasilia

В этой статье

Краткое содержание

Прививки Trypanosoma cruzi В оплодотворенные яйца до инкубации оказывает паразит kDNA minicircle интеграции в геном клеток зародыша. Скрещивание показывает вертикальную передачу мутаций в потомстве. KDNA интегрируется в области кодирования на нескольких хромосом и куры умирают с воспалительным аутоиммунным заболеванием сердца.

Аннотация

Trypanosoma cruzi острых инфекций, приобретенных в младенчестве и детстве, кажется бессимптомно, но примерно треть хронически инфицированных случаи показывают, болезнь Шагаса до трех лет или позже. Аутоиммунные и паразитов настойчивость конкурирующих теорий для объяснения патогенеза болезни Шагаса 1, 2. Для отдельных ролей паразита настойчивость и аутоиммунных в болезнь Шагаса мы привить T. cruzi в воздухе камеры оплодотворенных яиц. Зрелые курица иммунная система жесткой биологический барьер против Т. cruzi и искоренить инфекции на развитие его иммунной системы к концу первой недели роста 3. Птенцы паразитов по бесплатному штриховки, но они сохраняют интегрированы паразита митохондриальной ДНК kinetoplast (kDNA) minicircle в их геноме, которые передаются потомству. Документация kDNA minicircle интеграции в геном курицы было получено Таргeted премьер-ХВОСТ-PCR, Южной гибридизации, клонирования, секвенирования и 3, 4. KDNA minicircle интеграции разрыв открытых рамок считывания для транскрипции и иммунные факторы системы, фосфатазы (ГТФ), аденилатциклазы и фосфорилазы (ПКС, NF-каппа В активатор, PI-3K), связанные с клеточной физиологии, роста и дифференциации 3, 5 - 7, и другие функции гена. Тяжелый миокардит в связи с отказом от волокон целевой сердце эффекторов цитотоксических лимфоцитов проявляется в kDNA мутировал кур, показывая воспалительный кардиомиопатия аналогичным тому, которое наблюдалось в человеческой болезни Шагаса. В частности, сердечной недостаточности и слабости скелетных мышц присутствует у взрослых кур kDNA разрыва в гене дистрофина в хромосоме 1 8. Подобные genotipic изменения, связанные с разрушением тканей осуществляется эффекторов CD45 +, CD8γδ +, CD8α лимфоцитов. Таким образом, этот простейший инфекция может вызвать генетически управляемых аутоиммунных заболеваний.

Протокол

1. Рост паразитов

  1. Рост trypomastigote форм Т. cruzi Береника и β-галактозидазы, выразив Tulahuen T. cruzi MHOM/CH/00 C4 в мышиные клетки мышцы (L6) выращивают в Дульбекко минимальный основной среде с 10% FSB, 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 250 нМ L-глутамин (рН 7,2), 5% CO 2 при 37 ° C. Свободное плавание trypomastigotes в надосадочной среды были использованы для заражения куриных яиц.
  2. Рост Leishmania braziliensis (Lb) LTB300 акции выросли в DMEM с 20% ЭТС. Форма Lb промастиготы в экспоненциальной фазе роста использовали для инокуляции яиц 9.

2. Прививка паразитов в оплодотворенных куриных яиц

  1. Инокулировать подвески 100 т. cruzi trypomastigotes в 10 мкл культуральной среды через 2-мм отверстие в оболочке яйца на верхней воздушной камеры стадииX оплодотворенные яйца. Вторжения и репликации опасных паразитов в клетках эмбриона показано в видео S1. Контрольной группы являются следующие: а) контроль кур, б) макет яйца контроль получения 10 мкл культуральной среде, в) этап X оплодотворенные яйца привитых с подвеской 100 promastigotes Lb в 10 мкл культуральной среды Т.. cruzi и Lb принадлежат kinetoplastid семьи. Соответственно, эти простейшие расти свободно в цитоплазме или в паразитофорной вакуоли клеток хозяина 10.
  2. Уплотнение отверстия липкой лентой.
  3. Инкубируйте T. cruzi-инфицированные яйца и макет и неинфицированных контрольных проб в 37,5 ° C и 65% влажности в течение 21 дней.
  4. Держите цыплят, которые вылупляются в инкубаторе в течение 24 ч, а затем при 32 ° C в течение трех недель.

