Выделение молочной эпителиальные клетки трехмерных смешанных клеток сфероид Co-культуры

Краткое содержание

Простой метод описан для анализа последствий ткани фибробласты об ассоциированном эпителиальных клеток. Сочетание этого метода и трехмерной тканевой культуре могут облегчить анализ клеток после изоляции от 3D. Методика распространяется на клетки различных злокачественных потенциал, позволяющий систематическое изучение последствий опухолеассоциированным стромы на опухолевые клетки.

Аннотация

Несмотря на огромные усилия, направленные на идентификацию сигнальных путей и молекул, участвующих в нормальном и злокачественном поведении клеток^1-2, большая часть этой работы была проведена с использованием классических моделей двухмерного культивирования клеток, которые позволяют легко манипулировать клетками. Стало очевидно, что на внутриклеточные сигнальные пути влияют внеклеточные силы, включая размерность и поверхностное натяжение клеток^3-4. Было предпринято множество подходов для разработки трехмерных моделей, которые более точно представляют архитектуру биологической ткани³. Хотя эти модели учитывают многомерность и архитектурные напряжения, изучение последующего воздействия на клетки затруднено по сравнению с двухмерным культивированием тканей из-за ограничений самих моделей и сложности извлечения клеток для последующего анализа.

Все больше признается важная роль микроокружения опухолей в туморогенезе и поведении опухоли⁴. Строма опухоли состоит из множества типов клеток и внеклеточных молекул. В процессе развития опухоли между опухолевыми и стромальными клетками происходят двусторонние сигнальные взаимодействия⁵. Несмотря на то, что некоторые факторы, участвующие в коэволюции опухоли и стромы, были определены, все еще существует необходимость в разработке простых методов для систематической идентификации и изучения всего спектра этих сигналов⁶. Фибробласты являются наиболее многочисленным типом клеток в нормальных или ассоциированных с опухолью стромальных тканях и способствуют отложению и поддержанию базальной мембраны и паракринных факторов роста⁷.

Многие исследовательские группы использовали системы трехмерного культивирования для изучения роли фибробластов в различных клеточных функциях, включая ответ опухоли на терапию, привлечение иммунных клеток, передачу сигнальных молекул, пролиферацию, апоптоз, ангиогенез и инвазию.^8-15Мы оптимизировали простой метод оценки влияния фибробластов молочной железы на эпителиальные клетки молочной железы, используя коммерчески доступную модель внеклеточного матрикса для создания трехмерных культур смешанных популяций клеток (сокультур).^16-22При продолжении совместного культивирования клетки образуют сфероиды, при этом фибробласты концентрируются внутри, а эпителиальные клетки располагаются преимущественно на периферии сфероидов, формируя многоклеточные выросты, проникающие в матрикс. Изменения инвазивности эпителиальных клеток, вызванные манипуляциями с фибробластами, можно легко количественно оценить по изменению количества и длины эпителиальных выростов.²³Кроме того, нами был разработан метод выделения эпителиальных клеток из трехмерной совместной культуры, который облегчает анализ влияния воздействия фибробластов на поведение эпителия. Мы обнаружили, что эффекты совместного культивирования сохраняются в течение нескольких недель после выделения эпителиальных клеток, что предоставляет достаточно времени для проведения многочисленных анализов. Данный метод применим к клеткам с различным злокачественным потенциалом и не требует специализированного оборудования. Эта методика позволяет проводить быструю оценку клеточных моделей in vitro при различных условиях, при этом соответствующие результаты можно сравнить с in vivo модели тканей животных, а также образцы тканей человека.

