Методическая статья

Преодоление невосприимчивости в экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) штаммов мыши по усыновлению и передачи Антигенная вызов

DOI:

10.3791/3778

⸱

9 апреля 2012 г.

 ,  , 
1Department of Medicine, Section of Cardiology, St. John-Providence Health System, 2Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некоторые штаммы мыши способны противостоять индукции экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) с белком миелина основной. Описанный здесь простой протокол иммунизации, что меняет и вызывает невосприимчивость паралитического заболевания в нескольких типичных EAE стойкие загрязнения мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) представляет собой воспалительное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) и был использован в качестве животной модели для изучения человеческих болезней демиелинизирующей, рассеянный склероз (РС). EAE характеризуется патологической инфильтрации мононуклеарных клеток в центральной нервной системе и клиническими проявлениями паралитического заболевания. Как и в MS, EAE также находится под генетическим контролем в том, что некоторые штаммы мыши восприимчивы к болезни индукции, а другие являются устойчивыми. Как правило, C57BL / 6 (H-2, б) мышей, иммунизированных белком миелина основной (МБП) не развиваются паралитические знаков. Это отсутствие реакции, конечно, не из-за дефектов в обработке антигена или антигенов в MBP, как экспериментальный протокол, описанный здесь был использован, чтобы вызвать серьезный EAE в C57BL / 6, а также других известных штаммов мыши. Кроме того, encephalitogenic Т-клеток клонов из C57BL / 6 и BALB / C мышей реагирует на MBP был успехполностью изолирован и распространяются.

Экспериментальный протокол предполагает использование сотовой приемной системы денежных переводов, в которых MBP-загрунтовать (200 мкг / мышь) C57BL / 6 донорских клеток лимфатических узлов выделяют и культивируют в течение пяти дней с антигеном расширить пул MBP конкретных Т-клеток. В конце периода культивирования, 50 млн. жизнеспособных клеток передаются в наивных сингенных получателям через хвостовую вену. Получатель мышей таким образом рассматриваться как правило, не развиваются EAE, тем самым подтвердив их устойчивый статус, и они могут оставаться нормальной на неопределенный срок. Через десять дней после передачи ячейки, получатель мышей заражали Фрейнда адъювантной (CFA), эмульгированных MBP в четырех местах в бока. Тяжелые EAE начинает развиваться у этих мышей от десяти до четырнадцати дней после заражения. Результаты показали, что индукция болезнь антигенной конкретные задачи, как, не относящимися к антигенам не вызывает клинических проявлений болезни. Примечательно, что титрования дозы антигена используется длявызов получателя мышах показали, что это может быть как 5 мкг / мышь. Кроме того, кинетические исследования о сроках антигенной проблемы показал, что задача, чтобы вызвать заболевание было эффективным, как уже 5 дней после заражения и антигенные тех пор, пока на 445 дней после антигенной проблемы. Эти данные убедительно указывают на участие "долгоживущих" Т клеточной популяции в поддержании невосприимчивость. Участие регуляторных Т-клеток (Tregs) в этой системе не определен.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка CFA-эмульгированных антигена

  1. Растворите морскую свинку MBP (подготовлен в соответствии с методом Swanborg1 и хранится в лиофилизированной форме при 4 ° С) в фосфатный буферный раствор (PBS) в концентрации 2 мг / мл. Если синтезированных пептидов MBP (MBP 60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) 2 используются, готовить 2 мг / мл раствора. Составьте соответствующее количество раствора антигена (0,1 мл на мышь подлежащих иммунизации) в стеклянный шприц с Луер-лок.
  2. Составьте объем адъювантной H37Ra Фрейнда (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) равна раствора антигена в другой стеклянный шприц оснащен Луер-лок.
  3. Соедините два шприцы стеклянные с трехходовым краном. Смешать MBP решение с CFA, нажав на поршни и обратно. Продолжайте движение, пока не образуется эмульсия.
  4. Чтобы проверить, если образуется эмульсия, олл смеси в одном шприце. Отсоедините пустой шприц, потяните тОн поршень немного и выполнять падения остаточной эмульсии в стакан с чистой водой комнатной температуры. Если эмульсия падения остается неизменной на поверхности воды, эмульсии. Если эмульсия падение рассеивается, снова шприцы и продолжают перемешивание движения.
  5. Используйте 1 мл шприц для иммунизации процесс, чтобы обеспечить доставку точной дозы антигена. Для передачи антигена эмульсии пластиковый шприц, вынуть поршень и вставить пустой пластиковый шприц в отверстие трехходового крана, где предыдущие стеклянный шприц был отключен, как в п. 1.4.
  6. Наполните шприц к краю, нажав на поршень стеклянный шприц. Вставьте поршень пластиковый шприц обратно и отодвинуть избыток эмульсии до достижения 1,2 мл отметки на пластиковый шприц. Этот маневр уверяет, что не осталось пузырьков воздуха в ловушке внутри пластикового шприца.
  7. Удалите пластиковый шприц с трехходовым краном. Аттач # 26 иглы для шприц. Надавите на поршень в 1 мл знак, так что теперь эмульсия заполняет пустоту объем иглы.

