Методическая статья

Одноклеточный профилирования развивающихся и зрелых нейронов сетчатки

13.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/3824

⸱

19 апреля 2012 г.

 , 
1Department of Genetics, Development and Cell Biology, Neuroscience Program, Iowa State University

В этой статье

Краткое содержание

Метод для выделения одной клетки сетчатки и последующему усилению их кДНК описаны. Одноклеточный транскриптомику показывает степень сотовой настоящее время неоднородность ткани и открывает новые маркерных генов редких клеточных популяций. Сопровождающих протокол может быть скорректирована в соответствии с различными типами клеток.

Аннотация

Узкоспециализированные, но очень небольшие популяции клеток играют важную роль во многих тканях. Определение клеточного типа маркеров и программы для экспрессии генов крайне редки подмножества клетка была проблема с использованием стандартных все ткани подходов. Экспрессия генов профилирования отдельных клеток позволяет беспрецедентный доступ к типам клеток, которые составляют лишь небольшой процент от общей ткани 1-7. Кроме того, эта методика может быть использована для изучения экспрессии генов программы, которые временно выражается в небольшом количестве клеток в процессе динамического развития переходов 8.

Этот выпуск сотовых разнообразие возникает повторно в центральной нервной системе (ЦНС), где нейронные связи могут возникнуть между весьма разнообразны клеток 9. Точное число различных типов клеток, точно не известно, но было подсчитано, что там может быть больше, чем 1000 различных типов в коре яtself 10. Функция (ы) сложные нейронные цепи могут рассчитывать на некоторые редкие типы нейронов и генов, которые они выражают. По выявлению новых маркеров и помогает молекулярно классифицировать различные нейроны, одноклеточные подход особенно полезен при анализе типов клеток в нервной системе. Это также может помочь выяснить механизмы развития нервной системы путем выявления разному экспрессируются гены и ген пути на ранних стадиях развития нейронных предшественников.

В качестве простого, легко доступны ткани с большим разнообразием нейронов, сетчатки позвоночных является отличной модельной системой для изучения процессов клеточного развития, нейронов и нейронных дифференциации диверсификации. Однако, как и в других отделах центральной нервной системы, этот сотовый разнообразие может представлять собой проблему для определения генетических путей, которые ведут сетчатки предшественников принять конкретные судьбы клетки, особенно учитывая, что стержень фоторецепторов составляют машинство общей популяции клеток сетчатки 11. Здесь мы приводим метод для идентификации протоколов выразил в одной клетки сетчатки (рис. 1). Одноклеточные профилирования метод позволяет для оценки количества неоднородность настоящее время в различных клеточных популяций сетчатки 2,4,5,12. Кроме того, этот метод выявил целый ряд новых генов-кандидатов, которые могут играть роль (ы) в клетке судьбы процессах принятия решений, которые происходят в подмножества сетчатки клеток-предшественников 8. С помощью нехитрых изменений в протокол, этот метод может быть использован для различных тканей и типов клеток.

