Мы разработали новый протокол для повышения эффективности экстракорпорального дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны. Дифференцированных клеток ES приобретенные моторные нейроны есть о чем свидетельствует выражение нейронов и двигательных нейронов маркеров использованием иммуногистохимических методов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Прямая дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в функциональных двигательных нейронов представляет собой перспективный ресурс для изучения механизмов болезни, для отбора новых соединений, лекарственных средств и разработать новые методы лечения для моторных нейронов заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия (СМА) и бокового амиотрофического склероза ( ALS). Многие современные протоколы используют комбинацию ретиноевая кислота (RA) и звуковой еж (Тсс), чтобы отличить мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в моторные нейроны 1-4. Тем не менее, дифференциация эффективности ЭСК в моторные нейроны только встретился с умеренным успехом. Мы разработали два шага дифференциации протокол 5, что значительно повышает эффективность дифференциации в настоящее время по сравнению с установленными процедурами. Первый шаг заключается в повышении neuralization процесс, добавив Noggin и фибробластов ростовыми факторами (FGFs). Noggin представляет собой белок, костные морфогенетические (BMP) антагонист и участвует в нервной индукцииccording по умолчанию модель нейрогенеза и приводит к образованию передних нейронные паттерны 6. FGF сигнализации действует синергически с Noggin в стимулировании формирования нейронной ткани путем содействия задней нейронной идентичности 7-9. На этом этапе ЭСК клетки загрунтовать Noggin, bFGF и FGF-8 в течение двух дней, чтобы способствовать дифференциации на нейронных линий. На втором этапе, чтобы побудить двигательных нейронов спецификации. Noggin / FGFs подвергаются ЭСК клетки инкубировали с РА и Shh агонист, сглаженным агонистов (SAG), в течение еще 5 дней для облегчения двигательных нейронов поколения. Для контроля за дифференциацию беспорядок в моторные нейроны, мы использовали линию ES клетки, полученные из трансгенных мышей выражения EGFP под контролем двигательных нейронов конкретных промоутер Hb9 1. Используя этот надежный протокол, мы достигли 51 ± 0,8% дифференциация эффективности (п = 3, р <0,01, Стьюдента-тест) 5. Результаты иммунофлуоресцентногоокрашивание показало, что GFP + клеток выразить двигательных нейронов специфических маркеров, остров-1 и холинацетилтрансферазы (чат). Наш двухступенчатый дифференциации протокол обеспечивает эффективный способ дифференцировать ЭСК клетки в спинном моторных нейронов.
Протокол
1. Шаг 1: мышь эмбриональных стволовых (ЭСК) культуры клеток (сроки: 3 дня)
1. Нанесение первичного эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ)
- Пальто четыре 100-мм культуры тканей блюда с желатином для адгезии ПМЭФ. Добавить 8 мл 0,1% раствора желатина (StemCell технологий) для каждого блюда и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Удалите излишки желатина из блюд. Не ополаскивать посуду.
- Развести один флакон Митомицин С инактивированной ПМЭФ (Millipore), который содержит ок. 5 х 10 6 клеток в 40 мл ПМЭФ средства массовой информации (см. рецепт в Таблице 1) и пластины н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Качество ЭСК является наиболее важным параметром для эффективного производства моторных нейронов. ЭСК клетки должны быть выращены на ПМЭФ для предотвращения спонтанной дифференцировки. Добавление LIF помогает поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние. Как ЭСК клетки делятся каждые 12-15 ч, культуральной среде истощаются быстрее и должны быть заменены в день.
