Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генетические экрана изолировать Toxoplasma гондий Клетки-хозяина Мутанты Egress

12.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3807

⸱

8 февраля 2012 г.

 , 
1Department of Biology, Boston College

В этой статье

Краткое содержание

Вперед генетики мощный метод, чтобы разгадать молекулярном уровне, как Toxoplasma Выходов из клетки-хозяина. Протоколы предоставляются химически mutagenize паразитов, обогащают для мутантов с дефектами в индуцированной выхода и проверки фенотип клонировали мутантов.

Аннотация

Широко распространенный облигатный внутриклеточный протозойный паразит Toxoplasma gondii вызывает оппортунистические заболевания у пациентов с иммунодефицитом, а также пороки развития при врожденной инфекции. Литический цикл репликации характеризуется тремя стадиями: 1. активное проникновение в нуклеированную клетку-хозяина; 2. репликация внутри клетки-хозяина; 3. активный выход из клетки-хозяина. Механизм выхода все чаще рассматривается как уникальный, строго регулируемый процесс, который до сих пор недостаточно изучен на молекулярном уровне. Сигнальные пути, лежащие в основе выхода, были охарактеризованы с использованием фармакологических агентов, воздействующих на различные аспекты этих путей1-5. Таким образом, было выявлено несколько независимых триггеров выхода, которые в итоге приводят к высвобождению внутриклеточного Ca2+ — сигнала, который также критически важен для проникновения в клетку-хозяина6-8. Это понимание легло в основу подхода с поиском генов-кандидатов, что привело к идентификации кальций-зависимой протеинкиназы (CDPK) растительного типа, участвующей в выходе9. Кроме того, несколько недавних прорывов в понимании процесса выхода были достигнуты с помощью (химических) генетических подходов10-12. Чтобы объединить богатый массив фармакологических данных с растущей генетической доступностью Toxoplasma, недавно мы разработали метод скрининга, позволяющий проводить обогащение популяций мутантов паразита с дефектом выхода из клетки-хозяина13. Хотя химический мутагенез с использованием N-этил-N-нитрозомочевины (ENU) или этилметансульфоната (EMS) десятилетиями применялся в изучении биологии Toxoplasma11,14,15, только недавно генетическое картирование мутаций, лежащих в основе фенотипов, стало рутинным процессом16-18. Более того, путем создания температурно-чувствительных мутантов можно детально изучить основные процессы и напрямую идентифицировать соответствующие гены. Такие мутанты ведут себя как дикий тип при пермиссивной температуре (35 °C), но не способны к пролиферации при рестриктивной температуре (40 °C) вследствие изучаемой мутации. Здесь мы демонстрируем новый метод фенотипического скрининга для изоляции мутантов с температурно-чувствительным фенотипом выхода13. Основная сложность скрининга выхода заключается в отделении вышедших паразитов от тех, что остались внутри, что затруднено быстрой повторной инвазией и общей склонностью паразитов прилипать к клеткам-хозяевам. Ранее разработанный скрининг выхода основывался на трудоемкой серии этапов биотинилирования для отделения внутриклеточных паразитов от внеклеточных11. Этот метод также не позволял создавать условных мутантов, что приводило к слабым фенотипам. Описанный здесь метод преодолевает проблему сильного прикрепления выходящих паразитов путем включения конкурентного гликана, декстрансульфата (DS), который препятствует прилипанию паразитов к клетке-хозяина19. Более того, внеклеточные паразиты специфически уничтожаются пирролидиндитиокарбаматом (PDTC), который не повреждает внутриклеточных паразитов20. Таким образом, благодаря новому фенотипическому скринингу для специфической изоляции мутантов паразита с дефектами индуцированного выхода, теперь можно в полной мере использовать возможности генетики для раскрытия молекулярных механизмов выхода из клетки-хозяина.