Протокол

1. Клеточная диссоциация

  1. Блок-схема с изложением протокол показана Рисунке 1. Для каталожных номеров частности реагенты, используемые в этом протоколе см. Таблицу 1. Проанализируйте сетчатки в ванне PBS. Во время вскрытия, то лучше удалить стекловидное тело и объектив с соответствии с их сетчатке может препятствовать диссоциации. Это не всегда критически важно, чтобы удалить все пигментного эпителия сетчатки (ПЭС) и в некоторых случаях это может быть невозможно полностью удалить его. Тем не менее, для одной ячейки профилирования экспериментов фоторецепторов, ПЭС должны быть удалены. Отказ от удаления ПЭС может привести к загрязнению стержня клетки профилей с НПП выразил генов. Предположительно это происходит из-за связи между фоторецепторов и ПЭС.
    Для диссоциации, все взрослые мышиной сетчатки инкубируют при 37 ° C в течение 10 мин в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку, содержащую 20мкл активированного папаина, 20 мкл 25 мМ цистеина в 5 мМ ЭДТА и 360 мкл Сбалансированный Хэнка солевой раствор (HBSS) с добавлением 10 мМ HEPES. С фильтром наконечники используются на всех этапах по всему протоколу чтобы свести к минимуму возможное загрязнение. Концентрации папаин и времени инкубации будет меняться в зависимости от возраста и характера ткани. Например, чтобы отделить разработку сетчатки выделен в послеродовой день 0 (P0), инкубировать сетчатки в 10 мкл активированного папаина, 10 мкл 25 мМ цистеина в 5 мМ ЭДТА, и 380 мкл Сбалансированный Хэнка солевой раствор (HBSS) с добавлением 10 HEPES мМ в течение 10 мин при 37 ° C. Сетчатки разных видов также требует несколько иных условиях. Куриные сетчатки тоньше, чем мыши сетчатки на большинстве стадий развития. Использование 10 мкл активированного папаина, 10 мкл 25 мМ цистеина в 5 мМ ЭДТА, и сбалансированный солевой 380 мкл Хэнка Решение (HBSS) с добавлением 10 мМ HEPES в течение 5 мин при 37 ° С достаточно отделить тHese сетчатки.
  2. Слегка нажмите на трубе, чтобы выбить любую поселились клетки, а затем растереть осторожно 10-20 раз с P1000 пипетки. Выдержите в течение дополнительных 10 минут при температуре 37 ° C, если большие скопления ткани сохраняется, а затем снова растирают в 10-20 раз.
  3. Добавьте 5 мкл ДНКазы I (10 ед / мкл) и инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Осторожно растереть P1000 пипетки. Точное число раз нужно будет определяться эмпирически, но в целом находится между 10-20.
  4. Центрифуга в настольной центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут Удаляют супернатант, оставив 100-200 мкл жидкости на дне, и нажмите на трубе, чтобы выбить гранул. Добавить 1 мл HBSS и ресуспендируют осадок с нежным растирания. Нажатие на трубе важно здесь просто ресуспендированием гранул с лизировать многих клеток сетчатки. Особенно это касается взрослых мышиных сетчатки.
  5. Центрифуга на 3000 оборотов в минуту в течение 3 мин Осторожно удалите супернатант и ресуспендируют в 450 мкл PBS содержатING 0,1% BSA. Важно, чтобы удалить как можно больше супернатант, как свести к минимуму присутствие мРНК из лизированных клеток и любых продуктов из диссоциации, которые могут препятствовать будущим реакций.

2. Уборка одной клетки

  1. Приготовьте два 6 см блюда, содержащие 5 мл PBS дополнена 0,1% BSA. Пластина диссоциированных клеток на одно блюдо и позволяют клеткам решить, по крайней мере 5 минут. Плотность клеток использовали в значительной степени зависит от характера отдельных клеток создается профиль. Например, очень редкие клетки помечены флуоресцентным маркером таких GFP, весь диссоциированных сетчатки высевают на одном 6 см блюдо. Для клеток, которые являются несколько более обильные, меньше ячеек, первоначально покрытием, чтобы сделать его легче добывать (или очень близко друг к) ячейки с первой пипетки.
  2. Поместите пластину диссоциированных клеток на инвертированный микроскоп. Мы используем IMT-2 модели от Olympus. Использование микропипетки, которые были разработаны для Fiпе наконечник (внутренний диаметр 0,5 мм, внешний диаметр 1,04 мм) (рис. 2) и вместе с аспиратором трубку, собрать одну ячейку. Клетки легко ввести микропипетки, когда он находится рядом с ними на блюдо. Очень важно, чтобы вытяжка трубка не слишком длинный и не слишком коротким для того, расстояние до сцены связаны с инвертированным микроскопом (аспиратор труб мы используем с нашими инвертированного микроскопа являются 38,1 см в длину). Если труба слишком длинная, клетки не могут быть исключены из эффективно микропипетки в пробирку. Основной причиной мы используем старшие IMT-2 модели инвертированного микроскопа является то, что мы нашли, он имеет идеальное расстояние до сцены для наших труб аспиратор сборки. После ввода микропипетки, ячейки (или ячеек) выбрасывается на второй пластине (мытье пластины), чтобы гарантировать, что одна и только одна клетка собирается для профилирования генной выражения. На второй пластинке часто бывает необходимо либо удалить посторонние клетки с новым микропипеткиили переместить ячейки интерес в другое место, чтобы гарантировать, что только одна ячейка входит в микропипетки.
  3. Когда отдельная клетка полностью изолирована от соседних клеток, использование новых микропипетки для аспирации клетки представляют интерес как в разделе 2.2, а затем изгнать его непосредственно в 0,2 мл ПЦР пробирку, содержащую 4,5 мкл буфера для лизиса клеток. Ячейка изгнаны на стороне трубки, стараясь не разорвать кончик пипетки в трубку. Образцы можно вращать кратко настольного микроцентрифужных погрузить ячейку в буфере для лизиса. Это вращающийся обычно делается после того, как каждый 5-й ячейки, а затем снова в конце collection.Tubes содержащие отдельные клетки в буфере для лизиса должны быть на льду в течение одного изоляторе. Для получения оптимальных результатов, отдельные клетки собираются в течение двух-часового окна после диссоциации. После этого времени прошло, то лучше приступить к обратной транскрипции с шагом дополнительное время была наблюдаемыхред, чтобы увеличить шансы деградации РНК.