Протокол

1. Создание трехмерных сотрудничества культур

1. За день до создания совместного культур, удалить Матригель из морозильной камеры и оттепель на льду в 4 ° C ночь в холодильник.
2. В день эксперимента, подготовить среду для совместной культуры, что соответствует средним для эпителиальных клеток, которые будут использоваться (HMEC среды в данном примере: DME/F12 среде с 10% бычьей сыворотки теленка, 5 мкг / мл инсулина , 1 мкг / мл гидрокортизона, 1 нг / мл ЭФР). Держите среды на лед по крайней мере, за 1 час до смешения с Матригель.
3. Чтобы разбавить талой Матригель, определения общего требуемого количества Матригель: средний (300 мкл на лунку 24-луночных планшетов) и добавить 1/2, что объем ледяной HMEC среднего стерильную пробирку на льду. Затем добавьте же половина общего объема талых Матригель к трубе для достижения разведение 1:1. Держите трубку на льду.
4. Место 50 мкл Матригель: средние смеси в середине и в специально отведенных для скважины 24-луночного планшета иинкубировать 10 мин при 37 ° C инкубатор с увлажненного воздуха и 5% CO _2.
5. Добавить еще 450 мкл Матригель: средняя смесь в лунки и инкубировать в течение еще 60 минут.
6. Во время инкубации, готовит 1:1 подвески фибробластов (здесь А-трет-увековечены сокращение молочной Фибробласты выражения GFP) и эпителиальные клетки (здесь А-трет-увековечены молочной железы человека линии эпителиальных клеток, экспрессирующих RFP) в концентрации 0,5 · 10 ⁵ клеток каждая в 0,5 мл HMEC среды.
7. После 60-минутной инкубации, мягко отказаться от клеточной суспензии на верхнюю часть затвердевшего геля, и вернуть культуры в инкубатор.
8. Не беспокоить культур в течение 2 дней. После этого среда может менять каждые 2-3 дней, очень мягко аспирационных среду со стороны хорошо и аккуратно заменить свежими HMEC среды.
9. Мониторинг формирования сфероида ежедневно под микроскопом. Культура, как правило, зрелого через 10-14 дней. Изображение, каксоответствующие помощью света или люминесцентной микроскопии. Сфероид размер и длину проекции могут быть измерены при световой микроскопии.

2. Выделение ячейки из сфероид сотрудничества культур

1. Очень осторожно, пипетка культура вверх и вниз 10 раз, используя стерильный 2 мл стеклянную пипетку. Кроме того, отрезать кончик 1000 мкл пластиковой пипетки с помощью ножниц стерилизовать автоклавированием или погружения в 70% этанолом, чтобы пипетировать культуры. Передача культуры либо с помощью пипетки или стеклянной разрезе пластиковый наконечник пипетки в стерильную центрифужную пробирку 15 мл, а центрифуги в течение 5 мин со скоростью 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Сотовые сфероидов будет осадок на дне.
2. Используйте стерильные пипетки Пастера, чтобы мягко удалить нарушенный Матригель сверху центрифугировали трубку.
3. Добавить 1 мл HMEC среднего гранулированный сфероидов, пипетка вверх и вниз по 2-3 раза с 2 мл стерильной стеклянной пипетки, и передавать культуру и в 24-апластины тканевой культуры.
4. Позвольте сфероидов приложить к блюду, по крайней мере за 48 часов до изменения среды. Со временем клетки оставят сфероидальной структуры и расти, как монослоев.
5. Прохождение культурах клеток, когда клетки достигают 50% слияния. Первое расширение культуры 35 мм блюдо (примерно 2-4 дней), а затем до 100 мм блюдо (примерно 3-5 дней). Непосредственно перед началом каждого прохода шаг, использовать стерильные пипетки Пастера, чтобы вручную удалить столько остаточного "призрак сфероидов", как это возможно.
6. Анализ клеток методом проточной цитометрии для населения чистоты с помощью соответствующих маркеров клеточной поверхности и дальнейшему отдельных различных клеточных популяций с помощью флуоресцентной сортировки клеток, если это необходимо. Изолированных клеток готовы для дальнейшего анализа, как хотелось бы.

3. Представитель Результаты

В трехмерном сфероида со-культур, фибробластов инженерных Tiam1 глушителей вызывать увеличился вторжения в маматрице на эпителиальных клетках молочной (рис. 1, сравнить D, E, F, А, B, C). Фибробласты с инженерии по-выражение Tiam1 вызывать снизилась матрицы вторжения клетки рака молочной железы линии SUM159 (рис. 1, сравнить J, K, L на G, H, I).

