Mechanosensory волосковых клеток рецепторных клеток внутреннего уха. Наиболее характерны В пробирке Модель системы зрелые клетки млекопитающих волосы использует орган культур Мешочки из взрослых мышей. Мы представляем вскрытии взрослого маточки мыши, и мы демонстрируем аденовирус-опосредованной инфекции опорных клеток в культуре Мешочки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Препарирование взрослых маточки мыши и аденовирус-опосредованный опорно-клетки инфекции
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Потеря слуха и равновесия нарушения часто бывают вызваны смертью mechanosensory волосковых клеток, которые являются рецепторных клеток внутреннего уха. Поскольку не существует клеточная линия, удовлетворительно представляет клетках млекопитающих волосы, исследование волосковых клеток основывается на первичных культурах органа. Наиболее характерны в пробирке модель системы зрелые клетки млекопитающих волосы использует орган культур Мешочки из взрослых мышей (рис. 1) 1-6. Мешочке находится вестибулярный орган и волосковых клеток утрикулюса схожи по структуре и функции волосковых клеток слухового органа, органа Корти. Маточки взрослой мыши Препарат представляет собой зрелый сенсорного эпителия для изучения молекулярных сигналов, которые регулируют выживание, гомеостаз, и смерти этих клеток.
Млекопитающих кохлеарные волосковые клетки терминально дифференцированные и не восстанавливаются в случае их утраты. В не-маммалийских позвоночными, слуховой и вестибулярной гибели клеток волос сопровождается надежной регенерации, восстанавливает слуха и равновесия функций 7, 8. Регенерации волосковых клеток опосредуется глии, как поддерживающие клетки, которые контактируют с базальной поверхности волосковых клеток чувствительного эпителия 9, 10. Поддержка клетки также являются важными посредниками волос выживания и гибели клеток 11. Недавно мы разработали методику инфекции опорных клеток в культуре Мешочки использованием аденовируса. Использование аденовируса типа 5 (dE1/E3) для доставки трансгена содержащие GFP под контролем промотора CMV, мы обнаружили, что аденовирус конкретно и эффективно заражает опорных клеток. Поддержка эффективности ячейки инфекции составляет примерно 25-50%, а волосковые клетки не заражены (рис. 2). Важно отметить, что мы обнаружили, что аденовирусная инфекция опорных клеток не приводит к токсичности для волосковых клеток или поддерживающие клетки, а клеток в Ad-GFP инфected Мешочки эквивалентны тем, кто в неинфицированных Мешочки (рис. 3). Таким образом, аденовирус-опосредованной экспрессии генов в клетках поддержки культурных Мешочки предоставляет мощный инструмент для изучения роли опорных клеток в качестве посредников волос выживаемость клеток, смерть и возрождение.
Протокол
1. Вскрытие мешочке и культуры
- Эвтаназии взрослых (4-недельного возраста и старше) мыши, используя утвержденного протокола и обезглавить.
- Надрез наружный слуховой проход по обеим сторонам головы и подтягивает кожу вперед, к носу. Пополам голову задом наперед и удалять мозга с обеих сторон, чтобы выявить костный лабиринт.
- Обрежьте черепа от костной улитки и передает костного лабиринта (в том числе буллы) на капот культуры тканей оснащен рассечения микроскопа (примечание: аденовирус работа должна быть выполнена в класс II бокса биологической безопасности).
- В капот, передавать друг улитки для 35мм блюдо культуры ткани со стерильным рассечения СМИ (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (рис. 1а).
- Если слухового барабана до сих пор без изменений (можно удалить буллы в валовом рассечение, вставив ваш эскиз между буллы и вершиныулитки), используют два пинцета (одно № 3 и один # 5) нарушать буллы (рис. 1б).
- Определение ориентиров костной подготовки улитки: вершина, основание, косточки, овальные и круглые окна, VIII-нервного корешка, полукружных каналов (рис. 1 C, D).
- Поместите внутреннего уха в блюдо с медиальной стороной вверх так, что овальные и круглые окна и вершины находятся на дно тарелки и VIII-нервного корешка вверх. Держите подготовке помощью щипцов № 3 в области полукружных каналов (рис. 1D).
- С помощью скальпеля оснащен № 11 лезвием, срезают верхушки улитки только апикальной в нервных корешков (рис. 1D).
- Включите подготовку так, чтобы разрез часть вверх. Использование переднего полукружного канала в качестве ручки для стабилизации препарата (рис. 1Е).
