Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

Краткое содержание

Метод анализа распределения костного мозга гемопоэтических предшественников в проточной цитометрии, а также эффективно изолировать высокой степени очистки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) описывается. Изоляция процедуры по существу на основе магнитного обогащения с-Kit + клеток и сортировку, чтобы очистить ГСК на клеточных и молекулярных исследований.

Аннотация

Костный мозг является основным местом, где в организме взрослого индивидуума располагаются и дифференцируются ГСК и более зрелые предшественники клеточных линий крови. ГСК представляют собой крайне малочисленную популяцию плюрипотентных клеток, способных на протяжении всей жизни обеспечивать генерацию всех линий клеток крови.¹Молекулярный анализ гомеостаза ГСК в костном мозге имеет важное значение для гематопоэза, онкологии и регенеративной медицины. Мы описываем протокол маркировки флуоресцентными антителами и процедуру электронного гейтирования при проточной цитометрии для оценки подмножеств гемопоэтических предшественников и распределения ГСК у отдельных мышей (Рис. 1). Кроме того, мы описываем метод глубокого обогащения пула суспензий клеток костного мозга гемопоэтическими прогениторами, а также долгоживущими (LT) и короткоживущими (ST) реконструирующими ГСК посредством магнитного обогащения клеток, экспрессирующих c-Kit. Полученную клеточную популяцию можно использовать для сортировки отдельных субпопуляций для проведения исследований in vitro и in vivo функциональные исследования (Рис. 2).

Как трабекулярные остеобласты^2,3, так и синусоидальный эндотелий⁴ формируют функциональные ниши, поддерживающие ГСК в костном мозге. Ряд механизмов в остеобластической нише, включая подмножество N-cadherin⁺ остеобластов³ и взаимодействие рецепторной тирозинкиназы Tie2, экспрессируемой в ГСК, с её лигандом ангиопоэтином-1⁵, совместно определяют состояние покоя ГСК. «Гибернация» в костном мозге имеет решающее значение для защиты ГСК от репликации и последующего истощения при чрезмерной циклической активности⁶. Экзогенные стимулы, воздействующие на клетки врожденной иммунной системы, такие как лиганды Толл-подобных рецепторов⁷ и интерферон-α⁶, также могут индуцировать пролиферацию и дифференцировку ГСК в коммитированные предшественники определенных линий. Недавно была описана популяция спящих ГСК мышей в составе популяции lin^- c-Kit⁺ Sca-1⁺ CD150⁺ CD48^- CD34^-8. Сортировка клеток по экспрессии CD34 из обогащенной гемопоэтическими предшественниками клеточной суспензии, как описано здесь, позволяет изолировать как покоящиеся самообновляющиеся LT-HSC, так и ST-HSC⁹. Аналогичная процедура, основанная на делеции lineage-положительных клеток и сортировке LT-HSC с помощью антител к CD48 и Flk2, была описана ранее¹⁰. В данном отчете мы приводим протокол фенотипической характеристики и анализа клеточного цикла гемопоэтических предшественников ex vivo, который может быть полезен для мониторинга гемопоэза при различных физиологических и патологических состояниях. Кроме того, мы описываем процедуру FACS-сортировки ГСК, которая может быть использована для определения факторов и механизмов, регулирующих их самообновление, экспансию и дифференцировку в анализах по клеточной биологии и передаче сигналов, а также для трансплантации.

Протокол

1. Подготовка суспензии клеток из костного мозга

1. Усыпить мышью и поместить животное в кастрюле из нержавеющей и спрей 70% этанола на его животе и спине. Соберите бедра и голени от задних ног, и позвоночник.
2. Аккуратно удалите все остатки мягких тканей позвоночника с острыми ножницами кончик и с ног костей с марлей. Магазин кости в 50 мл трубку Сокол с 30 мл RPMI среде, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), дополненная 50 мкМ β-меркаптоэтанол, 100 мкМ MEM без незаменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия MEM, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл стрептомицина и 100 ЕД / мл пенициллина.
3. Покройте дно предварительно стерилизованный раствор стерильной фильтров.
4. Передача кости в ступке и покрыть их слоем фильтры для того, чтобы собрать поверхности трения.
5. Подготовьте 50 мл Сокол трубку с фильтром Сокол.
6. Разбейте костис помощью пестика до получения однородной суспензии клеток.
7. Передача суспензии в трубке.
8. Добавить в раствор 5 мл свежей RPMI полной среды для мытья и уборки оставшихся клеток.
9. Повторите два последних пункта до усредненного костей появляются ясно.
10. Передача и фильтрации в новую пробирку клеточной суспензии для того, чтобы устранить оставшиеся обломки ткани.
11. Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок клеток.