Протокол

Обзор

Протоколы предоставляются сначала определить дозы мутагенов приводит к 70% гибели паразитов (протокол 1). Следующая процедура предусмотрена для обогащения индуцированных мутантов выход из мутагенизированный бассейн паразита (протокол 2, рисунок 2). Это сопровождается протоколом проверить частоту выхода мутантов в бассейне обогащенный, или для проверки выхода фенотипа в отдельных мутантов (протокол 3). Наконец, протокол обеспечивает для создания одного клона паразита из обогащенного населения путем ограничения разведения (протокол 4).

1. Титрование мутаген

Будьте особенно осторожны, такие как двойные перчатки при работе с высоко мутагенных соединений и жидкостей. Сбор жидких отходов отдельно для надлежащей утилизации.

  1. Инокулировать T25 культуры тканей колбы сливающийся с человеческой плоти фибробластов (HFF) клеток в 1 мл свежей лизируются tachyzoites и расти 18-25 часов при температуре 37 °; С в 5% CO 2 в Ed1 среды (D-MEM с добавлением 1% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 0,2 мМ L-глутамина, 50 ЕД / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина и 0,25 мкг / мл амфотерицина ). Смотрите Роос и соавт. для общего роста и СМИ HFF клеток и паразитов, 21.
  2. Замените среду с 10 мл 0,1% эмбриональной телячьей сыворотки среде (разбавленной Ed1 1:10 в D-MEM) и оставить в увлажненном 37 ° C инкубатор под 5% CO 2 (так называемый "37 ° C инкубатор" здесь и далее) в течение 10 минут .
  3. Добавить 0, 12,5, 25, 50 или 100 мкл ЕНУ (1 М фондовой ДМСО) или EMS (1 М фондовой ДМСО) в колбу (мутаген рабочего разведения будет 1.25, 2.5, 5 и 10 мм, соответственно). Добавить DMSO до 100 мкл в каждую колбу. Выдержите в течение 4 часов при 37 ° C инкубатора.
  4. Промыть три раза в течение 10 секунд при комнатной температуре путем промывки монослоя с 10 мл холодного PBS (предварительно охлаждается при температуре 4 ° С).
  5. Добавьте 5 мл PBS, очистить монослоя свободно с резиновой полицейский (ячейка экрапертуры), проходят через клетки Царапины на 26,5 игла G физически удалить паразита из фибробластов (клип с вала вне иглы с тяжелыми ножницами обязанность не подвергать иглы) и фильтра с 3,0 мкм поликарбоната фильтр. Несколько проходов иглой позволит повысить эффективность выпуска паразитов из клетки-хозяина.
  6. Считайте концентрации паразитов помощью гемоцитометра. Пусть паразиты решить в течение 5 мин в hemocytomer до подсчета голосов.
  7. Разбавить до 10000 паразитов паразиты в 3 мл в Ed1 (по 10 мл 33 333 паразитов нужно).
  8. Инокулировать одной скважины в 6-луночный планшет с 3 мл разведенной паразитов (содержащих 10 000 паразитов). Поочередно разводить паразитов в 10 раз по 3 скважины в 6-луночного планшета сливающийся с клетками HFF содержащие 2,7 мл Ed1 путем передачи 300 мкл из первой скважины. Оставьте плиты спокойно в 37 ° C инкубаторе в течение 7 дней.
  9. Аспирируйте среды, исправить 15 мин с 3 мл / и 100% этанола, пятнос 3 мл / и кристалл фиолетовый раствор (12,5 г кристаллического фиолетового в 125 мл этанола, смешать с 500 мл 1% оксалата аммония) в течение 15 минут, смойте 3 мл / и PBS (1 минута) и сухой воздух. Все при комнатной температуре.
  10. Граф бляшек и выберите концентрации мутагенов, необходимых для достижения выживание 30% выставленных паразитов (70% убийстве дозировка: см. Рисунок 1). Дозировка 70% убийств было использовано исторически 14 и индуцированных менее 100 точечных мутаций в геноме (Farrell, Marth, Gubbels и соавт., Рукопись представлена).