2. Иммунизация мышей-доноров

Примечание: Самки мышей C57BL / 6, как правило, вводят антиген эмульсии в четырех местах в бочках, после методы, первоначально разработанные группой McFarlin по 3 при Национальных институтах здравоохранения. Для опытного следователя, один человек может выполнять все задачи. Для начинающих, помощь может быть предложено, чтобы один человек держит мышь, а другой человек делает инъекции. Кроме того, мышь может быть анестезии для инъекций.

  1. Держите мышь крепко кожи шеи и удерживать хвост между 4-й и 5-й пальцы так, что грудная клетка и живот легко доступны.
  2. Поместите иглу 1 мл шприц на сайте в грудной клетке чуть выше правой подмышечной впадине (Моиспользования) и ввести 0,05 мл антигена эмульсии подкожно. Немного выпуклость беловатый CFA можно увидеть через бледную кожу. Повторите то же самое для сайта в грудной клетке чуть выше левой подмышкой.
  3. Отпустите хвост и взяться правой ноги (левой кнопки мыши), включите его и держите его между 4-й и 5-й пальцы. Найдите место чуть ниже ребра случае правый фланг и ввести 0,05 мл антигена эмульсии.
  4. Отпустите правую ногу, поверните мышь в другую сторону и удерживайте левую ногу (указателя мыши) между 4-й и 5-го пальцев. Найдите место чуть ниже ребра случае в левый фланг и ввести 0,05 мл антигена эмульсии.
  5. Изменения в новой иглой после введения 10 мышей, или если игла становится притупляется.

3. Выделение клеток лимфатических узлов для тканевых культур от 7 до 10 дней после иммунизации

  1. Семь до 10 дней после иммунизации, пожертвовать мышейи удалить дренаж лимфатических узлов. Предпочтительный способ эвтаназии СО 2 вдоха. После того, как жертва, лежал мыши на спине на вскрытие доску с конечностями протянул и крепится к плате с контактами. Мыши смоченной спрей 70% этанола.
  2. Вырезать отверстие в коже продольно в середине от нижней части живота до подбородка стерильными ножницами и щипцами.
  3. Разрежьте живот кожу от области паха до каждой ногой. Пил назад и придавить кожу, обнажая паховых лимфатических узлов.
  4. Разрежьте кожу вдоль передних (левый и правый), так что кожа может быть очищены назад и скованы, чтобы разоблачить подмышечные лимфатические узлы возле подмышек.
  5. С двумя парами щипцы работать вместе, оторваться соединительной ткани, покрывающие и вокруг паховых лимфатических узлов. Когда соединительной ткани удаляются, поместите одну пару щипцов в лимфатических узлах и оторваться от тела. Поместителимфатических узлов в 35 мм блюдо Петри наполняется стерильным PBS.
  6. Потяните от соединительной ткани, покрывающие две подмышечные лимфатические узлы, используя две пары щипцов. Изолировать лимфатических узлов и поместить их в чашку Петри. Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить кровеносные сосуды пересечения области, как кровотечение делает выявления лимфатических узлов очень трудно.
  7. После того как все лимфатические узлы собирают, переместите чашку Петри с капюшоном биобезопасности. Перерыв и дразнить в лимфатических узлах, кроме с двумя парами щипцы, шлифовальные друг против друга. Кроме того, в лимфатических узлах можно разбить с помощью плоского конца поршень 3 мл пластиковый шприц давит на лимфатические узлы на дне чашки Петри.
  8. Передайте дразнили лимфатических узлов клеточной суспензии через нейлоновую сетку для удаления оболочки и мусора.
  9. Макияж клетки лимфатических узлах подвески до 50 мл стерильные PBS. Центрифуга на 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин. Ресуспендируют гранул в культуральной среде. У жизнеспособной влокоть рассчитывать и регулировать концентрацию до 4 х 10 6 клеток / мл. UseRPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ MEM пируват натрия, 0,1 ммоль MEM без незаменимых аминокислот, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ буфера Hepes и 5 х 10 -5 М 2-ME. Предварительно теплой культуры до ресуспендирования клеток.
  10. Культуры клеток в 24-луночных культуры с объемом 2 мл на лунку (конечная концентрация ячейки 8 х 10 6 клеток / лунку). Добавить антигена в каждую лунку в конечной концентрации 100 мкг / мл. Место культуры пластины в 37 ° C инкубатор с 5% CO 2. Инкубируйте клетки в течение 5 дней.

