Method Article

Химически заблокирован антител Microarray для мультиплексный высокой пропускной профилирования конкретных гликозилирования белков в сложных образцов

DOI:

10.3791/3791

⸱

May 4th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы опишем улучшение протокола мультиплексной высокой пропускной способности антител микрочипов с лектин метод обнаружения, которые могут быть использованы в гликозилирования профилирования специфических белков. Этот протокол имеет новый надежный реагентов и значительно сокращает время, стоимость и требования лабораторного оборудования по сравнению с предыдущей процедуры.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы описываем эффективный протокол для использования в мультиплексированном высокопроизводительном микрочипе антител с обнаружением гликансвязывающего белка, который позволяет профилировать гликозилирование конкретных белков. Гликозилирование белков является наиболее распространенной посттрансляционной модификацией, обнаруженной на белках, и приводит к разнообразным модификациям физических, химических и биологических свойств белков. Поскольку механизм гликозилирования особенно подвержен прогрессированию заболевания и злокачественной трансформации, аберрантное гликозилирование было признано биомаркерами раннего обнаружения рака и других заболеваний. Тем не менее, современные методы изучения гликозилирования белка, как правило, слишком сложны или дороги для использования в большинстве обычных лабораторных или клинических условий, и необходим более практичный метод изучения гликозилирования белка. Новый протокол, описанный в этом исследовании, использует химически заблокированный микрочип антител с обнаружением гликан-связывающего белка (GBP) и значительно сокращает время, стоимость и требования к лабораторному оборудованию, необходимые для изучения гликозилирования белка. В этом методе множественные иммобилизованные гликопротеин-специфические антитела печатаются непосредственно на предметных стеклах микрочипа, а N-гликаны на антителах блокируются. Заблокированные, иммобилизованные гликопротеин-специфические антитела способны захватывать и изолировать гликопротеины из сложного образца, который наносится непосредственно на предметные стекла микрочипа. Затем обнаружение гликана может быть выполнено путем нанесения биотинилированных лектинов и других GBP на предметное стекло микрочипа, в то время как уровни связывания могут быть определены с помощью Dylight 549-стрептавидина. Благодаря использованию панели антител и зондированию с несколькими биотинилированными лектинами, этот метод позволяет разработать эффективный профиль гликозилирования различных белков, обнаруженных в данном образце человека или животного.

Введение

Гликозилирование белка, которое является наиболее распространенным посттрансляционным изменением белков, изменяет физические, химические и биологические свойства белка и играет фундаментальную роль в различных биологических процессах1-6. Поскольку механизм гликозилирования особенно подвержен прогрессированию заболевания и злокачественной трансформации, аберрантное гликозилирование было признано биомаркерами раннего обнаружения рака и других заболеваний 7-12. На самом деле, большинство современных биомаркеров рака, таких как L3-фракция фетопротеина (АФП) α-1 для гепатоцеллюлярной карциномы 13-15 и CA199 для рака поджелудочной железы 16, 17, являются аберрантными гликановыми фрагментами на гликопротеинах. Тем не менее, методы изучения гликозилирования белка были сложными и не подходили для рутинных лабораторных и клинических условий. Chen et al. недавно изобрели микрочип с химически блокированным антителом и методом обнаружения гликан-связывающего белка (GBP) для высокопроизводительного и мультиплексного профильного гликозилирования нативных гликопротеинов в сложном образце 18. В этом методе микрочипов, основанном на аффинности, несколько иммобилизованных гликопротеин-специфических антител захватывают и изолируют гликопротеины из сложной смеси непосредственно на предметном стекле микрочипа, а гликаны на каждом отдельном захваченном белке измеряются в GBP. Поскольку все нормальные антитела содержат N-гликаны, которые могут быть распознаны большинством GBP, критическим шагом этого метода является химическое блокирование гликанов на антителах от связывания с GBP. В ходе процедуры ci s-диоловые группы гликанов на антителах сначала окисляли до альдегидных групп с использованием NaIO4 в буфере ацетата натрия избегая света. Затем альдегидные группы конъюгировали с гидразидной группой сшивающего агента, 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислотой гидразида HCl (MPBH), с последующей конъюгацией дипептида, Cys-Gly, с малеимидной группой MPBH. Таким образом, цис-диоловые группы на гликанах антител превращались в объемные негидроксильные группы, что препятствовало связыванию лектинов и других ГБП с антителами захвата. Эта процедура блокирования заставляет ГБП и лектины связываться только с гликанами захваченных белков. После такой химической блокировки образцы сыворотки инкубировали с микрочипом антител с последующим детектированием гликанов с использованием различных биотинилированных лектинов и GBP и визуализировали с помощью Cy3-стрептавидина. Параллельное использование панели антител и зондирование нескольких лектинов обеспечивает дискретные профили гликозилирования нескольких белков в данном образце 18-20. Этот метод был успешно использован в различных лабораториях 1, 7, 13, 19-31. Однако стабильность MPBH и Cys-Gly, усложнение и длительность процедуры в этом методе влияют на воспроизводимость, эффективность и результативность метода. В этом новом протоколе мы заменили MPBH и Cys-Gly на один гораздо более стабильный реагент гидразид глутаминовой кислоты (Glu-hydrazide), что значительно улучшило воспроизводимость метода, упростило и сократило всю процедуру так, что она может быть завершена в течение одного рабочего дня. В этом новом протоколе мы подробно описываем процедуру протокола, которая может быть легко принята обычными лабораториями для рутинного исследования гликозилирования белка, а также методы, необходимые для получения воспроизводимых и воспроизводимых результатов.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Печать антител Microarray к анализу