2. Обогащение выхода мутантов (рис. 2)

  1. Выполните мутагенез, как описано выше, с использованием дозы мутагенов вызывать 70% убийств. Расти мутагенизированный населения за один проход в новую колбу клеток хозяина.
  2. Инфекция T25, HFF сливной колбу с культурой ткани 120000 свежих лизируются паразитов мутагенизированный населением в 10 мл Ed1. Выдержите в течение 2 часов в 35 ° C инкубатор под 5% CO2 и увлажнение (с hereon под названием "35 ° C инкубатор").
  3. Аспирируйте среднего и промыть 10 секунд с 10 мл холодного PBS, а затем добавить 10 мл Ed1 среде с 25 мг / мл сульфата декстрана (DS) 13. Выдержите в течение 26 часов в 40 ° C инкубатор под 5% CO 2 и увлажненный (от hereon под названием "40 ° C инкубатор").
  4. Подготовка рабочего раствора выход усилителей. Развести выход индуктором выбор на рабочей концентрации в 15 мл Сокол пробирку, содержащую 10 мл HBSSc дополнена с 25 мг / мл DS. Предварительно теплой разведения в течение 30 мин при 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 для работы концентрациях.
  5. Аспирируйте среды от паразитов-инфицированные колб и добавить предварительно нагретой выход индуктор решение. Инкубируйте в 37 ° C инкубатор для времен, указанных в таблице 1.
  6. Аспирируйте среднего и промыть 10 секунд с 10 мл холодного PBS, а затем добавить 10 мл Ed1 дополнено 25 мг / мл DS и 50 мкМ пирролидина дитиокарбаматных (PDTC: объявлениег 5 мкл 100 мМ PDTC фондовой PBS) 13. Инкубировать 5 часов 35 ° C инкубатора.
  7. Аспирируйте среднего и промыть 10 секунд один раз 10 мл PBS (комнатной температуры), а затем добавить 10 мл Ed1 среды. Положите колбы обратно в 35 ° C до инкубатор паразитов уничтожить монослоя: дрожание колбы в день. Это восстановление занимает около 7 дней.

3. Проверка мутантных фенотипов на выходе анализов

После выполнения обогащения экран и растут обогащение населения за один проход в HFF клеток, фенотип должны быть подтверждены на выходе 11,13 анализа. Этот анализ должен также использоваться для проверки одного клона после протокол 4.

  1. Инокулировать 20000 паразитов на лунку в 24-луночного планшета содержащие вырожденные клетки HFF, выращенные на покровных (1 мл средней Ed1 на лунку). Инкубируйте 8 часов в 35 ° C инкубатор затем передать в 40 ° C инкубаторе в течение 24 часов.
  2. Промыть 1 мл / и PBS (10 секунд при комнатной температуре). Добавить 1 мл выход индукторов (в том числе ДМСО только отрицательный контроль), предварительно нагревают и разбавляют в HBSSc и инкубировать раз описаны в таблице 1.
  3. Аспирируйте среднего и зафиксировать с 1 мл / и 100% метанола в течение 15 мин при комнатной температуре.
  4. Если родитель паразитов выражения autofluorescent белка были использованы для мутагенеза, переходите к шагу # 3.5 13. Если не флуоресцентный белок выразил паразиты были использованы в качестве материнской линии, пятна фиксированной покровных с Diff-Quick пятно в течение 1 мин при комнатной температуре 11.
  5. Вымойте 5 мин с 1 мл / и PBS в течение 24-луночного планшета при комнатной температуре.
  6. Для флуоресцентного белка выражения паразитов: быстро промыть покровное в DDH 2 O (погружение) и установить на слайдах под gelmount для защиты сигнала флуоресценции. Для быстрого Diff-окрашенных паразитов, промыть 10 секунд на 100% этанола и пусть воздушно-сухой перед установкой на слайде.
  7. Используя (флуоресценция) микроскопа с40-60x целью подсчитать процент вакуоли egressed против вакуолей, которые остались внутриклеточной (см. Рисунок 4).

4. Клонирование выход мутантов предельного разбавления

После проверки фенотипа обогащенного выход мутант населения, использующего протокол 3 поликлональных населения должны быть записаны на одном получения клонов паразита.