После совместного культурного сфероидов были созданы, клеточных популяций могут быть выделены из сфероидов повторным покрытием в двумерном контексте, как показано на рисунке 2. В зависимости от относительной скорости роста клеток испытания, чистый населения могут появиться через последовательный переход (как показано на рисунке 3) или могут быть отсортированы с помощью соответствующих маркеров клеток. После выделения из 3D совместно культуры, эпителиальные клетки сохраняют свойства предоставляемых совместно культуры фибробластов в течение длительного периода времени, что позволяет широкие возможности для анализа. В этом примере воздействия Tiam1 дефицитом фибробластов индуцированных повышенной миграции в сотрудничестве культурный HMECs, что сохраняется в течение неделиосле изоляции от 3D-со-культуры (рис. 4).

Рисунок 1. Изображений установленных сфероида со-культур в свете и флуоресцентной микроскопии. Сфероид культуры создаются с молочной эпителия и фибробластов клеточных линиях и могут расти в культуре в течение 10-14 дней. AF: эпителиальные = HMEC-mCherry клеток. GL: эпителиальные клетки = SUM159-mCherry клеток. AC, GI: фибробластов = контроль RMF-GFP клеток. ДФ: фибробластов = RMF-GFP с Tiam1 глушителей. ДЛ: фибробластов = RMF-GFP с Tiam1 за выражение. Стрелки указывают эпителиальных прогнозы вторжения в матрице.

Рисунок 2. Последовательные изображения культур под светом и флуоресцентной микроскопии после выделения из культуры Матригель. День 0 представляет изображения сразу после изоляции, дни 1, 2 и5 показывают дней после изоляции. Корона клеток оставив сфероид увеличивается с течением времени. В конце концов "призрак" сфероида очень мало клеток остается (стрелка). Очень немногие сфероидов остаются после удаления призраков и первый проход.

Рисунок 3. Проточная цитометрия анализа клеток после выделения из Матригель со-культуры. После сфероида со-культуры созрели, клетки выделяют из 3D совместно с пипеткой культуры и серийные пассажи. Пример аликвоты исследуют методом проточной цитометрии (в данном примере использования зеленого свечения и красной флуоресценции для определения выражения GFP-фибробласты и mCherry экспрессией эпителиальных клеток соответственно), чтобы определить относительную населения эпителиальных клеток и фибробластов.

Рисунок 4. Transwell миграции HMECs сохраняется после isolatiо сотрудничестве с Матригель-культуры. После чистого населения были получены через культуру или флуоресценции сортировки клеток, клетки могут быть проанализированы как хотелось бы. Здесь миграции HMECs совместной культурной либо контроля (С) или Tiam1 недостаточности (шт) фибробласты через перфорированную transwells был оценен в 2, 4 и 8 недель после выделения из со-культуры.

Обсуждение

Метод представленный здесь представляет собой простой подход к анализу последствий стромальных фибробластов на эпителиальных клетках, в том числе опухолевых клеток. Это дает возможность прямого межклеточного взаимодействия в трехмерном контексте поддержке внеклеточного матрикса базальной мембраны, позволяя легко извлечения клеток из матрицы для последующего анализа. Это может быть применен к изучению опухолевого стромы, а фибробластов линии можно манипулировать, чтобы влиять на сигнальные пути выбора и эпителиальных лин...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
BD Матригель	BD Biosciences	356237	Фенол-красный бесплатно
Hyclone Классическая жидкой среде: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone говядине телячьей сывороткой	ThermoScientific	SH3007303
Инсулин	EMD химическими веществами	407709	Растворите в 0.005N HCl, 0,22 мкм фильтр
Гидрокортизон	Sigma-Aldrich	H4001	Растворить в 50% этанола, 0,22 мкм фильтр
ЭФР	Sigma-Aldrich	E9644	Растворить в 10 мМ уксусной кислоты; 0,22 мкм фильтр