  1. Развести все антитела к 0,5 мг / мл в фосфатном буфере солевой раствор, рН 7,2 (PBS).
  2. Алиготе 40 мкл каждого антитела в 384-и источник пластины.
  3. Загрузите 384-а источник пластины на microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
  4. Загрузить 20 слайдов PATH микрочипов на microarrayer как цель.
  5. Установить microarrayer печати 48 идентичных подрешеток, в которых 27 антител и контроль белки обнаружены в трех экземплярах 9x9 картина (рис. 1E, 1F).
  6. Начать microarrayer печатать слайды антител микрочипов.
  7. Соберите слайды антител микрочипов, и хранить их в слайдах кассету с осушителем. Вакуумное уплотнение кассеты в полиэтиленовый пакет с помощью вакуумного герметик (Foodsaver).
  8. Хранить запечатанные слайды микрочипов при 4 ° С в холодильнике.

2. Химически блокируют антитело Microarray по предотвращению GBPПривязка к Capture Антитела

Анализ микрочипов начинается, как только микрочипов слайды химически заблокировали и длится около 8 часов. После запуска микрочипов анализ должен быть завершен (шаги от 2 до 8).

  1. Возьмите микрочипов выдвигается из холодильника, и уравновешивать их в комнатной температуре в течение 30 минут.
  2. Удалить слайд из ящика, и кратко промойте их в фосфатный буфер солевом рН 7,2 с 0,1% Твин-20 (PBST0.1) один раз в режиме слайд-умывальником, а затем в 15 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 5,0 с 0,1% Tween (CBT0 0,1) в последовательной форме. Инкубируйте слайды в CBT0.1 в течение 10 минут в слайд умывальника.
  3. Подготовить свежие 150 мМ NAIO 4 в 15 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 5,0 (ЦБ), и держать его в в слайд умывальником в холодильнике, избегая при этом свет перед использованием.
  4. Удалить слайд из ЦБ, и положить его в миску со свежими NAIO 4 с антителами сторонывверх. Накройте бассейн с алюминиевой фольгой, чтобы избежать свет, и инкубировать слайд бассейна в течение 2 часов с нежным встряхивании при 4 ° С в холодильнике.
  5. Подготовить 300 мл 10 мМ гидразида глутаминовой кислоты (блокатор) в ЦБ.
  6. Удалить слайд из бассейна, а также кратко промойте его в ЦБ 3 раза по 5 минут каждый раз в слайд умывальника.
  7. Инкубируйте слайды окон в умывальником в течение 2 часов при комнатной температуре с нежным тряски.
  8. Удалить слайды из бассейна, и мыть их с PBST0.1 течение 3 минут.

3. Блок без привязки к конкретным Microarray с бычьего сывороточного альбумина (БСА)

  1. Подготовить 300 мл 1% BSA в фосфатный буфер солевом рН 7,2 с 0,5% Tween (PBST0.5) в режиме слайд-раковина, и инкубировать слайд микрочипов в бассейне в течение 1 часа при комнатной температуре, осторожно встряхивая.
  2. Промойте слайдов PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
  3. Положите слайдна слайде стойку, и спина в 1200 мкг на центрифугирования в течение 2 минут, чтобы высушить микрочипов слайдов.

4. Выходные данные Воск сетки на Microarray слайдов для разделения подмассива

  1. Предварительное нагревание воска импринтера при 70 ° С в течение 5 минут.
  2. Загрузите заблокирован микрочипов слайдов в воск импринтера с антителами стороной на воск. Осторожно потяните за ручку, чтобы отпечаток воска на слайде равномерно.

5. Применение образцов сыворотки на слайд Microarray

  1. В шаге 2.4, подготовить образцы сыворотки или для анализа глико профилей в одном образце (5.1.1), или один глико epiptope измерения между несколькими образцами (5.1.2).
    1. В эксперименте на гликана profilings несколько сыворотки гликопротеинов в одном образце сыворотки с помощью нескольких ГБ (см. пример эксперимент 1), образцы сыворотки будут применяться на всех подрешеток. В этом случае, 40 мкл сыворотки достаточно разводят на 360 мкл PBS, содержащего 0,1%Твин-20, 0,1% Бридж 35, 100 мкг / мл IgG мыши, 100 мкг / мл IgG крысы, 100 мкг / мл IgG кролика, 100 мкг / мл IgG козы и 100 мкг / мл IgG осла. Этот объем является достаточным для применения 6 мкл разбавленной сыворотки решение на каждый подмассива.
    2. В ходе эксперимента на одной гликана измерения на нескольких белков сыворотки крови у нескольких образцов сыворотки с помощью одного GBP обнаружения (см. пример эксперимент 2). В этом случае, 1 мкл сыворотки достаточно разводят в 9 мкл PBS, содержащего 0,1% Твин-20, 0,1% Бридж 35, 100 мкг / мл IgG мыши, 100 мкг / мл IgG крысы, 100 мкг / мл IgG кролика , 100 мкг / мл IgG козы и 100 мкг / мл IgG осла. Этот объем является достаточным для применения 6 мкл разбавленной сыворотки решение на каждый подмассива.
  2. После восковой отпечаток на шаге 4, бережно относиться 6 мкл разведенного образца или контрольных образцов (PBST0.1) для каждого подмассива слайда. Инкубировать слайд в увлажненном кассету с мокрыми полотенцами бумаги при комнатной температурев течение 1 часа.
  3. Промойте слайд с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
  4. Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в течение 2 минут.