3. Получение образцов для выделения ДНК

  1. Мононуклеаров периферической крови клетки были получены от кур: а)вылупившиеся из T. cruzi привиты яйца, б) контроля, в) получение издевается 10 мкл культуральной среды, г) вылупился из яйца Lb привиты, белые кровяные клетки с курами, обрабатываются для экстракции ДНК в соответствии со стандартным протоколом 11.
  2. Извлечение ДНК из спермы также собраны из петухов, и от бесплодных ооцитов (<5 мм), собранных от кур, вылупившихся из яиц привитых с Т. cruzi, и кур, вылупившихся из яиц контроль 3, 4.
  3. Извлечение kDNA от Т. cruzi эпимастигота формы и, кроме того, из Lb promastigotes, как описано в другом месте 9.

4. Праймеры и зонды использовано

Праймеров для амплификации ПЦР и тепловые условия приведены в таблице 1.

Зонды, используемые в Южной гибридизации пятном были:

  1. Дикого типа minicircle (~ 1,4 кб) последовательностей пуриFied от Т. cruzi эпимастигота форм;
  2. Minicircle фрагментов (362 б.п.), полученный НСИ я дайджесты дикого kDNA;
  3. Ядерная ДНК (nDNA) повторяющиеся последовательности (188 б.п.), полученный усиления паразита ДНК с Tcz1 / 2 праймеров. Зонды были очищены от 1% агарозном геле 3.
  4. Дикого типа minicircle (~ 0,820 кб) последовательностей из Lb promastigotes.

5. ПЦР-анализ

  1. Выполните стандартную процедуру ПЦР с геномной ДНК от инфицированных цыплят и неинфицированных управления и издеваться над использованием T. cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 и kDNA s35/s36 13 праймеров. Кроме того, работать ПЦР с геномной ДНК от кур вылупившихся из Lb-инфицированные яйца помощью простейших конкретных Lb3 и Lb5 праймеров (табл. 1).
  2. Сделать реакционной смеси с 100 нг ДНК-матрицы, 0,4 мкМ каждой пары праймеров, 2 U Taq ДНК-полимеразы, 0,2 мМ дНТФ и 1,5 мМ MgCl 2 в 25 мкл конечного объема.
  3. Установите программу для Термоциклер 95 ° C в течение 5 мин, 30 циклов 30 секунд при 95 ° C/30 сек при 68 ° С / 1 мин при 72 ° С, 5 мин окончательное расширение до охлаждения.
  4. Анализ продуктов амплификации в 1,3% агарозном геле, который передается на положительно заряженных нейлоновую мембрану (GE Life Sciences) в щелочной метод гибридизации с зондами помечены [α-32 P] дАТФ использованием случайного праймера маркировки Kit (Invitrogen , Карлсбад, Калифорния).

6. Геномная Южной Блоты

  1. Используйте Мбо я и / или Eco RI (Invitrogen) ферменты, которые делают одно сокращение minicircles интегрирована в ДНК образцов тканей тела.
  2. Дайджест ДНК из неинфицированных кур контроля, а также куры вылупился из яйца привитых с опасной T. cruzi формы.
  3. Тема дайджесты ДНК T. cruzi ииз образцов куриного тест для электрофореза в 0,8% агарозном геле при 50 В течение ночи при 4 ° C.
  4. Передача разделенных групп ДНК положительно заряженными нейлоновую мембрану.
  5. Гибридизации ДНК полосы с надписью радио kDNA зонда.
  6. Вымойте мембраны дважды в течение 15 мин при 65 ° C с 2X SSC и 0,1% SDS, дважды в течение 15 мин при 65 ° С каждой 0,2 x SSC и 0,1% SDS и авторадиограмма для различных периодов времени.