Эффективное активации Тсс путь является критическим параметром, необходимые для индуцирования двигательных нейронов спец.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта рукопись, посвященная памяти доктора Wenlan Ван, который скончался 26 мая 2011 года. Мы благодарим д-р Douglas A. Kerr для обеспечения щедро HBG3 ЭСК клетки, используемые в этом исследовании. Эта работа финансировалась Немур, Грант (2 RR016472-10) под INBRE программы Национального центра по исследованию ресурсов (NCRR), а награду Кобре грант NCRR (5 P20 RR020173-05) для поддержки центра Детская исследований Альфреда И. Дюпон больницы для детей, Уилмингтон, штат Делавэр, США.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Конечная концентрация |
| ПМЭФ | Millipore | ПМЭФ-H | Не Доступно |
| ПМЭФ среднего | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | Не Доступно |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-глютамин | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Пенициллина / стрептомицина | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| ЭСК среднего | |||
| DMEM | StemCell технологии | 36250 | Не Доступно |
| ES Cell-Квалифицированные FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-я | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Номера для незаменимых аминокислот | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Нуклеозиды | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-меркаптоэтанол | Millipore | ES-007-E | 0,1 мМ |
| Пенициллина / стрептомицина | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 нг / мл |
| Нейронные среднего Дифференциация | |||
| DMEM | StemCell технологии | 36250 | Не Доступно |
| ES Культ FBS | StemCell технологии | 06905 | 15% |
| Номера для незаменимых аминокислот | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Моно-тио глицерина | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Башка | Invitrogen | PHC1506 | 50 нг / мл |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 нг / мл |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 нг / мл |
| МНД среды (дифференциации) | |||
| ES-культ базальной среднего | StemCell технологии | 5801 | Не Доступно |
| Нокаут сыворотки замена | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 дополнения | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ЕЕ Дополнение-B | StemCell технологии | 07155 | 1% |
| Аскорбиновая кислота | StemCell технологии | 07157 | 1% |
| Пенициллина / стрептомицина | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-я | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-глюкозы | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0,15% в D 2 H 2 O |
| Фибронектин | StemCell технологии | 07159 | 5 мкг / мл |
| Гепарин | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 мкг / мл в D 2 H 2 O |
| β-меркаптоэтанол | Millipore | ES-007-E | 0,1 мМ |
| Ретиноевой кислотой | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 мкМ |
| САГ | EMD химическими веществами | 566660 | 1 мкМ |
| МНД среды (двигательный нейрон культуры) | |||
| ES-культ базальной среднего | StemCell технологии | 5801 | Не Доступно |
| Нокаут сыворотки замена | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 дополнения | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ЕЕ Дополнение-B | StemCell технологии | 07155 | 1% |
| Аскорбиновая кислота | StemCell технологии | 07157 | 1% |
| Пенициллина / стрептомицина | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-я | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-глюкозы | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0,15% в D 2 H 2 O |
| Фибронектин | StemCлокоть технологии | 07159 | 5 мкг / мл |
| Гепарин | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 мкг / мл в D 2 H 2 O |
| β-меркаптоэтанол | Millipore | ES-007-E | 0,1 мМ |
| BDNF | R & D Systems | 248-BD-005/CF | 10 нг / мл |
| CNTF | R & D Systems | 257-NY-010/CF | 10 нг / мл |
| GDNF | R & D Systems | 212-GD-010/CF | 10 нг / мл |
| NT-3 | R & D Systems | 267-N3-005/CF | 10 нг / мл |
NA = не применимо.
Таблица 1. ПМЭФ и средств массовой информации для ЭСК клеточных культур или дифференциации.
| <Строгое имя> реагента | Компания | Номер по каталогу | Конечная концентрация |
|---|---|---|---|
| 0,1% желатина | StemCell технологии | 07903 | Не Доступно |
| Поли-DL-орнитин | Sigma-Aldrich | P0421 | 0,1 мг / мл в D 2 H 2 O |
| Мышь ламинин | Millipore | CC095 | 2 мкг / мл в PBS |
| 0.25% трипсин / ЭДТА | StemCell технологии | 07901 | Не Доступно |
| Accumax | Millipore | SCR006 | Не Доступно |
NA = не применимо.
Таблица 2. Реагенты для покрытия и диссоциации.
Ссылки
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24<....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