  1. Граф паразита населения в гемоцитометре и разбавить до концентрации 500 паразитов на миллилитр Ed1 среды.
  2. В 384-луночного планшета содержащих сливной монослоя клеток HFF, замените носитель с 40 мкл / лунку Ed1 среде с использованием многоканальной пипеткой. Как показано на рисунке 5, четыре поликлональных популяций могут быть клонированы в пластинку следующим образом: пипеткой 40 мкл / лунку разбавленного мутант 1 в скважинах C3-C12, мутант 2 в скважинах C13-C22, мутант 3 в скважинах H3-H12, и мутант 4 в скважинах H13-H22 (конец объема скважин в настоящее время 80 мкл). С помощью многоканальной пипетки, пипетки зольution вверх и вниз в 5 раз, а затем перенести 40 мкл на строку ниже начальной строке (строка из C в D или строки Н I). Продолжайте это в 2 раза серийных разведений через ряд G (мутанты, 1 и 2) или строки N (мутанты, 3 и 4). Откажитесь от дополнительных 40 мкл с последнего ряда. Инкубируйте в 35 ° C инкубатора в течение 7-10 дней, не нарушая пластины.
  3. Проверьте скважин на инвертированный микроскоп с 10-20х цель на наличие одной таблички, видно как "дыры" в монослое.
  4. Возьмите 4 скважины в мутанта с одной доски и передавать паразитов в колбу культуры тканей сливающийся с клетками HFF и наполнен Ed1 среды. Рост паразитов в 35 ° C инкубатора; потрясти колбы ежедневно, чтобы разогнать внеклеточной паразитов. Это обычно занимает от 7 дней.

5. Представитель Результаты

Мутагенов ЕНУ и EMS не стабильны при хранении в течение длительного периода времени. Таким образом, тестирование мутагенного силуакции имеет решающее значение для получения воспроизводимых результатов. Типичные результаты титрования и убийство кривые для ЕНУ и EMS показано на рисунке 1. Тем не менее, рекомендуется проводить тесты доски для каждого эксперимента мутагенеза чтобы убедиться, что соответствующие дозы были использованы. Для поддержания разнообразия в популяции паразита мутагенизированный, важно, чтобы продолжить выход мутантов экране как можно быстрее. Как правило, за один проход паразитов в новой колбе проводится, чтобы выжить паразиты восстановления прежде, чем идти вперед с экрана. Следует иметь в виду, что делать это приведет к разделению мутантов. Поэтому не исключено, что несколько клонального мутантов изолированы после завершения всей процедуры содержат одни и те же генотипа. Чтобы избежать изоляции же мутант несколько раз рекомендуется изолировать только один мутантный выход в мутагенеза, если их фенотипа (например, чувствительность дифференциального выхода индуктор) являютсяочень отличаются друг от друга. С другой стороны, не каждый экран приводит к изоляции мутантов с нужными фенотипа. В частности, Ca 2 +-ионофором А23187 устойчивый фенотип встречается редко и требует нескольких экспериментов мутагенеза и экраны для изоляции одного мутанта выход. Поэтому рекомендуется выполнять 5-10 мутагенеза и экран эксперименты параллельно.

Обогащение власть на экране была проверена путем смешивания известный выход мутантов дикого типа паразитов в различных соотношениях. Эти смеси были подвергнуты экрана и частота мутантного фенотипа в популяции обогащенного оценивали. При использовании дикого типа паразитов выражения цитоплазматических ППП и мутантов линии выражения цитоплазматических YFP случаев может быть быстро установлена ​​с помощью проточной цитометрии (рис. 3) 13. Результаты показывают, что мутантный фенотип может быть регулярно, обогащенного до 80% чистоты, начиная с 1 выход мутантов паразита на 10000 дикого типа рarasites 13. Однако, когда выход мутантов: дикий тип паразита начала соотношении 1:100000 паразитов, изолированной популяции составляет всего 1-2% (1:100) мутантов выход. Таким образом, обогащение власть экрана составляет 1000 раз. Так как экран начинает с прививкой 120000 паразитов, из которых обычно 70% жизнеспособных, мы обычно выполняют два этапа обогащения. Изолированной паразитов выросло с обогащением раундов. Эта процедура приводит к 100% мутантных населения даже тогда, когда, начиная с выхода 1:1000000 мутант: дикий тип паразитов.