- Использование # 5 щипцы, удалите улитки на Modiolus внизк основанию. В точке, где крюк области улитки поворачивает вниз, используйте тонкий зонд (половину сломанной № 55 щипцов), чтобы снять последние костные шельфа костной спиральной пластинки (рис. 1F), показывая мешочек. Просто под мешочек является стремени подножку, которая является важной вехой. Маточки непосредственно примыкает к стремени подножку (рис. 1С), и он окружен кости. С помощью зонда чип от костей достаточно, чтобы выявить около 1/3 мешочке. Осторожно снимите маточки использованием щипцов № 55 (рис. 1 полугодие). Эта процедура, как правило, приводит к удалению пигментного эпителия крыши маточки извлекается из костного подготовки. Однако, если маточки удаляется с крыши эпителия нетронутыми, крышу можно удалить с помощью щипцов № 55.
- Мешочки для аденовирусной инфекции (или живые эксперименты изображения) должны быть удалены в течение отоконии вскрытия (до заражения).В этом случае, используйте Луер-Лок шприц, наполненный рассечения СМИ и оснащен малого диаметра иглы (обычно 26-28 калибра). Держите мешочке на краю использованием щипцов № 55 (рис. 1I). Принесите иглы близко к мешочке с скос иглы вниз. Использование потока рассечения СМИ сдуть отолитов (рис. 1J). Кроме того, отолитов можно удалить с помощью щетки с их использованием ресниц инструмент (Ted Pella, Inc # 113). Мешочки, что не собирается проходить аденовирусной инфекции, как правило, культурный свободно плавающих в 24-луночных культуре ткани с отолитов без изменений (см. ниже после исправления отоконии удаление, которое легче).
- После того как все Мешочки были расчленены, изменить рассечения СМИ стерильных питательных сред: DMEM F12 (Gibco # 11320) с добавлением 5% ЭТС и 50 ед / мл пенициллина G (Sigma).
- Мешочки культивировали при 37 ° С и 5% CO 2. Если культур должны быть maintaINED более чем на 48 часов, половина из культуральной среды следует менять каждые два дня. Культуры могут быть сохранены в течение недели или дольше.
2. Аденовирусная инфекция опорных клеток
Важно: Работа с аденовирус требует Уровень биологической безопасности 2 (BSL2) процедур и сертификации. Проверьте с вашим сотрудником Институциональные биобезопасности для ориентации и подготовки по BSL2 процедур.
- Проанализируйте Мешочки, как указано выше в средствах массовой информации вскрытия (без сыворотки). Удалить отоконии как указано выше.
- Когда все будет готово для заражения, передачи 1 мешочке (волосковые клетки вверх) в каждую лунку Nunc мини-лоток (Fisher # 12-565-68), содержащую 15 мкл бессывороточной DMEM F12 (это важно, потому что сыворотка может инактивировать вирус) . Эта передача легче с 1,5 мм microcurette (# 10082-15 из изобразительных средств наук).
- Наши Ad-GFP является серотипа 5 вирусных E1 и E3 генов удалены и человеческого промотора CMV вождения transgен (GFP). Этот вирус был получен из векторного BioLabs (Филадельфия, штат Пенсильвания vectorbiolabs.com ). Со вирусов предоставляются на титры 1,0-4,0 × 10 10 БОЕ / мл. Добавить 0.5-2 мкл акции вируса в каждую лунку содержащие мешочке (рис. 1 л). Фактическая сумма использована варьируется в зависимости от титра вируса и акции. Мы обычно заражает каждый мешочке с 1,0-4,0 × 10 7 ОРП.
- Культура Мешочки в вирус-содержащих средств массовой информации при 37 ° C / 5% CO 2 в течение 2 часов. Через 2 часа, передает Мешочки к 24-и культуре тканей пластину, содержащую питательные среды с сывороткой. Культура Мешочки ночи при 37 ° C / 5% CO 2.
- Мешочки можно использовать на следующий день для экспериментов живых изображений, или они могут быть установлены для волос иммунохимии клетки (см. ниже). Вирусный экспрессии трансгена, со временем увеличивается, так что если экспрессии трансгена является низкий в 24 часов после заражения он можетполезно для культуры клеток еще на 24 часа в сыворотке средах. Если вы видите, токсичность волосковых клеток, снижают количество вируса использовали.
3. Фиксация мешочке, отолитов удаление и иммунохимии
- В конце периода культивирования, исправить Мешочки в 4% параформальдегид как для 3-х часов при комнатной температуре (на качающейся платформе) или на ночь при 4 ° C. Мешочки Wash (в 3 раза, 15 мин каждая) в 0,1 М (1X) фосфат Соренсена буфера рН 7,4. Эти шаги выполняются в 24-луночного планшета для культуры ткани.
