Выделение растворимых и нерастворимых олигомеров PrP в нормальном мозга человека

Краткое содержание

Новый вид клеточный белок прион (PrP ^C) Недавно была идентифицирована в незараженных человеческого мозга с использованием методов, описанных здесь. Эти методы могут быть использованы для выделения различных видов PrP, а некоторые из них также являются полезными в изоляции других агрегатов неправильно упакованных белков из человеческого мозга.

Аннотация

Центральным событием в патогенезе прионных заболеваний включает в себя преобразование хоста в кодировке сотовой прионных белков PrP ^C в своей патогенной изоформы PrP ^{Sc 1.} PrP ^C является моющим средством растворимых и чувствительны к протеиназы К (PK)-пищеварения, в то время как ^PrPSc, образует нерастворимые моющих средств агрегатов и частично устойчивы к ПК ^2-6. Преобразование PrP ^C в ^PrPSc, как известно, связаны с конформационного перехода из α-спиральные к β-лист структуре белка. Тем не менее, в пути естественных условиях все еще ​​плохо изучены. Предварительный эндогенных ^PrPSc, промежуточные PrP * или "тихая прионных", до сих пор не определены в неинфицированных мозга ^7.

Использование комбинации биофизических и биохимических подходов, мы определили нерастворимые PrP ^C агрегатов (назначенный IPRP ^C) из неинфицированных млекопитающих мозг и культурный нейроновклетки ^{8, 9.} Здесь мы описываем подробные процедуры из этих методов, в том числе ультрацентрифугирования в моющих буфер, сахарозу шаг градиента осаждение, хроматография исключения, IPRP обогащения гена 5 белков (G5p), которые специфически связываются с структурно изменило PrP формы ¹⁰ и ПК-лечение. Сочетание этих подходов изолирует не только нерастворимые ^PrPSc, и PrP ^C агрегатов, но и растворимого PrP ^C олигомеров от нормального человеческого мозга. Так как протоколы, описанные здесь, были использованы для выделения и ^PrPSc, от инфицированной мозги и IPRP ^C от неинфицированных мозги, они дают нам возможность сравнить различия в физико-химическими свойствами, нейротоксичность, и инфекционной двух изоформ. Такое исследование позволит значительно улучшить наше понимание инфекционных белковых патогенных микроорганизмов. Физиологии и патофизиологии IPRP ^C неясны в настоящее время. Примечательно, что в новой ID-entified прионных болезней человека называют переменно-протеазы чувствительной prionopathy, мы нашли новый ^PrPSc, которая разделяет иммунореактивного поведения и фрагментации с IPRP ^{C 11, 12.} Кроме того, недавно мы показали, что IPRP ^C является основным видом, который взаимодействует с β-амилоидных белков в болезнь Альцгеймера ^13. В том же исследовании, эти методы были использованы для выделения Abeta агрегатов и олигомеров при болезни Альцгеймера ^13, предполагая, их применение не-прионных белков агрегатов, участвующих в других нейродегенеративных заболеваний.

Протокол

1. Подготовка гомогената мозга и моющих средств водорастворимые (S2) и нерастворимые (P2) Фракции

1. Принимать по 100 мг замороженных человеческих тканей головного мозга и добавить 100 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% ЭДТА, рН 7,4).
2. Однородный его на льду с пестиком приводом от двигателя беспроводные, заморозить его в сухом льду в течение 5 мин и однородности его снова, используя пестик приводится в руках, а затем автомобильным и добавьте 300 мкл или 800 мкл буфера для лизиса (это либо 20- % или 10% общего гомогената головного мозга, соответственно).
3. Центрифуга 20% или 10% общего гомогената мозга при 1000 х г в течение 10 мин при 4 ° C для сбора супернатант (S1), используя настольные центрифуги.
4. Ультрацентрифуге 10% S1 при 35000 оборотов в минуту (100.000 мкг) в SW55 ротора (Beckman Coulter, Фуллертон, Калифорния) в течение 1 ч при 4 ° C. Передача супернатант (S2), которые содержат моющее-растворимой фракции в чистую пробирку. Ресуспендируют гранулы, которые содержат моющие средства нерастворимыхфракция (P2) в 100 мкл или 200 мкл буфера для лизиса, чтобы сделать 10 - или 5-кратный концентрированный препарат.
5. Для PK-пищеварение, инкубировать образца с таким же количеством ПК на уровне 50 мкг / мл при 37 ° C в течение 1 часа для S2 и P2 фракций. Добавить фенилметилсульфонилфторида в конечной концентрации 5 мМ и равных объемах SDS буфера для образца (3% SDS, 2 мМ ЭДТА, 4% β-меркаптоэтанола, 10% глицерин, 50 мМ Трис, рН 6,8) прекратить PK пищеварения. Отварить образцы в течение 10 минут и охладить при комнатной температуре в течение 5 мин. Они готовы на Вестерн-блоттинга.