Выход теста для проверки и характеризуют фенотипов требует множества клетки-хозяина инфекция, которая позволяет дифференцировать отдельных вакуолей. Это особенно важно при анализе условий с высоким процентом выхода, как отдельных паразитов разбросаны вокруг. Как показано на рисунке 4, если egressed население не очень хорошо отделены легко недооценить процентисходящего от считать двух egressed вакуолей как одна амеба. Так как выход и вторжения являются взаимосвязанными процессами, и некоторые чувствительные к температуре фенотипов отображения мягкий фенотип при более низкой температуре, не все мутанты будут иметь аналогичные эффективности вторжения. Такие мутанты поэтому должны быть привиты в несколько раз более высокие дозы для получения достаточно высокой плотности вакуоль для точной оценки их выхода фенотипа. Кроме того, некоторые индукторы выход не эффективно стимулировать выход из вакуолей, содержащих четыре или меньше паразитов. Таким образом, важно, что вакуоли содержат восемь паразитов или более при запуске выход анализа. В нашей лаборатории мы мутанты экран изолированы частности выход усилителя с другими усилителями выход. По профилирования их перекрестной реактивности мутантов могут быть сгруппированы в различные классы. Наконец, не все мутанты выход будет чувствительных к температуре. В частности мутантов изолировать выход индукторы запуска шагов до выхода intracellulaГ Са 2 + склонны к не-чувствительных к температуре фенотипов. Это связано с параллельным путям, что может привести к выходным до сигнала сходится на выпуске внутриклеточного Са 2 +.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Химическая мутаген доза титрования. Анализы А. Налет проводится в 6-луночный планшет с использованием различных концентраций EMS и различного числа паразитов на одну скважину, как указано. Белые пятна образуются бляшки паразита в монослое HFF. B, C. Кривые выживаемости паразитов при воздействии различных доз EMS (B) и ЕНУ (C). Выживаемость оценивалась по налета анализов. Дозировка вызывая 70% убийств выбран для мутагенеза экспериментов. Средние трех независимых экспериментах + / - стандартное отклонение показано на рисунке.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Схематическое изображение выход мутантов экран обогащения. Температура указана на оси ординат, а время прогресс представлен оси абсцисс. Зеленый паразитов отражают выход мутантов паразитов, красный паразитов отражают дикого типа паразитов. Временные изменения в условия и стимуляции выхода индуктор указаны в верхней и отмечены стрелками на синей линии отражает температурный профиль. Принятые от Eidell соавт. 13.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Типичные обогащения выход мутант фенотипы. Обогащению результаты выхода мутантов смешивается с диким типом паразитов в различных соотношениях (оси Х). Процент выхода мутант фенотипы населения выросли после того, как на экране строится на оси ординат и оценивали с помощью проточной цитометрии (выход мутантов паразитов выразил цитоплазматических YFP, дикого типа паразитов выразил суtoplasmic RFP). Результаты трех независимых экспериментов представлены красные, синие и зеленые точки данных. Принятые от Eidell соавт. 13.

figure-protocol-4
Рисунок 4. Типичные результаты анализа выход. . Стрелками отмечены четыре нетронутыми вакуоли содержащие 4-8 паразитов. B. Стрелками отмечены четыре группы рассеянного паразитов отражает четыре независимых egressed вакуоли. Выхода было вызвано А23187 (B) или DMSO в качестве отрицательного контроля (A). Паразиты выразить цитоплазматических YFP 22.

figure-protocol-5
Рисунок 5. Последовательные разбавления для клональной линии паразита. Четыре поликлональных популяций (красный, синий, желтый, зеленый) серийно разводили в одном 384-луночного планшета сливающийся с HFF клеток. Ряд C, и я получите 10 паразитов на одну скважину иэто в 2 раза разбавленным (40 мкл + 40 мкл) до строки H и N, соответственно. Оттенки серого указывает на снижение количества паразитов на одну скважину. Как правило, одного клона находятся в рядах DF и JL.