7. Целевые премьер-ХВОСТ-PCR

  1. Получить усиления kDNA minicircle интегрироваться в геном куриного модифицированным Хвост-PCR метод, который сочетает в себе kDNA грунтовки с конкретными грунтовка устанавливает 2 в трех ходить в циклах ПЦР, как показано на рисунке 1.
  2. Первичный цикл: каждая реакция включает в себя 200 нг ДНК-матрицы, 2,5 мМ MgCl 2 и 0,4 мкМ kDNA праймеров (S34 или S67), 0,2 дНТФ мм, 2,5 U Taq Platinum (Invitrogen, Карловы Вары, CА). Используйте kDNA грунтовки в сочетании с 0,04 мкМ гг праймеров (gg1 в Gg6, таблица 1), отдельно. Установите температуру с 57,9 до 60,1 ° С в течение kDNA грунтовки и с 59,9 до 65,6 ° C для CR-1 грунтовки. Обратите внимание, что эти температуры выше, чем у (~ 45 ° C), необходимых для произвольного вырожденного праймеры, используемые в хвост-PCR 10. Использование температуры и циклы (MyCycle Термоциклер, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), описанной в предыдущей статье 3.
  3. Вторичный цикл: Развести продуктов ПЦР с основной цикл 1:40 (об / об) в воде. kDNA грунтовки S35 и S35 антисмысловых заменили предыдущие, вместе с теми же праймерами гг.
  4. Третичного цикла: развести PCR продуктов из вторичного цикла 1:10 (объем / объем) в воде и объединить гг грунтовки с S67 или S36 антисмысловых отдельно.
  5. Клонирование ПЦР третичного цикла продукции: Clone непосредственно в pGEM T легко вектор (Promega, Madison, WI)продукции, что последнее усиление гибридизации с kDNA зонда.
  6. Выберите клонов путем гибридизации с зондом kDNA и последовательности.
  7. Проверка tpTAIL-ПЦР в смеси 300 мкг kDNA от Т. cruzi с 200 нг ДНК от контроля птиц никогда не подвергается kDNA. Температуры и усиление циклов такие же используются для ДНК-теста птиц.

8. Болезнь Шагаса клинических проявлений

  1. Мониторинг роста и развития цыплят вылупились из T. cruzi инфицированные яйца и здоровых вылупившихся из незараженных яиц в день смертность и еженедельно для проявлений болезни.
  2. Обнаружение клинических отклонений в этих кур (рис. 2) и сделать электрокардиограф (ЭКГ) записи для оценки электрической оси, ЧСС и аритмии 3.
  3. Тема kDNA-мутировал и контролирует кур ежемесячно ЭКГ расширенной желудочка ООНipolar приводит AVF (левая нога), AVL (левая рука) и AVR (правая рука), и оценить отклонение средней электрической оси влево, что наводит на мысль о расширении сердца 3.

9. Патология и иммунохимических анализов

  1. Сердце записи и индексы массы тела после смерти природных kDNA мутировал кур (рис. 3). Получить индексы также для управления кур одного и того же возраста и пола.
  2. Возьмите разделы из сердца, пищевода, кишечника, скелетных мышцах, легких, печени и почек.
  3. Исправить ткани в буферном 10% формалина (рН 7,4), вставлять в парафин и сократить до 4 мкм разделы гематоксилин-эозином (HE) окрашивания и гистологического анализа (рис. 3).
  4. Урожай и делить пополам тканей эмбрионов вылупился из яйца паразитов, привиты с выражением β-галактозидазы, и в соответствии с X-Гал-пятно 9.
  5. Закрепите вторую половину ткани эмбриона в 10% формалине, рН 7,4 и действовать, как в шаге 9.3.
  6. Вырезать 4μm тонкий парафин ткани раздел и установить на стекло для микроскопического исследования.
  7. Инкубируйте разделы, отображающая X-Gal окрашенных синей клетки человека chagasic антисыворотки (1:1024 разбавления) против анти-Т cruzi антигена.
  8. Вымойте разделы мигом с PBS, 7,4 рН, 5 мин.
  9. Пятно синий клеток в эмбрион тканей второй инкубации с флуоресцеин-сопряженных кроличьих анти-IgG человека.
  10. Вымойте участки с PBS (шаг 8), крепление с покровным и наблюдать синий свет клетки-зеленым на рассмотрение в УФ-свете при 502 нм, 200х увеличение, для colocalizing T. cruzi в зачаточном состоянии клеток.