3. Обратной транскрипции

  1. Кратко спина образцов в настольный minicentrifuge для обеспечения всех одиночных клеток погружены в буфер лизис клетки. Способствовать лизиса клеток, инкубировать образца при 70 ° C в течение 90 сек. В Термоциклер. Немедленно поместите трубки обратно на лед.
  2. Оставьте труб на льду в течение 2 мин. Для всех реагентов дополнения, использовать фильтр-наконечник наконечники для предотвращения загрязнения. Для проведения обратной транскрипции, добавить 0,33 мкл Надстрочный III (200 ед / мкл), 0,05 мкл РНКазы ингибитор (40 ед / мкл) и 0,07 мкл T4 ген белка 32. Инкубируйте реакционной смеси в течение 50 мин при 50 ° С в Термоциклер. Инактивации фермента при 70 ° С в течение 15 мин и место на льду.
  3. Для удаления свободного грунтовки, добавляют 0,1 мкл буфера экзонуклеазной (10X), 0,8 мкл дН 2 0 (молекулярная биология класс) и 0,1 мкл экзонуклеазной я (20 ед / мкл). Инкубировать при температуре 37 ° С в течение 30 минТермоциклер. Инактивации фермента путем инкубации реакцию при 80 ° С в течение 25 минут, а затем размещение труб на льду.

4. Хвостохранилищ и одноклеточные ПЦР

  1. Добавить 6 мкл реакционной смеси хвостохранилищ и использования Термоциклер для инкубации образца при 37 ° С в течение 20 мин, 70 ° C в течение 10 минут, и проводить при температуре 4 ° C
  2. Добавить 10 мкл хвост образец реакционной смеси ПЦР и выполнять вторую прядь синтеза и ПЦР-амплификации с использованием следующих условий:
    1. 95 ° C в течение 2 минут
    2. 37 ° C в течение 5 мин
    3. 72 ° C в течение 16 мин
    4. 93 ° C в течение 40 сек
    5. 67 ° С в течение 1 мин
    6. 72 ° C в течение 6 мин, добавляя 6 секунд за один цикл
    7. Перейдите к шагу 4 34 раз
    8. 72 ° C в течение 10 минут
    9. Держите при температуре 4 ° C

5. Маркировка чипов Affymetrix

  1. Этикетка 10-20 мкг кДНК (концентрация усиливается кДНК результатING из одной клетки, как правило, ~ 1 мкг / мкл), чтобы получить надежную гибридизации микрочипов Affymetrix. Во-первых, фрагмент кДНК добавлением 10-20 мкл одноклеточные кДНК 8 мкл 1X одного Phor-Все буфера и 1 мкл разведенной (1:10 в 1X одного Phor-Все буфера) DNaseI в 80 мкл реакции. Инкубируйте в Термоциклер 13 мин при 37 ° C. Инактивации ДНКазы I в течение 15 мин при 100 ° С и место на льду.
  2. Добавить 20 мл 5 раз буфером TdT, 2,5 мкл биотин N6-ddATP (Enzo Biosciences) и 1 мкл TdT (разбавленный 1:08 в буфере TdT).
  3. Инкубировать 90 мин при 37 ° С, затем 5 минут при 65 ° C. Хранить при температуре от -20 ° C или гибридизации сразу Affymetrix микрочипов. Гибридизация выполняется с помощью стандартных протоколов Affymetrix.