4. Сбор культивируемых клетках лимфатических узлов 5 дней после начала культур

  1. Смешать клеток в каждой лунке с помощью пипетки вверх и вниз с Пастера стеклянную пипетку или маленький объем пипетки. Урожай клеток в 50 мл центрифужные пробирки.
  2. Центрифуга клеток при 1000 оборотов в минуту в течение 10 мин. Resusзависеть осадок клеток в небольшом объеме PBS.
  3. Граф клеток и регулировать жизнеспособной концентрации клеток до 2,5 х 10 8 клеток / мл стерильной PBS. Нарисуйте клеток в шприц снабжен № 26 иглы.
  4. Поместите тепла лампы в клетку получателя мыши, чтобы расширяться в хвостовую вену.
  5. Использование мыши держатель, расширить хвост мыши через щель в держателе. Потяните расширить хвост. Найдите вены.
  6. Вводите 0,2 мл / мышь суспензии клеток, равное 5 х 10 7 клеток.

5. Антигенная Проблема Получатель Мыши 20 дней после передачи сотового и развития симптомов заболевания

  1. Проблема мышей получатель не показывает признаков заболевания с антигеном. Процедуры же, как и раздел 2 «Иммунизация мышей-доноров".
  2. Соблюдайте развития паралитического заболевания от 7 до 10 дней после антигенной проблемы.
    1. Болезнь начинается со слабости в хвосте. Болезнь оценивается как 1когда хвост становится вялым. Болезнь классифицируется как 2, когда мышь парализована в одной задней конечности. Болезнь классифицируется 3, когда обе задние конечности парализованы и мышь тащит обеих задних конечностей при сканировании вперед. Болезнь классифицируется 4, когда мышь теряет использования как передние конечности, в результате чего мыши совершенно неподвижно. Болезнь оценивается 5, когда указатель мыши находится умирающий, и тело сворачивается. Смерть как болезнь набрал 6 класса 4.
  3. MBP конкретных EAE индуцированные в C57BL / 6 мышей после этого протокола является монофазный. Мыши могут оправиться от болезни, но не спонтанно рецидивов.

6. Представитель Результаты

Мыши, которые получили загрунтовать и в пробирке расширенной донорских клеток лимфатических узлов не развиваются симптомы заболевания EAE, отражая их устойчивость к болезням индукции. Тем не менее, тяжелые заболевания разработаны после антигенной проблемы (см. таблицу), что свидетельствует о способности антигенной проблемыв изменении сопротивления механизма. Две особенности антигенного задачей отмеченные дозы антигена и кинетики задача, чтобы вызвать заболевание. Очень низкие дозы антигена необходимо, как показано в табл. Удивительно, что у мышей, получавших донорские клетки в прошлом году все еще ​​может развиться тяжелые болезни, когда вызов с антигеном (табл. IV). Эти два наблюдения убедительно свидетельствуют участия "долгоживущих" Т-клеток в поддержании EAE сопротивления. Этот протокол применяется для многих EAE штаммов мыши 4.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Блок-схема эксперимента для индукции EAE в известных штаммов мыши.