10. Фенотип клетки иммунной системы, в сердце поражения

  1. Фенотип клетки иммунной системы эффекторов в срезах ткани сердца от kDNA-положительных и от контроля kDNA-отрицательные кур.
  2. Поместите слайды ссрез ткани в парафин при температуре 65 ° С в течение 30 мин, чтобы расплавить воск до представления в четырех моет в 100% до 70% ксилола, а затем в абсолютном этаноле PBS в течение 5 минут каждый.
  3. Промойте слайдов в дистиллированную воду, воздух сухой, и обращаться с конкретными моноклональных антител (флуоресцеин или R-фикоэритрин конъюгированных моноклональных антител), полученные из SouthernBiotech, Бирмингем, Алабама.
    1. Используйте мышь, анти-курица-Бу-1 (Bu-1 и Ви-1 аллелей б, г-н 70-75 кДа) Маб AV20 признать мономорфных детерминант на антигенов клетки инбредных кур.
    2. Используйте мышь, анти-CD45 курица, Ig изотипа IgM1 κ относящиеся к куриным тимуса линии клеток (г-н от 190 до 215 кДа вариант).
    3. Используйте мышь, анти-курица TCRγδ + (Г-н 90-кДа гетеродимер) Маб, специфичные для тимус зависимых CD8α + Т-клеток.
    4. Используйте мышь, анти-курица Маб CD-8, специфичные для куриных α цепь (г-н 34 кДа) признать йэлектронной CD8 клеток в тимоцитов, селезенки, сердца и других тканей.
    5. Используйте мышь, анти-курица KuL01 исключительно признать, моноциты / макрофаги фагоцитарной системы.
  4. Вымойте слайд три раза с 0,1 М PBS, рН 7,4, 5 мин после инкубации с конкретными анти-фенотип антител в течение 90 мин во влажной камере.
  5. Соберите слайд с буфером глицерин для экзамена по флуоресцентным микроскопом с испусканием фильтр с длиной волны 567 и 502 нм, соответственно, для обнаружения красного и зеленого флуоресцентного меченых клеток (рис. 4).

11. Анализ данных

  1. Использование базы данных куриного генома ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031 ) для анализа BLASTN последовательности.
  2. Используйте CLUSTALW выравнивания для определения электронной значения баллов.
  3. Применять Г.И.RI повторить алгоритм маскировки цензура ( http://girinst.org/censor/index.php ) для локализации различных классов повторяется в химерных последовательностей.
  4. Применять Kinetoplastid вставки и удаления последовательности Search Tool (KISS) для выявления потенциальных gRNAs в последовательности kDNA, с помощью WU-BLASTN модифицированных-матрицей 3.
  5. Использование Т. cruzi последовательности http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas искать в gRNAs в kDNA хозяина химеры ДНК. 11.6) Использование Стьюдента и Kolmorov-Смирнова испытания, соответственно, для выявления существенных различий между отклонений электрической оси, а также между сердцем / тело показатели веса, полученные в экспериментальной и контрольной групп, а также для выявления смертности соотношения значимых различий между группами цыплят вылупились от Т. cruzi яnoculated яйца и от контроля.

12. Представитель Результаты

Прививка 100 опасных Т. cruzi trypomastigotes в воздухе камеры оплодотворенные яйца куриные не значительно сократить отношения цыплят живьем. Около 60% здоровых цыплят люк и 40% могут подвергаться сжижению эмбриона или зародыша смерти вылупления. Оставшиеся в живых цыплят сохранить последовательность kDNA minicircle интегрироваться в геном. Тем не менее, ожидается, что некоторые птенцы погибнут с кардиомегалия и неудачи в течение нескольких недель после вылупления. Остальные цыплят возрастет до внешне здоровых взрослых людей. На всех этапах жизни ДНК, выделенной из крови мононуклеаров даст ПЦР-амплификации kDNA, но не nDNA. Целевых премьер-ХВОСТ-PCR 3, 4 продуктов, которые клонируются и последовательность покажет kDNA minicircles интегрированы в основном в регионах кодирования macrochromosomes 1 до 5. Куры отображения нескольких kDNA яntegrations в генах, кодирующих роста и дифференцировки клеток, иммунных факторов системы регуляции и репарации ДНК являются кандидатами для прохождения отказ от самостоятельного тканях (рис. 3). Например, курица показывает kDNA мутации с разрывом в гене дистрофина (рис. 5), кодирующих белок, который связывает цитоскелета к клеточной мембране, является кандидатом на развитие аутоиммунных воспалительных кардиомиопатии и неудачи.