- Отоконии удаление Примечание: отоконии должны быть удалены до аденовирусная инфекция (см. шаг 1,11 выше). Тем не менее, Мешочки, которые не заражены может быть культурным и фиксируется с отолитов еще целы. В этом случае, выполните действия, описанные здесь, чтобы удалить отоконии после фиксации. Проверьте Мешочки для любого оставшегося пигментного эпителия крыши. Осторожно удалите оставшиеся эпителия крыши с помощью двух # 55 фorceps. Чтобы удалить отоконии заменить фосфатный буфер Соренсена с 750-1000 мкл Cal-Ex decalcifier (Fisher # CS510-1D). Оставьте Cal-Ex на Мешочки в течение 1 минуты и 40 секунд (не более 2 минут). Замените Cal-Ex с 0,1 М фосфатный буфер Соренсена и мытья (в 5 раз, 5 минут каждый).
- Инкубируйте Мешочки в боргидрид натрия (Sigma # 452882, 1% в деионизированной воде) в течение 10 минут. Вымойте Мешочки в 0,1 М фосфатный буфер Соренсена (в 5 раз, 5 мин каждая).
- Место Мешочки в блокирующем растворе (PBS + 2% бычьего сывороточного альбумина + 0,8% нормальной козьей сывороткой + 0,4% Тритон Х-100) в течение 3 часов при комнатной температуре на качающейся платформе.
- Добавить первичных антител и инкубировать в течение ночи при 4 ° C. Anti-миозина 7а (или Proteus Biosciences # 25-6790 и # MYO7A 138-1 от развития исследований Hybridoma банка) в 1:100 в блокировании решения этикетки всех волосковых клеток. Для отдельно маркировать striolar и не striolar волосковых клеток, мы использовали двойные этикетки protocoл с моноклональными анти-кальмодулин (Sigma # C 3545, 1:150) и поликлональных анти-кальбиндин (Chemicon # AB1778, Темекула, Калифорния, США, 1:200). Вторичные антитела (обычно Alexa Fluor сопряженных с вторичными антителами Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) разводят 1:500 в блокирующем растворе и выдерживают 4 часа в темном месте при комнатной температуре на качающейся платформе.
- Горе Мешочки на стеклах использование Fluoromount-G (Южный Biotech, Бирмингем, Алабама, США).
4. Представитель Результаты
Мешочки культивировали, используя этот метод сохраняет полный дополнения и волосковые клетки и опорные клетки (рис. 2). Волосы здоровые клетки в культурах показывают, круглых профилей ядерных окружены тонкой цитоплазматической регионов, миозина 7а-положительным (рис. 2, вверху). Поддержка клеток (меченные анти-Sox2) меньше по размеру и более плотно, чем волосковые клетки (рис. 2, внизу). Адеnovirus заражает 25-50% опорных клеток в мешочке, а не волосы зараженных клеток (рис. 2, Ad-GFP панелей). Следует отметить, что оптимальный рабочий титр каждой аденовирус должен быть определен эмпирически, так как смерть волосковых клеток можно, если вирусный титр слишком высока. Кроме того, регионы механических повреждений (вызванных во время вскрытия) будет занимать большое количество вируса. Эти регионы механических повреждений легко различимы по непрерывной линии клеток с очень высоким уровнем GFP выражения и пропавших без вести волосковых клеток. Это в отличие от рассеянного выражения GFP в опорных клеток неповрежденной культуры (рис. 2).
Рисунок 1. Вскрытие мешочке. . Слухового барабана (AB) B:. Булла разрывается с помощью двух крепких щипцы C: Бони улитки (RW = круглое окно, S =. стремянный артерии, C = улитки, ST = стремени) Д: лезвие скальпеля (SB) используется, чтобы отрезать верхушки улитки апикальной к VIII в черепно-мозговых нервов (8-е N) = ASC передних полукружных каналов E..: Препарат прочно удерживается помощью щипцов № 3 с одной вилкой вставляется в переднюю полукружных каналов (ASC), а другой на внешний костей (стрелки). Перепончатый лабиринт удаляется с помощью пинцета F:. С перепончатый лабиринт удален, базальный оборот костной спиральной пластинки видна рядом с крюком региона. Штраф зонд вводится под этим костной полки снять полку и удалить его (стрелка) G:. После удаления мешочек, маточки (U) видно, непосредственно примыкающих к стремени подножку (SF) H:. Мешочке (U ) удаляется с помощью пинцета # 55 (стрелка) SF = стремени подножку я.. мешочке с отолитов (O) частично удаленыг сенсорного эпителия (SE) видимые под J:. отолитов (O) удаляются из мешочке с помощью потока средств массовой информации выступил шприц оснащен 26-иглы. Тень стрелка (S) видна в нижней части изображения K. Мешочке с отолитов удалены и сенсорного эпителия (SE) видимый L:. Аденовирусной инфекции: каждый мешочке (U) помещается в отдельный колодец мини лоток. Поддержка клеток, инфицированных аденовирусом с помощью пипетки вируса в колодец (P = Внесите совет).