2. Фенотипический анализ

1. Ресуспендируйте и промыть клетки отдельных мышей в 15 мл PBS и 2% ЭТС.
2. Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не нарушить гранул.
3. Приостановить гранул в 5 мл PBS и 2% ЭТС и количество клеток.
4. Передача 1 × 10 ⁶ клеток / лунку в 96 лунок круглым дномпластину.
5. Центрифуга пластине при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин.
6. Подготовьте смесь моноклональных антител направлено против следующих маркеров поверхности. Развести их, как указано в PBS и 2% FBS для окрашивания клеток.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 конъюгированных с PE-Cy5 1:200
   • с-Kit сопряженных с APC 1:100
   • СЦА1 конъюгированных с биотином 1:50
   • CD34, конъюгированных с FITC 1:50
   • FcγR конъюгированных с PE 1:100
   • IL-7R сопряженных с PE-Cy7 1:100
7. Удалите супернатант и внести по 50 мкл смеси моноклональных антител в каждую лунку. Распадаются на отдельные клетки с помощью пипетки.
8. Инкубируйте клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
9. Промойте клетки в два раза с 150 мкл PBS и 2% ЭТС.
10. Центрифуга пластине при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант обращения пластины.
11. Развести стрептавидином в PBS и 2% FBS, как показано на пятно клеток.
    • Стрептавидин сопряжениезакрытого для APC-Cy7 1:300
12. Добавить 50 мкл раствора в каждую лунку. Диссоциируют на суспензии отдельных клеток с помощью пипетки.
13. Инкубируйте клетки в течение 10 мин в темноте при 4 ° C.
14. Промойте клетки в два раза с 150 мкл PBS и 2% ЭТС.
15. Центрифуга пластине при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант.
16. Ресуспендируйте клеток в 100 мкл PBS и 2% ЭТС.
17. Получить образцы FACS.

3. Магнитное обогащение с-Kit ⁺ клетки

1. Подготовить буфер раствор, содержащий PBS, рН 7,2, 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 2 мМ ЭДТА.
2. Ресуспендируйте осадок клеток костного кабачки, полученные, по меньшей мере 10 мышей в 1 мл раствора, содержащего буфер с-Kit МКА, конъюгированных с APC разбавляют 1:50.
3. Инкубируйте клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
4. Мыть два раза клеток с 40 мл буферного раствора.
5. Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите тОн супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не нарушить гранул.
6. Ресуспендируют осадок клеток и добавить 50 мкл против APC микрошарики для каждого эвтаназии мыши непосредственно в гранулы.
7. Хорошо перемешайте и выдержите в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
8. Вымойте клеток путем добавления 40 мл буферного раствора и центрифуги при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант полностью.
9. Ресуспендируют осадок клеток в нескольких из 4 мл буферного раствора каждые три мыши эвтаназии.
10. Место MACS LS столбцов в магнитное поле подходящей сепаратор MACS. Используйте 1 раз в три колонки мышей эвтаназии.
11. Подготовить столбцов путем промывания 4 мл буферного раствора.
12. Применение клеточной суспензии на столбцы.
13. Соберите немеченого клеток, которые проходят через колонки и стирать с 4 мл буферного раствора. Выполните промывки путем добавления 4 мл буферного раствора в три раза. Добавить новый буфер, когда колонна водохранилища опустели.
14. Удалить столбцы из сепаратора и НОАКэлектронной каждый один на 15 мл труб сокола.
15. Внесите 4 мл буферного раствора на каждую колонку. Немедленно промыть магнитно меченых клеток, нажимая на поршень в колонну.
16. Центрифуга труб при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией.
17. Ресуспендируйте каждый шарик с 1 мл буферного раствора и группа гранул в одной трубки 15 мл сокола.