Эти модификации генома не видел цыплят из Lb инфицированных яиц. Существуют различия между T. cruzi и Lb kDNA minicircles, Т. cruzi к ДНК minicircle среднем 1,4 кб структуру с четырьмя переменными области (VR) перемежаются консервативных регионов (CR), каждый представляет CSB1, CSB2 и CSB3 регионов, в которых CA-богатые ДНК изогнутые рассматриваются конкретные сайты для инициации репликации, транскрипции, рекомбинации, так и для горизонтальной передачи ДНК 4. Контрастно, Lb kDNA minicircle (средний размер 820 б.п.) содержит одну CR следует VR. CR сохранил CSB1 (GGGCGT) и CSB2 (CCCCGTTC) блоки, которые отличаются от тех, в Т. cruzi minicircles 15, 16 и 17. Учитывая, что Lb CSB3 (GGGGTTGGTGTA) показывает 12 НТС гомологии T. cruzi можно предположить, что либо Lb kDNA minicircle интегрируется в более низких частот, которые могут быть не видны на методы, используемые, или что он может, вероятно, не интегрируются в геном курицы вообще.

Грунтовка ДНК-мишени Последовательность Т *
S 34 Т. cruzi kDNA 5 'ACA ОСО ACC ОСО УВД ГАА CC 3' 57,9
S 67 Т.cruzi kDNA 5 'ГГТ ТТТ GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3 " 60,1
S 35 Т. cruzi kDNA 5 'ATA ATG TAC GGG (T / G) GA GAT GC 3' 59,4
S 36 Т. cruzi kDNA 5 'ГГТ TCG АТТ ГТТ ГГТ GGG G 3 " 57,9
Lb3 Lb kDNA 5 'GGG GTT ГГТ GTA ATA TAG TGG G 3 " 55,9
Lb5 Lb kDNA 5 'CTA ATT GTG CAC GGG GAG G 3 " 61,4
GG 1 Gallus Gallus 5 'AGC TGA TCC ТАА CAG AGG AGC 3' 60,1
GG2 Г. Gallus 5 'КТГ AGC СТС ТГКТТТ ГАА 3 ' 56,8
Gg3 Г. Gallus 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3 " 60,1
GG4 Г. Gallus 3 'GCT КТГ CCT TTA GGA TCA GCT 5' 64,2
Gg5 Г. Gallus 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' 62,3
Gg6 Г. Gallus 3 'КТГ TTA GCA TGA GGC TTC ACA 5' 60,4

Таблица 1. Простые, используемые в ПЦР уточнениями. * Т = средняя температура отжига ° C.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Р Хвост-PCR стратегия используется для обнаружения Trypanosoma cruzi kDNA интеграции в Gallus Gallus генома. А) химерных последовательностей с фрагментом kDNA minicircle консервативных (синий) и переменной (голубой) регионов интегрирована в очаге NW_001471687.1 в хромосоме 4 (AY237306) из куриного генома 10 (зеленый) был использован для получения принимающей конкретного набора праймеров (gg1 в Gg6). Б) р Хвост-PCR амплификации были начаты (первичный цикл) по отжигу minicircle конкретных S34 или S67 грунтовки в сочетании с куриным конкретных gg1 в Gg6 праймеров. Разводненная продуктов, предоставляемых шаблон для вторичного цикла с S35 (смысл / антисмысловые) грунтовки и комбинации праймеров гг. В третичном цикле разведения вторичные продукты подвергали амплификации kDNA S36 или S67 грунтовки антисмысловых в сочетании с грунтовкой Ггс. C) Эти продукты амплификации разделяли в 1% агарозном геле и переданы в нейлоновой оболочкой, гибридизации с зондом конкретных kDNA. Образцы показывает позитивный сигнал были использованы для клонирования, чтобы определить точку интеграции. Комбинации kDNA и целевых gg1 в Gg6 показаны в верхней части геля. Последовательных реакций ПЦР усиления целевой kDNA хозяина ДНК с kDNA minicircles (синий) и птичий последовательность (зеленый). (Перепечатано из PLoS забытых тропических болезней 3).