Клинические EAE
После передачи приемных 		Клинические EAE
после антигенной проблемы
Напрягать Антиген падение Av. болезнь класса
(Диапазон) 		Av. День начала
(Диапазон) 		Падение Av. болезнь класса
(Диапазон) 		Av. День начала
(Диапазон)
SJL MBP 21/21 4.0 (3-5) 8.0 (6-10) ND ND ND
C57BL / 6 MBP 0/10 - - 7/7 3.85 (3-5) 9.28 (9-10)
BALB / с MBP 0/7 - - 5/5 3.2 (3-4) 7.0 (7)
C3H/HeJ MBP 0/7 - - 4/4 3.2 (3-4) 8.0 (8)
C57BL / 6 MBP 60-80 0/4 - - 4/4 2.75 (2-4) 10.2 (9-11)

Таблица I. Индукция MBP-опосредованной EAE в C57BL / 6 мышей. Приемные передачи загрунтовать и в пробирке расширенной клетки донора не вызывает EAE в C57Bl / 6 мышей. Антигенная после заражения клетки передачи оказанных мыши восприимчивы к болезням индукции. Av., В среднем. Н.Д., не было сделано.

Клинические EAE после антигенной проблемы
Грунтовка антигена Проблема антигена Падение Av. болезнь класса
(Диапазон)		 Av. День начала
(Диапазон)
MBP-CFA CFA только 0/3 - -
MBP-CFA ОВА-CFA 0/3 - -
MBP-CFA MBP-CFA 3/3 4.0 (4.0) 7.7 (7-9)

Таблица II. Специфика антигенной проблемы. Мыши-реципиенты были оспорены с грунтовки антигена, а также других не имеет значения антигенов. Только грунтовки антиген индуцированной тяжелой болезни. OVA: курица овальбумина. Av., В среднем.

Клинические EAE после антигенной проблемы
Проблема антиген дозы (мкг / мышь) Падение Av. болезнь класса
(Диапазон) 		Av. День начала
(Диапазон)
200 4/4 3.75 (3-4) 8.25 (7-9)
100 4/4 3.67 (3-4) 7.5 (7-8)
50 4/4 3.25 (3-4) 8.25 (7-10)
25 4/4 3.0 (3.0) 8.25 (8-9)
10 4/4 3.0 (3.0) 8.76 (8-9)
5 4/4 2.5 (2-3) 9.75 (9-10)
1 2/4 1.0 (1.0) 16 (14-18)
0 0/4 - -

Таблица III. Дозы антигена вызов, необходимых для индукции заболевания. Различные концентрации MBP использоваться, чтобы бросить вызов получателя мышей были протестированы. Av., В среднем.

Клинические EAE после антигенной проблемы
Проблема антигена День Вызова Падение Av. Болезнь класса
(Диапазон) 		Av. День начала
(Диапазон)
MBP-CFA 5 3/4 1.33 (1-2) 9.67 (9-10)
MBP-CFA 10 4/4 3.0 (3.0) 8.25 (7-9)
MBP-CFA 15 4/4 3.75 (3-4) 7.25 (7-8)
MBP-CFA 25 4/4 4.0 (4.0) 8.0 (7-9)
MBP-CFA 35 4/4 3.5 (3-4) 7.5 (7-8)
MBP-CFA 60 4/4 3.75 (3-4) 9.0 (8-10)
--------------------------
MBP-CFA 343 3/3 3.0 (3.0) 10.33 (10-11)
MBP-CFA 445 3/3 3.0 (3.0) 7.0 (7.0)