4. Сортировка гемопоэтических стволовых клеток и Lineage совершенных прародителей

1. Подготовьте смесь моноклональных антител направлено против следующих маркеров поверхности. Развести их, как указано в 500 мкл PBS и 2% FBS для окрашивания клеток.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 конъюгированных с PE-Cy5 1:200
   • с-Kit сопряженных с APC 1:100
   • ССС-1, конъюгированные с биотином 1:50
   • CD34, конъюгированных с FITC 1:50
   • FcγR конъюгированных с PE 1:100
2. Центрифуга трубки от previouсекцией при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией.
3. Добавьте смесь моноклональных антител к осадку. Диссоциируют на суспензии отдельных клеток с помощью пипетки.
4. Инкубируйте клетки в течение 20 минут в темноте при 4 ° C.
5. Мыть два раза клеток с 14 мл ФСБ и 2% ЭТС.
6. Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант.
7. Развести стрептавидин, как указано в 500 мкл PBS и 2% FBS окрасить клетки.
   • Стрептавидин сопряженных с APC-Cy7 1:300
8. Добавить решение к трубе. Диссоциируют на суспензии отдельных клеток с помощью пипетки.
9. Инкубируйте клетки в течение 10 мин в темноте при 4 ° C.
10. Мыть два раза клеток с 14 мл PBS и 2% ЭТС.
11. Центрифуга трубки при 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин и отказаться от супернатант.
12. Ресуспендируйте клеток в 500 мкл PBS и 2% ЭТС.
13. Передача и фильтрации суспензии клеток в новом 5 мл трубку для того, чтобы Элиminate сотовых агрегатов, которые могут повлиять на процедуру сортировки.
14. Добавьте 5 мкл 7-AAD (использовать разбавленный 1:100) к клеточной суспензии для того, чтобы исключить 7-AAD ⁺ мертвых клеток из отсортированных населения.
15. Сортировка клеток с BD FACSAria в соответствии со следующими фенотипами:
    • ЛКС клеток: Лин ^- с-Kit ⁺ SCA-1 ⁺
    • LT-ГСК: ЛКС CD34 ^-
    • ST-ГСК: ЛКС CD34 ⁺
    • ГИП: Лин ^- с-Kit ⁺ ССС-1 ^низкий FcγR ^{высокой} CD34 ⁺
    • Депутаты Европарламента: Лин ^- с-Kit ⁺ ССС-1 ^низкий FcγR ^низкий CD34 ^-
    • CMPS: Лин ^- с-Kit ⁺ ССС-1 ^низкий FcγR ^низкий CD34 ⁺

5. Представитель Результаты

Рисунок 1 показывает и пример процедуры электронного стробирования дляоценка общей лимфоидных предшественников (CLPs), а Лин ^- / с-Kit ^вот / интерлейкин (IL)-7R ⁺ клеток Lin ^- / с-Kit ⁺ / SCA-1 ⁺ (ЛКС) и Лин ^- / с-Kit ⁺ / Sca -1 ^вот (с-Kit ⁺⁾ клетки, из с-Kit ⁺ ворота, общий миелоидных предшественников (CMPS) определены как FcγR ^вот CD34 ⁺ клеток, гранулоцитов / моноцитов предшественников (GMP), а FcγR ^привет CD34 ⁺ клеток и мегакариоцитов / эритроцитов предшественники (Европарламента), а ^вот FcγR CD34 ^- клеток, из ЛКС ворота, LT-HSC и ST-HSC определены как CD34 ^- и CD34 ⁺ клеток соответственно. Эта клетка костного мозга подвески может быть обогащен с-Kit ⁺ клетки с магнитными шариками (рис. 2), LT-HSC и ST-HSC может быть отсортирован по CD34 выражения, а также других предшественников по фенотипу, описанных выше.