Рисунок 2. Аденовирус-опосредованной инфекции опорных клеток. Мешочки были инфицированы аденовирусом вождения выражение зеленого флуоресцентного белка (Ad-GFP). Показаны конфокальных изображений слоя волоса клетки и поддерживают клеточный слой в том же районе одного мешочке. Волосы клетки помечены антитела против 7а миозина(Пурпурный). Поддержка клетки помечены антитела против Sox2 (красный). Схема показывает структуру маточки сенсорного эпителия и расположение волосковых клеток (HC) и опорных клеток (СК). Расположение конфокальной (оптический) разделы отображаются в верхнем (U) и нижнего (L) панели обозначены пунктирными линиями на схеме. Верхняя панель: В конфокальной снимков, сделанных на уровне ядра клетки волос, Ad-GFP сигнал появляется в промежутках между волосковых клеток и не совпадать с маркером волосы 7а миозина клетки. Нижняя панель: В конфокальной разделов на уровне поддержки клеточных ядер, Ad-GFP сигнал локализуется с опорной клетки маркером Sox-2. Ad-GFP инфекция приводит к GFP выражение в поддержке только клетки, а не волосковые клетки инфицированы.
Рисунок 3. Аденовирусная инфекция не приводит к гибели волосковых клеток и опорных клеток. Utricles были заражены Ad-GFP в 4 × 10 8 БОЕ / мл. Мешочки были помечены антитела против миозина 7а (маркер волосковых клеток) и Sox2 (поддерживающие клетки маркер). Клетки волос и поддержка количество клеток было одинаковым для контроля Мешочки и Ad-инфицированных Мешочки GFP.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сенсорные волосковые клетки чувствительны к смерти от различных стрессов, включая старение, шум травмы, и воздействие ототоксичных наркотиков, в том числе аминогликозидов и противоопухолевое средство цисплатин. У млекопитающих волосы гибель клеток приводит к постоянной потере слуха и / или нарушение равновесия. В системах пробирке модели важными инструментами для исследований, направленных на определение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе смерти волосковых клеток, а также те, которые...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана Отделом Внутренние исследования в Национальном институте глухоты и других расстройств общения. Дополнительная поддержка была оказана NIDCD 5R01 DC007613.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагенты О компании Номер по каталогу | |||
| Среды 199 | Gibco / Invitrogen | 12 350 | |
| DMEM/F12 | Gibco / Invitrogen | 11 320 | |
| Fine щипцы (# 55) | Изобразительных средств наук | 11255-20 | |
| Fine щипцы (# 5) | Изобразительных средств наук | 11252-30 | |
| Щипцы (# 3) | Изобразительных средств наук | 11231-30 | |
| Пенициллин G | Sigma | P3032 | |
| Фетальной телячьей сыворотки | Invitrogen | 10082-139 | |
| Nunc мини-поднос | Fisher | 12-565-68 | |
| Аденовирус-GFP | Векторные Biolabs | 1060 * | |
| Cal-Ex decalcifier | Fisher | CS510-1D | |
| Боргидрид натрия | Sigma | 452882 | |
| Защита от миозина 7а (поликлональных) | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Защита от миозина 7а (моноклональные) | Исследования развития Hybridoma банка | MYO7A 138-1 | |
| Защита от Кальмодулин | Sigma | С 3545 | |
| Защита от кальбиндин | Chemicon | AB1778 | |
| Fluoromount G | Южный биотехнологии Associates | 0100-01 |
Таблица 1. Реагенты и инструменты, используемые в мешочке культуры и аденовирусной инфекции.
* Примечание: Ad-GFP обычно обеспечивается векторные Biolabs на фондовой титр 1x10 10 БОЕ / мл. Мы просили пользовательского усиления, чтобы обеспечить запас вируса в титре 1,2 × 10 11 БОЕ / мл.
Ссылки
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29, 3843-3851 (2009).
- Ou, H. C. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).
- Chiu, L. L. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).
- Sugahara, K., Rubel, E. W., Cunningham, L. L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. , 221-221 (2006).
- Matsui, J. I., Cotanche, D. A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12, 418-4125 (2004).
- Ryals, B. M., Rubel, E. W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240, 1774-176 (1988).
- Corwin, J. T., Cotanche, D. A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240, 1772-174 (1988).
- Shang, J. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 203-222 (2010).
- Stone, J. S., Cotanche, D. A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51, 6-7 (2007).
- Lahne, M., Gale, J. E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28, 4918-4928 (2008).
- Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).
- Matsui, J. I. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).
- Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).
- Nakagawa, T. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176, 1-2 (2003).
- Forge, A., Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139, 1-2 (2000).
- Liu, W. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
- Taleb, M. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).
- Francis, S. P. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease. , (2011).
- Wang, J. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).
- Bird, J. E. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).
- Sato, E. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.
null