figure-protocol-2
Рисунок 2. Клинические проявления нарушения функции сердца в 9-месячный цыпленок генетически модифицированные интеграции митохондриальной kDNA minicircle от Т. cruzi. Бедная кислородом кровь митохондриальной kDNA мутировал курица показывает фиолетовый контрастов гребень с ярко-красными гребень управление 9-месячного chickeя свободна от повреждения сердца. (По материалам PLoS забытых тропических болезней 3).

figure-protocol-3
Рисунок 3. Гросса и микроскопических патологии Gallus Gallus с мутациями kDNA. А) Кардиомегалия в 9-месячный курицу, которая умерла от сердечной недостаточности. Б) Управление сердце от неинфицированных 9-месячного курицы. C) Отказ от клетки-мишени сердца цитотоксических лимфоцитов: минимальная единица отказ с лизиса клеток-мишеней иммунной лимфоцитов изображен (круг). D) Управление сердце гистологии (с изменениями по PLoS забытых тропических болезней 3).

figure-protocol-4
Рисунок 4. Иммуноцитохимическая анализ клетки иммунной системы проникают в сердце kDNA-мутировал курица показано на рисунке 3. А) CD45 + лимфоцитов определены (стрелки) в сердце леsions по фикоэритрин-меченных моноклональных антител. B) CD8 + γδ иммунных лимфоцитов (стрелки), участвующих в серьезные разрушения сердца. С), обильные CD8α + Т-клеток, присутствующих в тяжелые поражения сердца с лизирует клетки. Вставки показывают отсутствие клеток иммунной системы в борьбе неинфицированных сердце курицы (с изменениями по PLoS забытых тропических болезней 3).

figure-protocol-5
Рисунок 5. Шагаса, как расширенные воспалительных кардиомиопатии в F2 потомство с kDNA интеграции в гене дистрофина. А) Расширенные сердце в 10-месячный цыпленок занимает большую часть грудной полости (сердце вес = 16 г). Б) темный круглый мононуклеарных инфильтратов и разрушает клетки миокарда kDNA-мутировал курицы. C) Нормальный размер сердца (весом 7 г) на 10-месячный контроль курицы. D) Нормальный гистологии сердца куриного управления. (По материалам PLoS забытых Tropicдр. болезней 3).

figure-protocol-6
Рисунок 6. Сравнительная патология в kDNA-мутировал курицу и в человеческой болезни Шагаса. А) тяжелый миокардит и целевых лизирует клетки сердца в kDNA-мутировал курицы. Б) Тяжелый миокардит и лизиса клетки-мишени иммунной лимфоцитов в случае сердечно-сосудистых заболеваний Шагаса. C) Отказ от сердечных клеток иммунной лимфоцитов в kDNA-мутировал курицы. D) Отказ от сердечных клеток иммунной лимфоцитов человека болезнью Шагаса. Окраска по гематоксилином и эозином. (С изменениями по Memorias сделать Института Освальдо Круса, Рио-де-Жанейро, 14).

Обсуждение

В отличие от млекопитающих, восприимчивых к пожизненной T. cruzi инфекций, куры с предубеждением относятся к Т. cruzi инфекции. Основное преимущество модели системы курица является устранение инфекции на ранних стадиях разработки эмбрионального иммунной системы. Таким образом, только ДНК паразита оставаясь в куриных тела интегрировано в нескольких локусов.

Использование оптимального количества вирулентных T. cruzi trypomastigotes привить плодородной яйцо является критическим шагом на пути к получению интеграции kDNA minicircles в геном эмбриона цыпленка. Скорость вылупления птенцов живого из яйца привиты 100 trypomastigotes в четыре раза выше, чем полученная с 500 паразитов. Следует проявлять осторожность, чтобы привить паразитов суспензии в 10 мкл культуральной среды в камеру воздух яйцо. Там не должно быть утечки яичный белок. При оптимальных условиях внутриклеточной паразитарной инфекции происходит штонкие через несколько часов после инкубации и размножения паразитов внутри клетки-хозяина доходов в течение одной недели, после чего инфекция устранить врожденный иммунитет. Интеграция kDNA требует живой инфекции и прививки голый minicircles в раннем яйца куриного эмбриона не приводит к интеграции. KDNA-положительных эмбрионов и контроля должны быть размещены в контролируемых условиях на 37,5 ° C и 65% влажности. Птенцы находятся в клетках в течение двух недель при 33 ° C комнатной температуры. После этого куры содержатся в клетках на стеллажах приостановлено разделенных на 1,5 м в ширину прохода в помещении при температуре 22 ° C с фильтром воздуха и избыточного давления при постоянном истощении обеспечить условия животных. Взрослые кормят куриным-чау и пить питьевой водой для достижения полного роста и зрелости, откладывают яйца в пять месяцев. Обеспечение гигиенических процедур необходимы для воспроизводимости результатов при работе с Т. cruzi привитыв оплодотворенные яйца куриные.