ГСК может быть ана проанализированы в живых изображений конфокальной микроскопии, как показано на рисунке 4, где CD34 ^- клеток окрашивали нуклеотидов обязательной составной акрихин ^11, а также ядерных красный (DRAQ5). В ГСК, но не ГМР, акрихин-положительных пузырьки видны в цитоплазме ^12. Кроме того, отсортированных ГСК могут быть использованы в функциональных экспериментах, как показано на рисунке 5, которая показывает рост цитозольного Са ^{2 +} в LT-HSC путем активации рецепторов пуринергическими Р2 при воздействии аденозин-трифосфата (АТФ) и иономицином ^12.

Рисунок 1. Представитель точкой сюжета анализе Лин-БМ клеток. Электронные процедуры стробирования в проточной цитометрии для определения и забить кроветворные предшественники и ГСК из костного суспензии клеток костного мозга окрашивали, как описано в текст протокола.

pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Схема для селективного обогащения с-Kit ⁺ клеток из костного мозга.

Рисунок 3 клеточного цикла анализа электронных закрытого ЛКС CD34 ^-. ГСК у здоровых людей и мышей с IBD окрашивали Ki-67 и антител DAPI. Клетки были установлены и проницаемыми с лизировать / Fix и Пермского буферов последующим окрашиванием с FITC сопряженных Ki-67 и DAPI на 1 мкг / мл. Велоспорт клетки едва ли вообще обнаружить в ЛКС CD34 ^- ГСК отделении здоровых ^12.

Рис. 4 Живи изображений конфокальной микроскопии СУИМ отсортированы CD34 ^- ГСК и ГИП окрашивали нуклеотидов обязательным акрихин соединения и ядерной красный (DRAQ5). Небольшой квадранта показывают акрихин возтельным пузырьки обнаруживаются в цитоплазме ГСК, но не ГМР.

Рисунок 5. Цитозольного Са ^{2 +} высот в отсортированном ГСК загружены Фура-2 и стимулированной АТФ и иономицином. Следы от одной клетки показано на рисунке. Все клетки реагируют на внеклеточные АТФ показывает резкое увеличение цитозольного Са ^{2 +} после добавления АТФ.

Обсуждение

Описанный здесь метод позволяет быстро и точного анализа кроветворения в отдельных мышей (рис. 1). Этот анализ в различных экспериментальных условиях, в том числе мышиных моделях воспаления, аутоиммунные заболевания, иммунодефицит, дегенеративные заболевания, нарушения обмена веществ и рака, позволяет ликвидации последствий патологических состояний на кроветворение. Рисунок 3 показывает анализ активности клеток велоспорту на электронном закрытого ЛКС CD34 ^- клето...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
RPMI 1640	Гибко	42401
MEM NEAA 100X	Гибко	11140
Пируват натрия	Гибко	11360
PenStrep	Гибко	15070
PBS	Гибко	20012
FBS	Гибко	16000
Сотовые фильтра 40 мкм	BD Сокол	352340
7-AAD Окрашивание решение	BD Pharmingen	559925
Лизировать / Fix буфер	BD Pharmingen	558049
Пермь буфер III	BD Pharmingen	558050
Ki-67	BD Pharmingen	556026
DAPI	Invitrogen	D21490
CD4 (GK1.5)	eBioscience	150041
CD8 (53-6.7)	eBioscience	150081
CD3 (145-2C11)	eBioscience	150031
CD45R (RA3-6B2)	eBioscience	150452
CD19 (6D5)	eBioscience	150193
Gr1 (RB6-8C5)	eBioscience	155931
Tre119 (ТЕР-119)	eBioscience	155921
НК-1.1 (PK136)	eBioscience	455941
с-Kit (2B8)	eBioscience	171171
ССС-1 (D7)	eBiosciENCE	135981
CD34 (RAM34)	eBioscience	110341
FcγR (2.4G2)	eBioscience	553145
Anti-APC микрошарики	Miltenyi Biotec	130-090-855
LS Столбцы	Miltenyi Biotec	130-042-401