Соединение Акции Рабочая концентрация мкл необходимые для T25 (10 мл) Время инкубации (мин)
DVB-T 1 М в ДМСО 5 мМ 50 15
этанол 190 Доказательство 5% 500 30
А23187 2 мм в ДМСО 1 мкМ 5 5
нигерицина * 2 мм в ДМСО 10 мкМ 50 30

* Нигерицина не могут быть использованы в обогащаютМент экране паразиты не выживают нигерицина стимуляции; использовать только нигерицина в проверке выхода мутантов.

Таблица 1. Egress индукторов, используемых в процедурах. Развести в 10 мл HBBSc содержащего 25 мг / мл DS на экране, или нет DS для проверки мутант (выход анализа). Все соединения от Sigma-Aldrich.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный протокол обеспечивает эффективный способ изолировать Toxoplasma мутантов с выходным дефекта. Мы успешно изолировать мутантов по различным этапам пути выхода, некоторые из которых имеют двойное фенотип вторжения 13. Потенциальное воздействие на вторжение можно определить с помощью так называемого красно-зеленый анализ, который отличается от вторжения, не вторглись паразитов дифференциального окрашивания антителами 23,24. Для обоих вторжения и выхода анализов он может быть уд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была профинансирована американской Сердечной Ассоциации ученых гранта на развитие 0635480N и Национального института здоровья грант AI081220. BIC поддерживает тамплиеров Eye Foundation грант.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
ЕНУ Sigma-Aldrich N3385 1 M фондовой ДМСО, хранить при -20 ° C
EMS Sigma-Aldrich M0880 1 M фондовой ДМСО, хранить при -20 ° C
Декстран сульфат Sigma-Aldrich D4911
PDTC Sigma-Aldrich P8765 100 мМ фондовой PBS
Разница быстрого EMD химическими веществами 65044-93
Держатель фильтра Коул-Parmer 540100
3 мкм поликарбонатный фильтр ВатманШлейхер и Schuell 110612
Гемоцитометра Хауссер Научные 1475
СО 2-инкубаторы Различные производители Увлажненный, 5% CO 2, 35, 37 и 40 ° C
Флуоресцентный микроскоп Различные производители В идеале инвертируется, широкие поля с 63x или 100x масло цель

HBSSc (в зависимости от Черного и др. 11.)

  • 98,0 мл Хэнкс сбалансированный солевой раствор (Hyclone каталожный номер SH30588)
  • 100 мкл 1М MgCl 2 (100 мМ конца)
  • 100 мкл 1М CaCl 2 (100 мМ конца)
  • 2,0 мл 1М Hepes рН 7,3 (20 мМ конца)
  • 84 мг NaHCO 3 (10 мМ конца)

Ссылки

  1. Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
  2. Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii. J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).
  3. Silverman, J. A. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).
  4. Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole. Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).
  5. Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin. Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).
  6. Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages. Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).
  7. Hoff, E. F., Carruthers, V. B. Is Toxoplasma egress the first step in invasion. Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).
  8. Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii. J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).
  9. Lourido, S. Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma. Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).
  10. Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation. J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).
  11. Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress. Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).
  12. Chandramohanadas, R. Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells. Science. , (2009).
  13. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  14. Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants. Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).
  15. Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship. Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).
  16. Striepen, B. Genetic complementation in apicomplexan parasites. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).
  17. White, M. W. Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant. Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).
  18. Gubbels, M. J. Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).
  19. Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment. Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).
  20. Camps, M., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate. Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).
  21. Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).
  22. Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein. Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).
  23. Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).
  24. Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion. J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).
  25. Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).
  26. Kafsack, B. F. Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells. Science. 323 (5913), 530-533 (2009).
  27. Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores. J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).
  28. Nagamune, K. Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii. Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).
  29. Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection. J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).
  30. Persson, E. K. Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii. J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

температурно-чувствительные мутантыдекстрансульфатпирролидиндитиокарбаматпроточная цитометрияметод бляшекметод предельного разведениямутаген ENU
Генетические экрана изолировать Toxoplasma гондий Клетки-хозяина Мутанты Egress
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.