2. Скорость седиментации в градиентах сахарозы шаг

1. Инкубируют 450 мкл 20% S1 с равным объемом 2% sarkosyl в H ₂ O в течение 30 минут на льду.
2. Добавить 0,5 мл 60%, 30%, 25%, 20%, 15% и 10% сахарозы в трубку Beckman с максимальной мощностью 5 мл.
3. Загрузите 0,4 мл S1 на вершину 10-60% сахарозы градиенты шаг.
4. Центрифуга на 48.000 мин (200.000 XG, SW55 роторе) в течение 1 ч при 4 ° C.
5. Соберите 283 мкл фракции каждой из верхней части трубки и получить 12 фракций в общей сложности.
6. Принимать по 20 мкл каждой фракции в новую пробирку Eppendorf, добавить 20 мкл буфера для образца, и кипятить в течение 10 мин.
7. Прохладный образцов в течение 4 минут в капот, центрифугируют при 1000 х г в течение 1 мин и вихревые них. Загрузка образцов на сборных гель.

3. Эксклюзионной хроматографии

1. Используйте Superdex 200 HR бусины (Pharmacia, Упсала, Швеция) в 1 х 30 см столбца, чтобы определить состояние олигомерных молекул PrP.
2. Семь молекулярных маркеров массы (Sigma, Сент-Луис, MI), включая декстрана синего (2.000 кДа), тиреоглобулина (669 кДа), апоферритина (443 кДа), β-амилазы (200 кДа), алкогольдегидрогеназы (150 кДа), альбумин ( 66 кДа), и карбоангидразы (29 кДа), которые загружаются самостоятельно в концентрациях, рекомендованных Sigma в 200 мкл объема образца.
3. Объем элюирования синий DextRAN используется для определения свободного объема (V ₀ = 8,45 мл) и общий объем (V _T = 24 мл) обеспечивается продуктом обучения. Пик объемов элюирования (V _е) рассчитываются по хроматограмме и дробной удержаний. К _пр-т, коэффициент распределения (определение образцов поведения), рассчитывается по следующей формуле: K _пр = (V _E - V ₀₎ / (V _т - V _0). Калибровочной кривой определяют путем построения K _AV белка стандарты в отношении журнала МВт стандартов ^8.
4. Молекулярной массы (ММ) различных видов PrP восстановленные в разных FPLC фракции оценивается по калибровочной кривой, созданных с помощью гель-фильтрации различных стандартов.
5. Inject 200 мкл S1 в буфере для лизиса, содержащего 1% sarkosyl в колонке для каждого запуска.
6. Хроматография выполняется в системе FPLC (GE Healthcare) при скорости потока 0,25 мл / мин и фракциис 0,25 мл каждый, собранные с помощью коллектора фракций (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Инкубируйте 0,125 мл каждая фракция с 0,5 мл предварительно охлажденного метанола при -20 ° C в течение 2 часов.
8. Центрифуга образцов при 13000 х г в течение 30 мин при 4 ° C в настольной микроцентрифуге. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 20 мкл образца SDS буфера, как уже упоминалось выше, кипячением в течение 10 мин, охладить до комнатной температуры, загрузить их на сборные гель.

4. Захват PrP по G5p

1. Молекула G5p (100 мкг) (любезно предоставлена ​​доктором. Джефф Нил и Джон McGeehan из Университета Портсмута, Великобритания) сопряжена с 7 х 10 ⁸ тозил активировать магнитных шариков путем инкубации G5p 100 мкг и 350 мкл бисером G5p в 1 мл фосфатно-солевым буфером (PBS) при 37 ° C в течение 20 часов. Привлечь G5p-шарики к боковой стенке трубы Эппендорф внешних магнитных сил, а затем удалите все решения. Вымойте бисером с 1 мл PBS содержащие0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в три раза.
2. Инкубируйте G5p конъюгированных бисера в 1 мл 0,2 М Трис-HCl, рН 7,4, содержащем 0,1% BSA при 37 ° C в течение 5 часов, чтобы заблокировать неспецифического связывания и затем промыть бусины с 1 мл PBS, содержащем 0,1% БСА для в три раза выше. Снимите решение и добавить 1 мл PBS в бисер. Подготовленные бусины G5p стабильны в течение не менее 3 месяцев при 4 ° C.
3. Захват PrP по G5p осуществляется путем инкубации 100 мкл S1 фракций или P2 с 60 мкл G5p сопряженных бисером (10 мкг белка / 6 X 10 ⁷ бусин) в 1 мл буфера для связывания (3% Tween-20, 3% NP- 40 в PBS, рН 7,5).
4. После инкубации с постоянной ротации в течение 3 часов при комнатной температуре, PrP содержащих G5p бусин привлекает к боковой стенке трубы Эппендорф внешних магнитных сил, что позволяет легко удаления всех несвязанных молекул в растворе.
5. После трех промываний в промывочного буфера (2% Tween-20 и 2% NP-40 в PBS, рН 7.5), G5p бисера собираются и нагревали при 95 ° C в течение 5 мин в буфере образца SDS (3% SDS, 2 мМ ЭДТА, 10% глицерин, 50 мМ Трис-HCl, рН 6,8).
6. После охлаждения образцов в течение 5 мин при комнатной температуре, образцы центрифугируют при 1000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Супернатанты готовы для вестерн-блоттинга.

5. Вестерн-блоттинга

1. Нагрузка образцы кипятили в буфере образца SDS на 15% Трис-HCl Критерий сборных гелях (Bio-Rad) при 150 V в течение ~ 80 мин.
2. Белков на гелях переданы PVDF течение 2 ч при 70V.
3. После блокирования мембран в 5% молока в трис-буферном растворе, содержащем 0,01% Твин-20 (TBS-T), мембраны инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с первичной моноклональных или поликлональных антител 3F4 (1:40,000), 1E4 (1 : 1.000), анти-N ⁸ (1:6,000), или анти-C ⁸ (1:6,000) для зондирования PrP молекулы.
4. После инкубации с HRP-конъюгированных овец анти-мышиных IgG в1:3000, или осла анти-IgG кролика на 1:3000 PrP полосы визуализируются на Kodak пленки с использованием ECL Plus, в соответствии с протоколом производителя.

6. Представитель Результаты

По сравнению с CJD спорадические образцы, небольшое количество IPRP ^C был обнаружен в P2 фракции в нормальном мозге, хотя большинство из PrP ^C был восстановлен в S2 фракции (рис. 1). Как указывалось ранее ^8, IPRP составляет примерно 5-25% от общего числа PrP в том числе полнометражных и N-терминально усеченного вида.

Анализ использования сахарозы шаг градиента осаждения показало, что в то время как большинство PrP ^C от не-CJD мозг был восстановлен в верхней фракции 1-3, небольших количеств PrP были также обнаружены в нижней фракции 9-11, которые обычно содержат большие агрегаты ⁸ (Рисунок 2).

Различные виды PrP ^Sc позвонилния из мономеров, олигомеров небольших в более крупные агрегаты выделяли гель-фильтрации в мозг с Крейтцфельдта-Якоба (рис. 3А). Тем не менее, небольшое количество крупных агрегатов с молекулярной массой более 2000 кДа был также обнаружен в нерастворимые фракции нормальных мозгах (рис. 3). Кроме того, димеров и тетрамеров PrP ^C были обнаружены не только в нерастворимые фракции, но и в растворимой фракции (рис. 3В и 3С).

После лечения ПК и PNGase, PrP захвачен G5p был обнаружен с 1E4 антитела против PrP97-105 ^8. Три PK-устойчивых фрагментов ядро называется PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, и PrP * ⁷ было обнаружено, мигрирующие на ~ 20 кДа, 19 кДа ~ и ~ 7 кДа, соответственно (рис. 4, слева). Тем не менее, не PrP была обнаружена, когда 1E4 антитела предварительно инкубировали с синтетический пептид, который имеет последовательность идентческих к 1E4 эпитопу (рис. 4, средняя панель), указывая, что полосы обнаружены 1E4 являются PrP фрагментов. Кроме того, анти-С антитела обнаружены два различных фрагментов PrP миграции на ~ 18 кДа (PrP * ¹⁸⁾ и ~ 12-13 кДа (PrP-CTF12/13), в дополнение к PrP * ²⁰ (рис. 4, справа).

Рисунок 1. Обнаружение IPRP ^C и IPRP ^н. После обработки PNGase F в 1/10 от общего объема реакции при 37 ° С в течение 1 часа, чтобы удалить гликанов от белка, в полный рост или N-терминально усеченных PrP видов растворимых и нерастворимых фракций (S2 и P2) изолированная ультрацентрифугированием в мозг выборках из нормальной управления (CTL) и спорадические CJD (SCJD) были обнаружены с 3F4 против PrP106-112 (левая панель), анти-N от PrP23-40 (средняя панель) и анти-C против PrP220-231 (правая панель). В CTL образцов, небольшое количество PrP обнаружен в P2, в то время как большое количество присутствует в S2. В отличие от более PrP обнаружен в P2, чем в S2 в SCJD образцов.

Рисунок 2. Осаждение PrP в градиентах сахарозы шаг. PrP в отдельных фракций от 1 до 11 не-CJD S1 мозга образца было обнаружено вестерн-блоттинга с 3F4. Хотя большинство из PrP ^C был обнаружен в верхней фракции 1-3, небольшие количества PrP наблюдались также в нижней фракции 9-11. Кроме того, полосы структуре PrP сверху и снизу иная: PrP восстановился в верхней фракции имеет доминирующее верхней полосе в то время как PrP восстановился в нижней фракции имеет доминирующее нижней полосы. PK-лечение ^PrPSc, были загружены в качестве контроля на правой стороне пятно.

Рисунок 3. Определение растворимых и нерастворимых PrP ^C олигомеров. Растворимые и нерастворимые PrP ^C от нормального человеческого мозга были разделены ультрацентрифугирования, а затем подвергают гель-фильтрации, соответственно. Молекулярных размеров отдельных фракций были измерены работает группа молекулярных маркеров массы. (A) ^PrPSc, вид из SCJD образцы мозга. Два популяций видов PrP были обнаружены: гель-фильтрации фракции 49 - 65 содержат мономеров и олигомеров небольшие, в то время как фракции 27-33 содержат большие агрегаты. PrP ^C видов из растворимой фракции (S2) (B) и нерастворимые фракции (P2) (C) нормального контроля выявлено не было. PrP зондировали 3F4 антитела. Димеры (фракция 55) и тетрамеры (фракция 51) из PrP были обнаружены не только в P2, но и в S2 нормальной SAMPL мозгаES (B и C). Большие агрегаты был обнаружен лишь в P2 нормальных образцов (C).

Рисунок 4. Обнаружение различных PK-устойчивых IPRP фрагментов в G5p обогащенные препараты из нормального человеческого мозга. Образцы обогащенный G5p лечили ПК и PNGase F до Вестерн-блоттинга зондирования 1E4 (слева), 1E4 предварительно инкубировали с синтетического пептида, который был последовательность, идентичную 1E4 эпитопа (средняя панель) и анти-C ( правая панель). 1E4 обнаружил три PK-устойчивых фрагментов PrP называется PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, и PrP * ⁷ (левая панель). После блокирования 1E4 с пептидом, не PrP ^{разрешение} было обнаружено (средняя панель), что указывает на полосы обнаружены с 1E4 являются PrP фрагментов. Anti-C выявили две Кроме того PK-устойчивых фрагментов PrP называется PrP * ¹⁸ и PrP-CTF12 /13, в дополнение к PrP * ^20.

Обсуждение

Сочетание подходов сообщили здесь изолирует последовательно нерастворимые агрегаты PrP ^C и растворимого PrP ^C олигомеров от нормального человеческого мозга. Ультрацентрифугирования при 100000 х г в течение одного часа является классическим методом, который широко используется для отделения нерастворимых ^PrPSc, от растворимого PrP ^{C 14.} В то время как эффективные, одна из предупреждает, чтобы избежать загрязнения во время тянет супернатант (S2) после центрифугирования. Поскольк...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Фенилметилсульфонилфторида	Sigma-Aldrich	P7626	72 мм в 2-пропанол
Протеиназы K	Sigma-Aldrich	P2308	2 мг / мл H 2 O
PNGase F	New England Biolabs	MWGF200
Ультрацентрифуге LE-80K, SW55 роторе	Beckman Coulter	Номер 365668, 356860
Superdex 200 HR бисера	GE Healthcare	17-1088-01
AKTA FPLC системы	GE Healthcare	18-1900-26
Маркеров молекулярной массы	Sigma-Aldrich	MWGF200	Разнообразные
Dynabeads M-280 магнитных шариков	Invitrogen	143-01
3F4 антитела	Covance	SIG-39600
1E4 антител	Сотовые наук	M1840
Готовый гель 15% Трис-HCl сборных гелях	Bio-Rad	345-0020