Эндогенного оксида азота (NO), который регулирует широкий спектр биологических функций. Становится все более очевидным, что нарушение или нарушение регуляции NO на основе сигнализации участвует во многих заболеваний человека. Методы количественного соответствующих метаболитов NO может обеспечить новых диагностических и прогностических биомаркеров для человека заболеваний.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Аналитические методы пробирного азотной окиси биоактивность
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Оксид азота (NO) представляет собой двухатомный свободный радикал с крайне коротким временем жизни в биологических системах (менее 1 секунды в циркулирующей крови)1. NO можно считать одной из наиболее важных сигнальных молекул, вырабатываемых в нашем организме, которая регулирует жизненно важные функции, включая, помимо прочего, регуляцию артериального давления, иммунный ответ и нейронную коммуникацию. Следовательно, его точное обнаружение и количественное определение в биологических матрицах имеет решающее значение для понимания роли NO при здоровье и болезни. Ввиду столь короткого физиологического периода полувыведения NO были разработаны альтернативные стратегии обнаружения продуктов реакций биохимии NO. Количественное определение соответствующих метаболитов NO в нескольких биологических компартментах предоставляет ценную информацию относительно продукции, биодоступности и метаболизма NO in vivo. Простой отбор проб из одного компартмента, такого как кровь или плазма, не всегда может обеспечить точную оценку статуса NO во всем организме, особенно в тканях. Возможность сравнения крови с определенными тканями у экспериментальных животных поможет сократить разрыв между фундаментальной наукой и клинической медициной в плане диагностической и прогностической значимости биомаркеров NO при здоровье и болезни. Таким образом, экстраполяция статуса NO в плазме или крови на конкретные интересующие ткани больше не является корректным подходом. В результате продолжают разрабатываться и валидироваться методы, позволяющие обнаруживать и количественно определять NO и родственные ему продукты/метаболиты в нескольких компартментах экспериментальных животных in vivo. Устоявшаяся парадигма биохимии NO — от продукции NO-синтазами до активации растворимой гуанилатциклазы (sGC) и последующего окисления до нитрита (NO2-) и нитрата (NO3-) — может представлять лишь часть эффектов NO in vivo. Взаимодействие NO и производных метаболитов NO с тиолами белков, вторичными аминами и металлами с образованием S-нитрозотиолов (RSNO), N-нитрозоаминов (RNNO) и нитрозильного гема соответственно представляет собой cGMP-независимые эффекты NO и, вероятно, так же важны физиологически, как и активация sGC посредством NO. Подлинное понимание роли NO в физиологии основывается на экспериментах in vivo с одновременным отбором проб из нескольких компартментов. Методология исследования оксида азота (NO) представляет собой сложную и зачастую противоречивую науку и является предметом многочисленных споров и дискуссий относительно биохимии NO. Выяснение новых механизмов и сигнальных путей с участием NO зависит от нашей способности специфически, селективно и чувствительно обнаруживать и количественно определять NO, а также все соответствующие продукты и метаболиты NO в сложных биологических матрицах. В данной работе мы представляем метод быстрого и чувствительного анализа нитритов и нитратов с помощью ВЭЖХ, а также метод обнаружения свободного NO в биологических образцах с использованием озоновой хемилюминесценции in vitro с химической дериватизацией для определения молекулярного источника NO, а также метод анализа ex vivo с использованием миографии в органной ванне.
Протокол
1. Всего для сбора крови
- Соберите венозной крови от человека или от экспериментальных животных в NEM / ЭДТА содержащих труб.
- Сразу спином вниз крови в настольных центрифуг на 14300 RCF (относительно центробежных сил) в течение 7 минут, чтобы подготовиться плазмы и красных клеток крови гранул.
- Подготовить образцы плазмы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и обнаружения хемилюминесценции (CLD) анализа.
ВЭЖХ: Добавить 1:1 по объему холодного метанола в плазме, вихрь и центрифуги в 13 200 оборотов в минуту в течение 10 минут с белками плазмы осадок. Соберите супернатант для анализа ВЭЖХ.
CLD: аликвоту образца и preincubate с сульфаниламидных и сулемы специально нитрозотиолы анализа. - Подготовить красный осадок клеток для высокоэффективной жидкостной хроматографии и CLD анализа.
ВЭЖХ: Добавить 1:04 красный осадок клеток в гипотонический раствор лизиса, содержащего 10 мМ NEM, 2,5 мМ EDTA и 10 мМ феррицианида. Vortex тщательно, а затем добавить 1:01 метанол, вихревые и centrifЕГЭ в 13 200 оборотов в минуту в течение 10 минут для осаждения белков. Соберите супернатант для анализа ВЭЖХ.
ХЗЛ. Добавить 1:04 красный осадок клеток в гипотонический раствор лизиса, содержащего 10 мМ ЭДТА, 2,5 мМ EDTA и 10 мМ феррицианида. Алиготе образцов пробирки, содержащие сульфаниламиды и хлорид ртути для конкретных обнаружения нитрозотиолы.
2. Добыча и подготовка ткани
- Чтобы определить, ткань уровня метаболитов NO, в первую очередь необходимо собрать кровь бесплатно ткани для подготовки проб, как описано выше. Полный обмен крови будет проходить путем инфузии физиологического буфера через верхушки левого желудочка. Когда вся кровь удаляется, ткани интерес может быть собрано.
- Однородный образцы тканей и подготовки образцов, как описано выше для высокоэффективной жидкостной хроматографии и CLD анализа.
3. Аортального кольца изоляции для функции эндотелия
Ванна тканей органов
- Мыши будут ANESThetized с диэтиловый эфир, пока не реагирует на носу щепотку, и пройти шейки дислокации до операции. Торакотомия выполнена, чтобы подвергать грудной и брюшной аорты. 25 калибровочного шприца вводится в верхушке левого желудочка и перфузию бесплатно кровь с кислородом буфера Кребса Хенселейта.
- Правое предсердие режется обеспечить выход крови. Брюшной аорты, будут удалены и очищены от адвентиции.
- Кольца будут сокращены на 2 мм в длину сегментов и установлена на четырех каналов ткани ванночку (DMT 720MO, AD Instruments) купались в физиологическом растворе буфера.
- Судно кольца ведутся в 10-мл ванны орган с кислородом Кребса буфера (95% O 2 и 5% CO 2) при температуре 37 ° C. Один грамм претензии помещается на каждом аортального кольца (соответствующие исходные напряжение для оптимальной вазомоторной функции, которые определены в предыдущих экспериментах). Восьмиканальный восьмеричное моста (PowerLab) и сбора данных программное обеспечение (график версии 5.2.2)повторно используется для записи всех сил измерений.
- Кольца имеют право равновесие в течение 80 минут с буфером в каждом органе ванну менять каждые 20 мин. После уравновешивания в течение 80 мин, 1 мкМ фенилэфрин добавляется к каждому кольцо для субмаксимальной сокращения.
- После стабилизации состояния эндотелия агонистов, таких как ацетилхолин будет добавлено определение NO производства и степени судно релаксации. После того, как доза ответ на ацетилхолин, бани будет промыть и recontracted, а затем обрабатывают экзогенный источник оксида азота, натрия нитропруссид, чтобы определить чувствительность гладкой мускулатуры и, чтобы получить значение для 100% отдыха.
- НЕТ мусорщиков можно добавить в ванну, чтобы наглядно иллюстрируют освобождение NO и торможения судна релаксации.
4. Представитель Результаты
Использование ENO-20 выделенных ВЭЖХ обеспечивает простой в использовании метод высокой пропускной способности для специфичностью и чувствительностью обнаружения нитритов и нитратов вбиологической матрицы. Принцип обнаружения и оригинальные хроматограмм показано на рисунке 1. Этот метод может быть использован для любых биологических образцов для определения нитритов и нитратов. СТО на основе обнаружения метаболитов NO требует шаг химических derivitization для определения молекулярной источника NO. Экспериментальная установка для одновременного окислительной и восстановительной denitrosation denitrosation для хемилюминесценции детектора показана на рисунке 2. Реакционного сосуда справа заполнен 800 феррицианида в ФСБ рН 7,4 и реакционный сосуд на левой наполнен йодида калия / йода в смеси уксусной кислоты для уменьшения denitrosation (рис. 2A). Весь установки показана на рисунке 2Б. На рисунке 3 показаны группы специфических анализов denitrosation, которые могут обнаружить и количественно нитриты, нитрозотиолы, нитрозамины, а также нитрозильных продукции гема. Этот метод был ранее ОПИСАНИЕкровать и утверждены 4,5. Эти важные биохимические анализы могут быть легко связаны с функциональной исследования на изолированных кольца аорты, чтобы определить эндотелиальной NO производства в экспериментальных животных. Это классический фармакологического эксперимента можно легко и точно оценить эндотелиальной функции и производства. Измерение судно реактивность эндотелия агонистов, таких как ацетилхолин может непосредственно определить эндотелиальной NO производства, которые могут быть связаны с биохимическими биомаркеры обнаружен в крови и ткани экспериментальных животных. Типичное представление дозы ответ на ацетилхолин показано на рисунке 4. Здоровый контрольных мышей с нормальной функции эндотелия ответ на ацетилхолин, расслабляя. Мыши с эндотелиальной дисфункцией (гиперхолестеринемией мышей) показывают снижение релаксации в связи с сокращением производства NO на тот же раздражитель.
Инжиррисунке 1. Принцип обнаружения нитритов и нитратов ENO-20 и пример хроматограммы. (Вверху) Схема ENO-20 методом обнаружения нитритов и нитратов. (Внизу) Стандартный chromotogram 10 пмоль нитрит и нитрат вводили в ENO-20 (100 мкл 100 нМ решения нитриты и нитраты). Чувствительность 1 нМ для каждого аниона с 100 мкл инъекции. Никакого вмешательства с белком или цветных видов.
Рисунок 2. CLD экспериментальной установки с использованием как окислительный denitrosation феррицианидом и восстановительной denitrosation использованием йодида / йода с анализа газовой фазы обнаружения очищены азотной газа азота.
Рисунок 3. (Группа А) Хемилюминесценция обнаружения нитрит, RSNO, RNNO в восстановительной анализа denitrosation по образцу инкубации с группой конкретных химикодр. реагентов. Вычитание площади пика позволяют выявлять нитритов и RSNOs. (Группа B) Хемилюминесцентные обнаружения нитрозильных видов гема использованием окислительного решение denitrosation феррицианида. Этот способ можно использовать для NO-гем продуктов без перекрестной реактивности с RSNOs (GSNO или SNO-альбумин), или RNNO (NO-пирролидина и N-нитрозо-альбумин).
Рисунок 4. Ex естественных ванночку на изолированных кольца аорты представляет собой прямую меру эндотелиальной NO производства, которые могут быть связаны с биохимическими биомаркеры обнаружен с помощью ВЭЖХ и СТО. Эта цифра показывает, уменьшить отдых у мышей с эндотелиальной дисфункцией вследствие снижения NO производства.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Методы, описанные здесь, для количественной оценки соответствующих метаболитов NO в различных биологических отделений позволит отпечатков пальцев НЕТ биологии в здоровье и болезни, которые могут быть связаны с функциональными измерения NO в эндотелии. Эти методы требуют простого приготовления образцов с потенциалом для адаптации к высокой пропускной способности. Относительные количества этих молекул может помочь понять, производство NO и его метаболической судьбы в ряде экспериментальных моделей заболеваний и даже серий...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Гонконге Цзянь, к.т.н. и Дипа Parathasarthy, MPH, BDS за техническую помощь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| N-этилмалеимид | Thermo Scientific | 23030 | |
| ЭДТА | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Калий феррицианида | Fluka | 60299 | |
| ВЭЖХ | Eicom Corp | ENO-20 | |
| Автоматический пробоотборник | Олкотт | ||
| DMT миографа | AD инструменты | ||
| PowerLab | AD инструменты | ||
| Хемилюминесцентные | EcoPhysics | CLD 88Y | |
| Центрифугировать | Эппендорф | 5415D | |
| Ацетилхолин | Sigma-Aldrich | A6625 | |
| R-(-) Фенилэфрин | Sigma-Aldrich | P6126 |
Ссылки
- Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
- Ignarro, L. J. Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide. Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).
- Feelisch, M. Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo. FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).
- Wang, X. Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment. J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).
- Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).
- Bryan, N. S. Bound NO in human red blood cells: fact or artifact. Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).
- Feelisch, M. Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems. J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E. NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics. Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