6. Применить Биотинилированные GBP (лектина или Anti-гликана антител) на слайд

  1. В шаге 2.4, подготовить 10μg/ml биотинилированного лектинов / ГБ в PBST0.1.
    1. В эксперименте профилирования гликана что зонд одного образца с несколькими лектинов (пример эксперимент 1), подготовить 350 мкл биотинилированного лектинов, что достаточно для всех подрешеток.
    2. В одном гликана эпитоп / биомаркеров скрининга в несколько образцов с помощью нескольких лектинов, готовить по 10 мкл каждого биотинилированного лектинов, что достаточно для одного подмассива.
  2. Применить 6 мкл разбавленного биотинилированного лектин (ы) для каждого подмассива слайд, и инкубировать в увлажненном окно слайд с мокрыми полотенцами бумаги при комнатной температуре в течение 1 часа.
  3. Промойте слайды с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый тименя.
  4. Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в центрифуге в течение 2 минут.

7. Применение краски Маркированный NeutrAvidin для обнаружения флуоресценции

  1. Подготовить 350 мкл Dylight 549 помечены NeutrAvidin, что достаточно для всех подрешеток.
  2. Применить 6 мкл Dylight 549 помечены NeutrAvidin на каждый подмассива, и инкубировать слайд в увлажненном кассету слайдов при комнатной температуре в течение 1 часа.
  3. Промойте слайд с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
  4. Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в центрифуге в течение 2 минут.

8. Получить Microarray слайдов изображения путем сканирования слайдов

  1. Сканирование слайдов с помощью флуоресценции сканер микрочипов на 10 мкм разрешением. Лазера и PMT настройки должны быть как можно более прочными, но не насыщение месте не наблюдается.

9. Извлечение данных и анализа

  1. Откройте изображение в ArrayPro 3.2. Настройка шаблона массива по массиву карта, которая показывает антитела пятна местах. Тщательно выровняйте каждый шаблон круга на соответствующем месте в изображении.
  2. Извлечение интенсивность каждого места в Excel файл для последующего анализа.

10. Представитель Результаты

Пример эксперимента 1

Гликозилирование профилирования несколько сыворотки гликопротеинов в гепатоцеллюлярной карциномы сыворотки образец с помощью химически заблокировали антител микрочипов с несколькими обнаружения лектинов.

Целью данного эксперимента является изучение индивидуального профиля гликозилирования 20 гликопротеинов в гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) сыворотки образец с помощью химически заблокировали антител микрочипов с лектин обнаружения. Антитела микрочипов, что содержит 48 идентичных подмассивы которые включают 26 антител и биотин-BSA, был разработан и изготовлен, как описано в SТЭП 1. Эти 26 антитела против 20 гликопротеинов сыворотки, которые определены как перспективные ранней диагностики значение для больных ГЦК с помощью лектинов на основе иммунопреципитации в сочетании с масс-спектрометрического идентификации белков 12, 32, как показано в таблице 1. Структура и расположение пятен антител печатается в трех экземплярах, по одному представителю подмассива показаны на рисунке 1E и 1F, соответственно. Два одинаковых слайды микрочипов, один не был химически заблокировали (рис. 1а), а другой был (рис. 1б), были использованы для выполнения такой же эксперимент профилирования гликозилирования для того, чтобы продемонстрировать важность химически блокирования процедуры анализа. Для химически заблокировали слайд (рис. 1б), эксперимент начался в шаге 2, ибо ни химически заблокировали слайд (рис. 1а), эксперимент начался с Шаг 3. Эксперимент проводился на followinг все шаги, описанные в протоколе, за исключением шага 5.1.2 и 6.1.2. В шаге 5.2, PBST0.1 контрольного образца был применен на подмассивы в графе 1 и 3, объединенных ГЦК сыворотки была применена на подмассивы в колонке 2 и 4, соответственно (как показано на рисунке 1G). Это сравнение, чтобы показать эффективность, эффективность процедуры, а также антигены сродство антител после химической блокировки. 22 биотинилированного лектинов (как показано в Таблице 1), характерных для различных гликанов 18, 20 были применены на каждом подмассива как показано на рисунке 1G для гликозилирования профилирования. Изображения химически заблокировали (рис. 1б) и не химически заблокировали (рис. 1А) микрочипы после анализа гликозилирования профилирования, следуя протоколу. Как показано в подмассивы в графе 1 и 3, не связанных с химически заблокировали микрочипов (рис. 1А и рисунок 1С), на которомтолько PBST0.1 была применена, большинство лектинов обязаны захватить антител, и показали очень высокий фон, сопоставимых с подмассивы в колонке 2 и 4, на котором сыворотки был применен. Невозможно получить информацию гликана профиль из этого слайда микрочипов. Напротив, когда тот же эксперимент был проведен на химически заблокировали слайд микрочипов антитела, подмассивы в графе 1 и 3, на котором только PBST0.1 была применена, большинство лектинов не показали или очень низкой привязки захвата антител, в то время как высокая антиген привязки по-прежнему наблюдается в подмассивы в колонке 2 и 4, на котором сыворотки был применен (рис. 1B и 1D). Это результат показал химически блокирование процедура была важным шагом Поэтому измерение гликанов на антитела захватили гликопротеинов. Следуя протоколу, гликозилирование профилей из 22 гликопротеинов в сыворотке ГЦК может быть получено.