Таблица IV. Кинетика антигенный вызов. Мыши-реципиенты были оспорены в различные точки времени после принятияив переноса. Av., В среднем.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования EAE у мышей часто используют neuroantigens, основного белка миелина (ОБМ), proteolipid белок (ПЛП) или миелин олигодендроцитов белка (МНГ). Более ранние исследования в основном используется MBP. ПЛП стимулирует сильные и последовательные ответы SJL мышей. Совсем недавно, MOG является общим neuroantigen используется потому, B6 мыши восприимчивы к болезни индукции с этим антигеном. Многие из этих генов целевых линий мышей находятся на B6 генетического фона. Интересно, В6 мыши восприимчивы к EAE индукции MOG, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет раскрытия финансовой информации.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При частичной поддержке грантов от Национального института здоровья (R01 NS37253 и N01 NS055167) и Национальное общество рассеянного склероза (RG 3288-A6).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Морской свинки спинного мозга Rockland Иммуно-химические, Inc
Gilbertsville, PA 19525
www.rockland-inc.com 		GP-T065 заморожены
Адъювант Фрейнда, полный H37Ra Difco лаборатории
Детройт, Мичиган 		231131
Multifit обмена шприцев, в состоянии BD
www.bd.com / нас 		512133
RPMI 1640 MediatechИнк
Манассас, Вирджиния
www.cellgro.com 		10-040-СМ
OVA Sigma-Aldrich
www.sigmaaldrich.com 		A5503
Мыши Лаборатории Джексона
Бар-Харбор, штат Мэн 		B6 мышей: 0000664

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Swanborg, R. H. Experimental allergic encephalomyelitis. Methods in Enzymology. Sabato, G. D. 162, Academic Press. New York, NY. 413-421 (1988).
  2. Shaw, M. K., Kim, C., Hao, H. W., Chen, F., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice: Mapping of T cell epitopes and T cell Vb gene segment usage. J. Neuroscience Research. 45, 690-699 (1996).
  3. McCarron, R., McFarlin, D. E. Adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J, PL/J, and (SJL/J x PL/J)F1 mice. Influence of I-A haplotypes on encephalitogenic epitope of myelin basic protein. J. Immunol. 141, 1143-1149 (1988).
  4. Shaw, M. K., Kim, C., Ho, K. -L., Lisak, R. P., Tse, H. Y. A combination of adoptive transfer and antigenic challenge induces consistent murine experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice and other reputed resistant strains. J. Neuroimmunol. 39, 139-150 (1993).
  5. Krishnamoorthy, G., Saxena, A., Mars, L. T., Domingues, H. S., Mentele, R., Ben-Nun, A., Lassmann, H., Dornmair, K., Kurschus, F. C., Liblau, R. S., Wekerle, H. Myelin-specific T cells also recognize neuronal autoantigen in a transgenic mouse model of multiple sclerosis. Nat. Med. 15, 626-632 (2009).
  6. Anderson, A. C., Reddy, J., Nazareno, R., Sobel, R. A., Nicholson, L. B., Kuchroo, V. K. IL-10 plays an important role in the homeostatic regulation of the autoreactive reperteroire in naïve mice. J. Immunol. 173, 828-834 (2004).
  7. Anderton, S. M. Treg and T-effector cells in autoimmune CNS inflammation: a delicate balance easily disturbed. Eur. J. Immunol. 40, 332-334 (2010).
  8. Arnon, R. Experimental allergic encephalomyelitis - susceptibility and suppression. Immunol. Rev. 55, 5(1981).
  9. Billiau, A., Heremans, H., Vandekerckhove, F., Dijkmans, R., Sobis, H., Meulepas, E., Carton, H. Enhancement of experimental allergic encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-g. J. Immunol. 140, 1506-1510 (1988).
  10. Arbomson-Leeman, S., Alexander, J., Bronson, R., Corroll, J., Southwood, S., Dorf, M. Experimental autoimmune encephalomyelitis-resistant mice have highly encephalitogenic myelin basic protein (MBP)-specific T cell clones that recognize a MBP peptide with high affinity for MHC class II. J. Immunol. 154, 388-398 (1995).
  11. Reddy, J., Illes, Z., Zhang, X., Encinas, J., Nicholson, L., Sobel, R. A., Wucherpfennig, K. W., Kuchroo, V. K. Myelin proteolipid protein-specific CD4+CD25+ regulatory cells mediate genetic resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15434-15439 (2004).
  12. Korn, T., Reddy, J., Gao, W., Bettelli, E., Awasthi, A., Petersen, T. R., Backstrom, B. T. Myelin- specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature Med. 13, 423-431 (2007).
  13. Shaw, M. K., Li, J., Ho, P. P., Hao, H., Lisak, R. P., Tse, H. Y. Induction of myelin basic protein-specific adoptive experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice. Longevity of donor T cells and lack of disease relapses. Neuroimmunology Research Focus. Broglie, P. V. , Nova Science Publisher. New York. 175-191 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи