Холестерин Анализ истечения

Краткое содержание

Холестерин анализ предназначен для количественного определения скорости оттока холестерина из культивируемых клеток и способность плазмы акцепторов принять холестерина выпустили из клеток. Анализ состоит из маркировки клеток холестерина, холестерина равновесия между внутриклеточными бассейны и выпуск холестерина внеклеточной акцептором.

Аннотация

Содержание холестерина в клетках должно поддерживаться в очень жестких пределах, слишком большое или слишком малое содержание холестерина в клетке приводит к нарушению клеточных мембран, апоптозу и некрозу ¹. Клетки могут получать холестерин из внутриклеточного синтеза и из липопротеинов плазмы, оба источника достаточны для полного удовлетворения потребностей клеток в холестерине. Процессы синтеза и поглощения холестерина жестко регулируются, дефицит холестерина встречается редко ². Избыток холестерина является более распространенной проблемой ³. За исключением гепатоцитов и в некоторой степени адренокортикальных клеток, клетки не способны расщеплять холестерин. У клеток есть два варианта снижения содержания холестерина: преобразование холестерина в холестериловые эфиры, вариант с ограниченной способностью, поскольку перегрузка клеток холестериновыми эфирами также токсичен, и отток холестерина, вариант с потенциально неограниченной емкостью. Отток холестерина – это специфический процесс, который регулируется рядом внутриклеточных транспортеров, таких как АТФ-связывающие кассетные транспортеры белки A1 (ABCA1) и G1 (ABCG1) и рецепторы-поглотители типа B1. Естественным акцептором холестерина в плазме являются липопротеины высокой плотности (ЛПВП) и аполипопротеины А-I.

Анализ оттока холестерина предназначен для количественной оценки скорости оттока холестерина из культивируемых клеток. Он измеряет способность клеток поддерживать отток холестерина и/или способность акцепторов плазмы воспринимать холестерин, высвобождаемый клетками. Анализ состоит из следующих этапов. Шаг 1: мечение клеточного холестерина путем добавления меченого холестерина в сывороткосодержащую среду и инкубации с клетками в течение 24-48 часов. Этот этап может сочетаться с нагрузкой клеток холестерином. Шаг 2: инкубация клеток в бессывороточной среде для выравнивания меченого холестерина среди всех внутриклеточных пулов холестерина. Эта стадия может сочетаться с активацией клеточных переносчиков холестерина. Шаг 3: инкубация клеток с внеклеточным акцептором и количественная оценка движения меченого холестерина от клеток к акцептору. Если предшественники холестерина использовались для маркировки вновь синтезированного холестерина, может потребоваться четвертый этап – очистка холестерина.

Анализ предоставляет следующую информацию: (i) как конкретное лечение (мутация, нокдаун, сверхэкспрессия или лечение) влияет на способность клетки к эффлюксу холестерина и (ii) как болезнь или лечение влияют на способность акцепторов плазмы воспринимать холестерин. Этот метод часто используется в контексте сердечно-сосудистых исследований, метаболических и нейродегенеративных расстройств, инфекционных и репродуктивных заболеваний.

Протокол

1. Подготовка ^[3 H]-холестерина

1. В вытяжной шкаф, отказаться от требуемого количества ^[3 H] холестерина в 1,5 мл микроцентрифужную трубки (0,5 мКи (19 кБк) в каждую лунку необходимо для типичного анализа).
2. Если ^[3 H]-холестерина приостановлена ​​в толуоле, высушите его полностью с N2 газ и ресуспендируют со 100%-ным этанолом до конечной концентрации 1 мкКи (37 кБк / мкл. Vortex и хорошо перемешать.

2. Покрытие клетки и маркировки сотовых Холестерин

Этот протокол был протестирован с помощью следующих типов клеток: человеческие моноциты ^4,5, THP-1 человеческих моноцитов-макрофагов ^6,7,8, RAW 264.7 мышиных макрофагов ^5,9,10,11, HeLa клетки ¹² человек эндотелия пупочной вены клеткам (HUVEC), ВНК-21 клеток ^9, человеческих и мышиных фибробластов ^13,14, HepG2 клетках человека гепатокарциномы ¹⁵ и в измененном виде, из тромбоцитов ^16.

1. Ресуспендируйте клеток и их сосчитать. Пластина клеток в 12-луночных планшетов на конечной плотности 0.2x10 ⁶ клеток на лунку в 0,9 мл полной среды. Клетки будут продолжать расти и достигнет 0.8x10 ⁶ клеток на хорошо ко времени истечения эксперимента. Для клеток, которые не делятся, например, дифференцированный ТНР-1 клеток, плотности посева должна быть 0.8x10 ⁶ клеток на лунку. При использовании 6 - или 24-луночный, двойных или половину числа клеток на лунку соответственно. Количество скважин должна быть достаточной для определения четырех экземплярах для каждой экспериментальной состоянии.
2. Если дифференциация ТНР-1 клеток необходимо, добавьте PMA (конечная концентрация 0,1 мкг / мл) в средствах массовой информации в течение 48-72 часов.
3. Добавить небольшую аликвоту СМИ в отцентрифугировать пробирку с ^[3 H] холестерина.
4. Вымойте стороны трубки со средствами массовой информации, прежде чем добавлять ^[3 H] холестерина в отдельных аликвоту полный СМИ (100 мкл / лунку).
5. Добавить средах, содержащих ^[3 H] холестерина в лунки с клетками (конечный объем на одну скважину составляет 1 мл). При отсутствии лечения клеток необходимо до маркировки, клетки могут быть покрыты в ^[3 H] холестерина содержащей среде.
6. Инкубируйте клетки в течение 48 часов в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).

3. Уравновешивание Инкубационный

1. После 48 часов инкубации, проверьте клеток под микроскопом. Убедитесь, что они здоровы и находятся в примерно 80% слияния.
2. Удалить средах, содержащих ^[3 H] холестерина. Промойте клетки осторожно PBS. Повторите 3 раза стирки.
3. Подготовить бессывороточной СМИ. При необходимости активировать клетки, добавив LXR агониста (например, TO-901 317 на 1-4 ммоль / л) или цАМФ (0,3 ммоль / л, для клеток мышей происхождения только) в сыворотке крови свободной информации.
4. Добавить 500 мкл сыворотки свободных средств массовой информации в каждую лунку.
5. Выдержите в течение 18 часов в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).

<с классом = "jove_title"> 4. Холестерин Инкубационный истечение

1. После 18 часов инкубации в бессывороточной среде, проверьте клеток под микроскопом. Убедитесь, что они здоровы и сливной (минимум 80% слияния).
2. Подготовить решение холестерина истечения акцепторов в бессывороточной среде. Примерами акцепторов включают в себя:
   Аполипопротеина AI (апо-I) (конечная концентрация 10 мкг / мл)
   Липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) (конечная концентрация 20 мкг / мл)
   Циклодекстрин (конечная концентрация 200 мкг / мл)
   Плазменные (конечная концентрация 1-2%)
3. Промойте клетки осторожно PBS.
4. Добавить 250 мкл сыворотки среде с акцепторами в каждую лунку.
5. Оставьте один набор скважин для определения фоне оттока (отток в сыворотке крови свободных средств массовой информации с NO акцептор)
6. Инкубируйте клетки в течение 2 часов в культуре клеток инкубатор (37 ° C, 5% CO _2). Срок истечения инкубационного может варьироваться от 30 минут до 8 часов, если требуется.

5. Обработка Samples

1. Через 2 часа инкубации проверить клетки под микроскопом.
2. Сбор СМИ в пробирки на 1,5 мл отцентрифугировать. Спиновая при 14000 оборотов в минуту в течение 1-10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить продукты распада клеток.
3. Передача 100 мкл среды на 7 флакон сцинтилляционных мл. Добавьте 5 мл Insta-гель Plus (PerkinElmer) и вихревой смеси. Хранить оставшихся образцов при температуре 4 ° C.
4. Установите плиты в морозилку на 30 минут. Добавить 500 мкл дН ₂ O в каждую лунку. Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки подняли со дна скважины. Если все же сторонник, либо оставить пластины с дН ₂ O при температуре 4 ° С в течение ночи или царапина скважин.
5. После того как все клетки сняты, пипетка вверх и вниз, чтобы разбить ячейку сгустки. Передача 100 мкл на 7 флаконов мл сцинтилляционного. Добавьте 5 мл Insta-гель Plus (PerkinElmer) и вихревой смеси. Храните оставшиеся пластины при температуре 4 ° C.
6. Поместите сцинтилляционных флаконов на сцинтилляционных счетчиков. Настройка счетчика рассчитывать на ^[3 H] вDPM единиц.