Эксперимент 2

Экран для измененного fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров для дискриминации цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы пациентов.

Цель этого эксперимента для выявления измененных fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров, являющиеся дискриминационными по цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) пациентов. В отличие от эксперимента 1, в котором только один образец сыворотки был применен на каждый подмассивы и исследовал различные лектинов, в этом тесте, всего 40 различных образцов сыворотки с ГЦК и циррозом печени пациента наносится на каждый подмассива и исследовали с одной лектин (AAL ). Статистический анализ, такие как T тест, приемник-характеристической (ROC) кривой, это было сделано для оценки распределения или диагностических производительность гликана epiptope / биомаркеров на каждого белка во всех образцах сыворотки. Мы использовали тот же микрочипов антитела производятся в эксперименте 1, за исключением анти-CA19-9 и анти-Льюис Х антитела в этом исследовании. Экспериментаiment проводилась с сентября 2 Шаг 9, за исключением шага 5.1.1 и 6.1.1. Всего 40 образцов сыворотки от 20 циррозом печени и 20 больных ГЦК были применены наугад подмассива 48 подмассивы вместе с контрольными образцами PBS в качестве отрицательного контроля. Fucosylation каждого захваченного белков, то обнаруживается с помощью биотинилированного фукозы конкретных лектинов. Микрочипов изображение, показанное на рисунке 1 продемонстрирована лектин AAL только связывается с белками сыворотки, захваченные на микрочипов (рис. 2D), а захваченных антител (рис. 2Е). AAL обязательным интенсивности все места были затем экстрагировали и анализировали с помощью теста T и ROC кривые оценки эффективности fucosylation (AAL обязательным интенсивности) каждого из сывороточного белка на дискриминацию между ГЦК и циррозом групп. Результаты показали, что fucosylation из белка GP73 дал лучший различия между двумя группами р = 0,03 и площадь под-Кривая ROC кривой равна 0,72. Данный эксперимент показал, эта процедура является быстрым, эффективным методом гликана эпитоп / биомаркеров скрининг на нескольких образцов в течение нескольких белков.