В системе куриных модель Т. cruzi инфекции уничтожаются после того, как развитие иммунной системы в раннем периоде роста зародышей. Кроме того, чтобы быть свободным инфекции, цыплят, которые вылупляются из T. cruzi привиты яйца, в отсутствие специфических антител, которые устойчивы к паразиту антигенов. Отказ от целевых клеток сердца цитотоксическими лимфоцитами (минимальная единица отказ, на рисунке 3) рассматривается в kDNA-мутировал кур показывающие изменения генотипа и разрушение иммунологический надзор 3. Генотипически измененных Т-клетки представляют ускоренный отказ от самостоятельного ткани в организме. Основной сайт поражение сердца, которое является отличительной чертой болезни Шагаса. Переход от физиологических (надзора) в physiopathologic состояние проявляется в kDNA-мутировал курица показывает клонально распространения цитотоксических лимфоцитов 3.

Тего transkingdom модель системы показывает, вызванные паразитами, генетически управляемых аутоиммунные заболевания (рис. 6), вытекающие из модификаций генома T. cruzi kDNA minicircle интеграции. Эти изменения не видны в птенцы вылупились из LB-привиты яйца.

Это явление позволяет предположить, что экспериментальное лечение воспалительных аутоиммунных кардиомиопатии в kDNA-мутировал кур может потребоваться препарат подавления костного мозга предшественников специфических Т-клеточный фенотип проникают в миокарде, и трансплантация histocompatible здоровый костный мозг, чтобы предотвратить отказ от самостоятельного ткани.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы в долгу перед Нэнси Р. Штурм, Отдел иммунологии, микробиологии и молекулярной биологии, Дэвид Геффен школы медицины Университета Калифорнии в Лос-Анджелесе, на критическое чтение рукописи. Национальный совет по научно-CNPq и Фонд развития исследований, FAPDF, Бразилии, поддерживают исследования. Мы благодарим технической помощи Алессандро О. Соуза, Мария С. Guimaro, Чиро Кордейро, Ана де Кассия Роза, Roseneide Алвес и Рафаэль Андраде из Университета Бразилиа, Бразилия.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Taq ДНК-полимераза рекомбинантных Invitrogen 11615-010
Платиновый Taq ДНК-полимераза Invitrogen 10966-030
Случайные ДНК праймеры системы маркировки Invitrogen 18187-013
Eco RI Invitrogen 15202-021
Я Мбо Invitrogen 15248-016
дНТФ Set, 100 решений GE Healthcare 28-4065-51
Amersham Hybond - N + - Кошка н. GE Healthcare RPN303B
PlasmidPrep Мини Спин комплект GE Healthcare 28-9042-70
Я НСИ Sigma-Aldrich R5884 1KU
ДНК, натриевая соль рыбы спермы AMRESCO 0644-10G
Мышь против куриной Бу-1b SouthernBiotech 8370-02
Мышь анти-CD45 курица SouthernBiotech 8270-08
Мышь против куриной TCRγδ SouthernBiotech 8230-08
Мышь против куриной CD8α SouthernBiotech 9220-02
Мышь против куриной моноцитов / макрофагов SouthernBiotech 8420-02
MyCycle Termocycler Bio-Rad Laboratories 580BR 5501

Ссылки

  1. Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
  2. Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
  3. Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000(2011).
  4. Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181(2010).
  5. Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
  6. Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
  7. Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
  8. Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
  9. Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
  10. Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
  11. Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571(2011).
  12. Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
  13. Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
  14. Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
  15. Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
  16. Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
  17. Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).

Перепечатки и разрешения

Теги

Паразита индуцированные генетически Руководствуясь аутоиммунные болезни Шагаса сердца в куриный модели
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.