6. Анализ результатов

1. Уровень холестерина истечения обычно выражается в виде доли от холестерина переехал из клетки акцептора. Используется следующая формула:

2. Конкретные истечения рассчитывается как разница между истечения в присутствии или отсутствии акцептора (пустой).

7. Хронология

8. Представитель Результаты

Пример результатов эксперимента холестерина истечения показано на рис. 1. В этом эксперименте THP-1 человека моноциты дифференцируются в макрофаги и холестерина истечение различных акцепторовиспытания. Холестерин истечения в среде с не акцепторами ("пустой") было 0,79%, и это значение рассматривается как неспецифический истечения и вычитается из других ценностей. Холестерин истечения для человеческого апо-I (конечная концентрация 30 мкг / мл) 4,75%. Образец ссылки плазма была включена в этот эксперимент, чтобы контролировать между экспериментальной изменчивости. Эталонного образца могут быть использованы для нормализации данных между большим числом экспериментов, но мы сочли разумным, чтобы повторить тест, если изменчивость высока. Пациент плазмы (конечная концентрация 2%) был испытан до и после пациент лечился с помощью лекарств. Сделан вывод, что у этого пациента препарат оказывает негативное воздействие на способность плазмы поддерживать холестерин истечения.

Другой пример результате истечения эксперимента приведена на рис. 2. В этом эксперименте RAW 264.7 макрофаги активирован или не активирован ночной инкубации с LXR агониста TO-901 317 (конечная концентрация1 мкмоль / л) и холестерина истечения в том же образце плазмы крови человека (2%) была проверена. Был сделан вывод, что активация клеточного выражение перевозчиков ABC с агонистов LXR увеличивает пропускную способность клеток к выпуску холестерина внеклеточной акцептором.

Рисунок 1. Холестерин истечение из ТНР-1 клеток различных акцепторов. Процент холестерина истечения (т.е. доля меченых холестерин перемещается из клеток к указанной акцептор) показана после вычитания из пустых значений. Среднее ± стандартное отклонение в четырех экземплярах определений, * р <0,05.

Рисунок 2. Холестерин истечение из RAW 264.7 активирован или не активирован с LXR агониста плазмы крови человека. Процент холестерина истечения (т.е. доля меченых холестерина переехал из клеткиуказанные акцептор) показана после вычитания пустые значения. Среднее ± стандартное отклонение в четырех экземплярах определений, * р <0,001.

Обсуждение

Описанный метод измерения холестерина истечения предназначен для измерения движения холестерина из клеток внеклеточную акцептором холестерина. Есть несколько важных соображений, в понимании этой методологии.

Маркировка и равновесия

В описанной методологии меченых холестерина добавляют сыворотку содержащих сыворотки. Хотя никогда не исследовал в деталях, то предполагается, что холестерин включается в сыворотке липопротеидов, и они принимаются к клеткам. Важно, чтобы ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты \ Клетки	HeLa	THP-1	RAW	HUVEC	ВНК-21	HFF
Полное СМИ	RPMI - 10% FCS - 1% L-глутамина - 0,2% Pen стрептококк			M199 - 5% FCS - 1% L-глутамина - 1% Pen стрептококк - 2% HEPES (1M) - 7% эндотелиальных дополнение рост клеток (ЭКГ)	DMEM - 10% FCS - 1% L-глутамина - 0,2% Pen стрептококк
Сыворотка свободные СМИ	RPMI - 1% L-глутамина - 0,2% Pen стрептококк			M199 - 1% L-глутамина - 1% Pen стрептококк - 2% HEPES (1M) - 7% эндотелиальных клеток растиго дополнения (ЭКГ)	DMEM - 1% L-глутамина - 0,2% Pen стрептококк
Прохождение метод	1 х трипсина	Приостановление	Скоблить	1 х трипсина
Прохождение соотношение	3:10	1:03		1:20	1:03	1:03
Сотовые активации (опционально)		К-901 317 - LXR-агонистов - Окончательный конц. 4 мкМ
Другие реагенты		форбол 12-миристат-13-ацетат (PMA) - Дифференциация клеток - Окончательный конц. 0.1μg/ml