ID Название реагента Сокращение Компания Каталог #
L1 Биотинилированные конканавалин ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Биотинилированные Бузина черная лектина СНС Vector Laboratories B-1305
L3 Биотинилированные объектива Culinaris агглютинин ДМС Vector Laboratories BK-2000
L4 Биотинилированный Ricinus Communis агглютинин я RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Биотинилированные алейрий Aurantia лектина AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Биотинилированные Erythrina Cristagalli лектина ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Биотинилированные Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia лектина II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Биотинилированные зародышей пшеницы агглютинин WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Биотинилированные Phaseolus Erythroagglutinin вульгарные PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Биотинилированные Phaseolus Leucoagglutinin вульгарные PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Biotinylated агглютинин арахиса ПНА Vector Laboratories BK-1000
L12 Биотинилированный Pisum Sativum агглютинин PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Биотинилированные Dolichos Biflorus агглютинин Администратор базы данных Vector Laboratories BK-1000
L14 Биотинилированные лектина дурмана Datura DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Биотинилированные софоры Japonica агглютинин SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Биотинилированные агглютинин сои SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Биотинилированные Solanum Tuberosum (картофеля) лектина STL Vector Laboratories BK-3000
L18 Биотинилированные Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia лектина я GSL Я Vector Laboratories BK-2000
L19 Биотинилированные Vicia Villosa лектина VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Биотинилированные Lycopersicon ESCULENTUM (томат) лектина НПВ Vector Laboratories BK-3000
L21 Биотинилированные Ulex Europaeus агглютинин я UEA я Vector Laboratories BK-1000
L22 Биотинилированные джакалин Джакалин Vector Laboratories BK-3000
A1 Коза F (аb ') 2 фрагментов анти-человеческий IgM, антител Fc5μ IgM Джексон Иммуно исследований 109-006-129
A2 Осел F (аb ') 2Frag анти-человеческий IgG (H + L) антител AB1 Джексон Иммуно исследований 709-006-149
A3 Мышь анти-человеческий IgG F (аb ') 2 моноклональных антител AB3 Джексон Иммуно исследований 209-005-097
A4 Коза анти-человеческий альфа-2-макроглобулина поликлональных антител A2M GeneTex GTX62924
A5 Кролик против человеческого альфа-1-антитрипсина поликлональных антител A1AT Ли Biosiences CA1T-80А
A6 Мышь анти-человеческий альфа-1-антитрипсина моноклональных антител A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Кролик против человеческого альфа-1-антитрипсина поликлональных антител ДЕЙСТВОВАТЬ NeoMarkers РБ-367-A1
A8 Кролик против человеческого альфа-1-античныйhymotrypsin поликлональных антител ДЕЙСТВОВАТЬ Fisher Scientific RB9213R7
A9 Мышь против человеческого трансферрина моноклональных антител Трансферрина GeneTex GTX101035
A10 Кролик против человеческого трансферрина поликлональных антител Трансферрина GeneTex GTX77130
A11 Коза против человека аполипопротеина J поликлональных антител ApoJ Abcam ab7610
A12 Мышь против человека GP73 моноклональных антител GP73 Abbott 14H4-23
A13 Мышь против человека GP73 моноклональных антител GP73 Santa Cruz Biotechnology INC SC-101 275
A14 Кролик против человеческого альфа-1-фетопротеин поликлональных антител AFP GenWay GWB-41C966
A15 Мышь анти-человеческий альфа-1-фетопротеин моноклональных антител AFP Фитцджеральд 10-A05A
A16 Мышь против человека hemopexin моноклональных антител Hemopexin Assaypro 60190-05011
A17 Мышь против человека glypican-3 (1G12), моноклональные антитела GPL3 Санта-Крус-Био SC-65443
A18 Мышь против человека кининогена (ЛМЗ), моноклональные антитела Кининогена Assaypro 20333-05011
A19 Кролик против человека MMP-21 моноклональных антител MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Мышь против человека CEACAM-1 моноклональные антитела CEACAM R & D Systems MAB1180
21 Крысы против человека DPPIV/CD26 моноклональных антител DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Мышь против человека пивка II моноклональных антител PIVICA Кристалл химических 8040
A23 Мышь против раково-эмбрионального антигена CEA США биологические C1300
A24 Мышь анти-CA125 антиген рака CA125 США биологические C0050-01D
A25 Мышь анти-CA19-9 рака антиген CA19-9 США биологические C0075-18
A26 Мышь против Льюиса х моноклональных антител Льюис X Calbiochem 434631
био Биотинилированные BSA (положительный контроль) Bio Самодельный N / A

Таблица 1. Список лектинов и антител, используемые в настоящем протоколе.

Название / реагент с оборудованием Компания Номер по каталогу
Non microarrayer контакт BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 микропланшет Рыбак 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ультратонкие нитроцеллюлозы coate микрочипов скользит Gentel PATH
Слайд Импринтер (опционально) Гель компании WSP60-1
Шейкер Рыбак 15-453-211
Центрифугировать Эппендорф 5804 000.013
Вставьте умывальника / Авто окрашивания блюд шм Съемная стойка Рыбак 08-812
Слайд инкубации камеры / предметное стекло окна Рыбак 03-448-5
Бридж 35, 30 / о% раствора в воде Acros Organics AC32958-0025
Твин-20 Рыбак P337-100
Периодатом натрия (NAIO 4) Сигма 311448
L-глутаминовая кислота γ-гидразида Сигма G-7257
Ацетат натрия безводный (CH 3 COONa) Сигма S2889
Бычьего сывороточного альбумина (БСА) Lampire биологической лаборатории 7500804
Фосфатного буфера солевым раствором (PBS) (10X) Denville Научные CP4390-48
Dylight 549 сопряженных NeutrAvidin Thermo 22837
Таблетки ингибитор протеазы коктейль Roche 4693159001
ChromPure человека IgG, Fc фрагмент Джексон Immunoresearch 009-000-008
ChromPure человека IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 009-000-003
ChromPure мышь IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 015-000-003
ChromPure мышь IgG, Fc фрагмент Джексон Immunoresearch 015-000-008
ChromPure кролика IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 017-000-003
Microarray сканер Tecan Л.С.: Перезагрузка

Таблица 2. Списокоборудования и реагентов, используемых в этом протоколе.

figure-protocol-1
Схема 1 Схема показывает лектин микрочипов антител основан гликана биомаркеров открытие процесса 1 (шаг 2 до 4): Блок антител микрочипов с блокаторами (Glu-гидразид) и BSA, 2 (Шаг 5):.. Применять сыворотки крови и захвата конкретные гликопротеинов со специфическими антителами, 3 (Шаг 6): применяется биотинилированного лектин (ы), 4 (Шаг 7): Probe биотинилированного AAL с Dylight 549 помечены NeutrAvidin для микрочипов изображений.

figure-protocol-2
Рисунок 1. Microarray изображения образца Эксперимент 1 гликозилирования профилирования несколько сыворотки гликопротеинов в ГЦК сыворотки образец с помощью химикосоюзника заблокирован антител микрочипов с несколькими лектин обнаружения. Два одинаковых слайды микрочипов, (А) ни химически заблокирован, или (б) химически заблокировали, как описано в шаге 2, и прошел через все шаги от 2 до 9 для гликозилирования профилирования, а также сравнение цели. (А) и (Б) микрочипов изображений, отсканированных на шаге 8 разрешением 10 микрон. (C) увеличить изображение первых двух строк ни химически заблокировали микрочипов слайдов (A), (D) увеличить изображение первых двух строк, не химически заблокировали микрочипов слайдов (B)), (E) Схема расположения антител в каждой подрешетки, (F) множество карт: расположение каждого антитела в подмассива, каждое антитело имя представляет собой 3 места; (G), сыворотки и лектин местоположение: Диаграмма показывает, какие подмассива каждого образца сыворотки и лектин был применен на.

figure-protocol-3
Рисунок 2. Microarray изображенийпример эксперимент 2 экрана измененное fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров, являющиеся дискриминационными по цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы пациентов. Анализ микрочипов проводились, как описано в примере Эксперимент 2 раздела. (А) все изображение слайд микрочипов слайд с шага 8, (б) схема расположения антител в каждой подрешетки (C) массив карт: расположение каждого антитела в подмассива, каждое антитело имя представляет 3 места; (D) зум-в образе подмассива, которые инкубировали с сывороткой образца, (E) зум-в образе подмассива, что инкубируют с PBS контроля.

figure-protocol-4
Рисунок 3. Гликан профилирования результаты эксперимента образец 1. Каждая гистограмма представляют собой лектин обязательным профилем (или гликана профилей) одного из 20 проверенных белка. Всего 22 различных лектинов были использованы для анализа йэлектронной гликана профиль каждого белка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Белка-мишени и выбор захвата антител

До анализа микрочипов антитела, некоторые реактивы и материалы, необходимые для рассмотрения и подготовки. Для разработки антител микрочипов для гликана профилирования или гликана биомаркеров скрининга, панель антител, специфичных к гликопротеин кандидаты должны определяться в соответствии с литературой или с предыдущими результатами. Эти антитела, как правило, приобретенных у различных производителей, таких как R & D Systems и т.д. IgGs предпочитают ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Институтом гепатитов и вирусных исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ID Название реагента Сокращение Компания Каталог #
L1 Биотинилированные конканавалин ConA Vector Laboratories BK-1000
L2 Биотинилированные Бузина черная лектина СНС Vector Laboratories B-1305
L3 Биотинилированные объектива Culinaris агглютинин ДМС Vector Laboratories BK-2000
L4 Биотинилированный Ricinus Communis агглютинин я RCA Vector Laboratories BK-1000
L5 Биотинилированные алейрий Aurantia лектина AAL Vector Laboratories B-1395
L6 Биотинилированные Erythrina Cristagalli лектина ECL Vector Laboratories BK-3000
L7 Биотинилированные Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia лектина II GSL II Vector Laboratories BK-3000
L8 Биотинилированные зародышей пшеницы агглютинин WGA Vector Laboratories BK-1000
L9 Биотинилированные Phaseolus Erythroagglutinin вульгарные PHA-E Vector Laboratories BK-2000
L10 Биотинилированные Phaseolus Leucoagglutinin вульгарные PHA-L Vector Laboratories BK-2000
L11 Биотинилированные агглютинин арахиса ПНА Vector Laboratories BK-1000
L12 Биотинилированный Pisum Sativum агглютинин PSA Vector Laboratories BK-2000
L13 Биотинилированные Dolichos Biflorus агглютинин Администратор базы данных Vector Laboratories BK-1000
L14 Биотинилированные лектина дурмана Datura DSL Vector Laboratories BK-3000
L15 Биотинилированные софоры Japonica агглютинин SJA Vector Laboratories BK-2000
L16 Биотинилированные агглютинин сои SBA Vector Laboratories BK-1000
L17 Биотинилированные Solanum Tuberosum (картофеля) лектина STL Vector Laboratories BK-3000
L18 Биотинилированные Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia лектина я GSL Я Vector Laboratories BK-2000
L19 Биотинилированные Vicia Villosa лектина VVL Vector Laboratories BK-2000
L20 Биотинилированные Lycopersicon ESCULENTUM (томат) лектина НПВ Vector Laboratories BK-3000
L21 Биотинилированные Ulex Europaeus агглютинин я UEA я Vector Laboratories BK-1000
L22 Биотинилированные джакалин Джакалин Vector Laboratories BK-3000
A1 Коза F (аb ') 2 фрагментов анти-человеческий IgM, антител Fc5μ IgM Джексон Иммуно исследований 109-006-129
A2 Осел F (аb ') 2 Frag анти-человеческий IgG (H + L)tibody AB1 Джексон Иммуно исследований 709-006-149
A3 Мышь анти-человеческий IgG F (аb ') 2 моноклональных антител AB3 Джексон Иммуно исследований 209-005-097
A4 Коза анти-человеческий альфа-2-макроглобулина поликлональных антител A2M GeneTex GTX62924
A5 Кролик против человеческого альфа-1-антитрипсина поликлональных антител A1AT Ли Biosiences CA1T-80А
A6 Мышь анти-человеческий альфа-1-антитрипсина моноклональных антител A1AT Sigma Aldrich SAB4200198
A7 Кролик против человеческого альфа-1-антитрипсина поликлональных антител ДЕЙСТВОВАТЬ NeoMarkers РБ-367-A1
A8 Кролик против человекаальфа-1-антихимотрипсином поликлональных антител ДЕЙСТВОВАТЬ Fisher Scientific RB9213R7
A9 Мышь против человеческого трансферрина моноклональных антител Трансферрина GeneTex GTX101035
A10 Кролик против человеческого трансферрина поликлональных антител Трансферрина GeneTex GTX77130
A11 Коза против человека аполипопротеина J поликлональных антител ApoJ Abcam ab7610
A12 Мышь против человека GP73 моноклональных антител GP73 Abbott 14H4-23
A13 Мышь против человека GP73 моноклональных антител GP73 Santa Cruz Biotechnology INC SC-101 275
A14 Кролик против человеческого альфа-1 fetoprotein поликлональных антител AFP GenWay GWB-41C966
A15 Мышь анти-человеческий альфа-1-фетопротеин моноклональных антител AFP Фитцджеральд 10-A05A
A16 Мышь против человека hemopexin моноклональных антител Hemopexin Assaypro 60190-05011
A17 Мышь против человека glypican-3 (1G12), моноклональные антитела GPL3 Санта-Крус-Био SC-65443
A18 Мышь против человека кининогена (ЛМЗ), моноклональные антитела Кининогена Assaypro 20333-05011
A19 Кролик против человека MMP-21 моноклональных антител MMP21 Epitomic 1955-1
A20 Мышь против человека CEACAM-1 моноклональных антителу CEACAM R & D Systems MAB1180
A21 Крысы против человека DPPIV/CD26 моноклональных антител DPPIV R & D Systems MAB22441
A22 Мышь против человека пивка II моноклональных антител PIVICA Кристалл химических 8040
A23 Мышь против раково-эмбрионального антигена CEA США биологические C1300
A24 Мышь анти-CA125 антиген рака CA125 США биологические C0050-01D
A25 Мышь анти-CA19-9 рака антиген CA19-9 США биологические C0075-18
A26 Мышь против Льюиса х моноклональных антител Льюис X Calbiochem 434631
био Биотинилированные BSA (положительный контроль) Bio Самодельный N / A

Таблица 1. Список лектинов и антител, используемые в настоящем протоколе.

Название / реагент с оборудованием Компания Номер по каталогу
Non microarrayer контакт BioDot Inc sciFLEXARRAYER
384 микропланшет Рыбак 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
Ультратонкие нитроцеллюлозы coate микрочипов скользит Gentel PATH
Слайд Импринтер (опционально) Гель компании WSP60-1
Шейкер Рыбак 15-453-211
Центрифугировать Эппендорф 5804 000.013
Слайд умывальника / Авто окрашивания блюд со съемными стойку Рыбак 08-812
Слайд инкубации камеры / предметное стекло окна Рыбак 03-448-5
Бридж 35, 30 / о% раствора в воде Acros Organics AC32958-0025
Твин-20 Рыбак P337-100
Периодатом натрия (NAIO 4) Сигма 311448
L-глутаминовая кислота γ-гидразида Сигма G-7257
Ацетат натрия безводный (CH 3 COONa) Сигма S2889
Бычьего сывороточного альбумина (БСА) Lampire биологической лаборатории 7500804
Фосфатного буфера солевым раствором (PBS) (10X) Denville Научные CP4390-48
Dylight 549 сопряженных NeutrAvidin Thermo 22837
Таблетки ингибитор протеазы коктейль Roche 4693159001
ChromPure человека IgG, Fc фрагмент Джексон Immunoresearch 009-000-008
ChromPure человека IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 009-000-003
ChromPure мышь IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 015-000-003
ChromPure мышь IgG, Fc фрагмент Джексон Immunoresearch 015-000-008
ChromPure кролика IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 011-000-003
ChromPure Donkey IgG, все молекулы Джексон Immunoresearch 017-000-003
Microarray сканер Tecan Л.С.: Перезагрузка

Таблица 2. Перечень оборудования и реагентов, используемых в этом протоколе.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to protein glycosylation analysis: a path through the maze. Nat. Chem. Biol. 6, 713-723 (2010).
  3. Shental-Bechor, D., Levy, Y. Effect of glycosylation on protein folding: a close look at thermodynamic stabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 8256-8261 (2008).
  4. Hossler, P., Khattak, S. F., Li, Z. J. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 19, 936-949 (2009).
  5. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nat. Rev. Microbiol. 8, 765-778 (2011).
  6. Sola, R. J., Griebenow, K. Effects of glycosylation on the stability of protein pharmaceuticals. J. Pharm. Sci. 98, 1223-1245 (2009).
  7. Li, C., Lubman, D. M. Analysis of serum protein glycosylation with antibody-lectin microarray for high-throughput biomarker screening. Methods Mol. Biol. 723, 15-28 (2011).
  8. Dwek, M. V., Jenks, A., Leathem, A. J. A sensitive assay to measure biomarker glycosylation demonstrates increased fucosylation of prostate specific antigen (PSA) in patients with prostate cancer compared with benign prostatic hyperplasia. Clin. Chim. Acta. 411, 1935-1939 (2010).
  9. Drake, P. M. Sweetening the pot: adding glycosylation to the biomarker discovery equation. Clin. Chem. 56, 223-236 (2010).
  10. Kim, Y. -P., Park, S., Oh, E., Oh, Y. -H., Kim, H. -S. On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles. Biosensors & Bioelectronics. 24, 1189-1194 (2009).
  11. Boland, M., Rudd, P. M. Disease related glycosylation changes and biomarker discovery: challenges and possibilities in an emerging field. Editorial. Dis. Markers. 25, 189-192 (2008).
  12. Norton, P. A. N-linked glycosylation of the liver cancer biomarker GP73. J. Cell Biochem. 104, 136-149 (2008).
  13. Nakagawa, T. Glycomic analysis of alpha-fetoprotein L3 in hepatoma cell lines and hepatocellular carcinoma patients. J. Proteome Res. 7, 2222-2233 (2008).
  14. Durazo, F. A. Des-gamma-carboxyprothrombin, alpha-fetoprotein and AFP-L3 in patients with chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol Hepatol. 23, 1541-1548 (2008).
  15. Kobayashi, M. Fucosylated fraction of alpha-fetoprotein, L3, as a useful prognostic factor in patients with hepatocellular carcinoma with special reference to low concentrations of serum alpha-fetoprotein. Hepatol. Res. 37, 914-922 (2007).
  16. Maisey, N. R. CA19-9 as a prognostic factor in inoperable pancreatic cancer: the implication for clinical trials. Br. J. Cancer. 93, 740-743 (2005).
  17. Talar-Wojnarowska, R. Clinical value of serum neopterin, tissue polypeptide-specific antigen and CA19-9 levels in differential diagnosis between pancreatic cancer and chronic pancreatitis. Pancreatology. 10, 689-694 (2010).
  18. Chen, S. Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays. Nat. Methods. 4, 437-444 (2007).
  19. Shao, C. Antibody microarray analysis of serum glycans in esophageal spuamous cell carcinoma cases and controls. Proteomics Clinical Applications. 3, 923-931 (2009).
  20. Chen, S., Haab, B. B. Analysis of glycans on serum proteins using antibody microarrays. Methods Mol. Biol. 520, 39-58 (2009).
  21. Yue, T. The Prevalence and Nature of Glycan Alterations on Specific Proteins in Pancreatic Cancer Patients Revealed Using Antibody-Lectin Sandwich Arrays. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 1697-1707 (2009).
  22. Wolf-Yadlin, A., Sevecka, M., MacBeath, G. Dissecting protein function and signaling using protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 398-405 (2009).
  23. Richard, E. Proteomics as Applied to Inherited Metabolic Diseases. Current Proteomics. 6, 140-153 (2009).
  24. Nolen, B., Winans, M., Marrangoni, A., Lokshin, A. Aberrant tumor-associated antigen autoantibody profiles in healthy controls detected by multiplex bead-based immunoassay. Journal of Immunological Methods. 344, 116-120 (2009).
  25. Kuno, A. Focused Differential Glycan Analysis with the Platform Antibody-assisted Lectin Profiling for Glycan-related Biomarker Verification. Molecular & Cellular Proteomics. 8, 99-108 (2009).
  26. Hsu, K. -L., Mahal, L. K. Sweet tasting chips: microarray-based analysis of glycans. Current Opinion in Chemical Biology. 13, 427-432 (2009).
  27. Borrebaeck, C. A. K., Wingren, C. High-throughput proteomics using antibody microarrays: an update. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7, 673-686 (2007).
  28. Sanchez-Carbayo, M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumor Biology. 31, 103-112 (2010).
  29. Porter, A. A motif-based analysis of glycan array data to determine the specificities of glycan-binding proteins. Glycobiology. 20, 369-380 (2010).
  30. Maupin, K. A. Glycogene Expression Alterations Associated with Pancreatic Cancer Epithelial-Mesenchymal Transition in Complementary Model Systems. Plos One. 5, (2010).
  31. Sevecka, M., Wolf-Yadlin, A., MacBeath, G. Lysate Microarrays Enable High-throughput, Quantitative Investigations of Cellular Signaling. Molecular & Cellular Proteomics. 10, (2011).
  32. Wang, M. Novel fucosylated biomarkers for the early detection of hepatocellular carcinoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 18, 1914-1921 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemically Blocked Antibody MicroarrayGlycosylation ProfilingGlycan Binding Protein DetectionAntibody Glycan BlockingBiotinylated Lectin DetectionFluorescence Microarray ScannerGlycoprotein CaptureMultiplexed High throughputHCC Serum AnalysisGlycan Binding Proteins

Related Articles