6. Представитель Результаты

Для оценки качества кДНК, 10 мкл кДНК образец был загружен на 1% агарозном геле. КДНК, в основном судят по размеру диапазона (500-2000 б.п.)и интенсивность кДНК мазка (рис. 1 и рис 3а). В геле показано на рисунке 1, все остальные полосы показывает кДНК мазок из клеток сетчатки изолированы E16.5. Полосы между показывают полученные мазки, когда только средства массовой информации всасывается в иглу и хранение в ПЦР-пробирку. Эти полосы никогда не бывают полностью лишена слабых мазка, но они не показывают результатов, когда ген-ПЦР праймеров для амплификации генов от них. Кроме того, интенсивность кДНК мазке может несколько отличаться (сравните Рисунок 1 и Рисунок 3а). В полос рис.3, е, ж, ч и содержать надежные кДНК мазки в то время как полосы б, в, г, д, значительно менее надежные.

Ген-ПЦР используется в качестве второго экрана качества кДНК из одной ячейки. КДНК на рисунке 3, были изолированы от флуоресцентных ганглиозных клеток сетчатки, и они были ТестD с помощью ПЦР праймеры для сетчатки ганглиозных клеток маркеры Brn3b и Pax6. Для этого теста, 1 мкл кДНК подвергали ПЦР в течение 30 циклов. В режиме реального времени количественный ПЦР было бы предпочтительнее анализа, но это может быть дорого и не нужно просто оценить качество кДНК. Все 8 одиночных клеток дали положительный результат на Brn3b и 6 из 8 Pax6 (рис. 3б). Даже кДНК мазки, которые были менее надежными производства полос для Brn3b и Pax6. Несмотря на эти результаты ПЦР, это наш опыт, который кДНК мазков, например, в полос б, в, г, д не дают надежной гибридизации с массивами Affymetrix и, как правило, избегать. Гена ПЦР для фоторецепторов маркер CRX был использован для определения уровня загрязнения в одной кДНК ячейки (рис. 3б). Маркер фоторецепторов был выбран потому, что эти клетки составляют большинство сетчатки (~ 70%) и, следовательно, любой лизиса клеток, которые произошли, скорее всего, связаны стержнем фотооткликарецепторов. Был только слабый количество настоящее CRX в этих препаратах кДНК даже после 30 циклов ПЦР. Наконец, это ПЦР-экран может быть использован для начала определить, какие подмножества определенного типа клетки кДНК были получены еще до применения к ним полный профилирования микрочипов. Это может помочь определить приоритеты клетки, профилированные, так как это является самым дорогим шагом в этом процессе. Например, мы определили подмножества ганглиозных клеток сетчатки путем скрининга, на наличие гена Tachykinin1 (рис. 3б).

С небольшой ПЦР-экран, особенно одиночных камерах выбирают и их гибридизации с кДНК Affymetrix микрочипов. Данные микрочипов по сравнению и шаблоны могут быть обнаружены с помощью стандартных алгоритмов кластеризации. Heatmaps, например, на рисунке 4, которые можно использовать для графического представления данных. Есть два основных вывода в отношении одной ячейки профилирования данных на рис4. Во-первых, гены выражены в специфические типы клеток встречаются почти исключительно в тех типах клеток после однократного протокол ячейки выполняется. В большинстве случаев, когда маркерных генов из одного типа клеток обнаружены также во второй тип клеток, таких как наблюдение, что биполярные клетки выразить некоторые "стержень" генов на более низких уровнях, это выражение во второй тип клеток легко подтверждается либо на месте гибридизации или антитела окрашивания. Во-вторых, в более разнообразных амакринные и профилей ганглиозных клеток, гетерогенность экспрессии генов является очевидной. Pou4f1 выражается только в 1/4 развивающихся ганглиозных клеток, в то время Nr4a2 и Scube2 два примера гетерогенно выразил генов в разных клетках амакринные. В самом деле, гены показано на Тепловая карта лишь небольшой пример, как несколько сотен генов были выявлены и подтверждены в качестве маркеров развития ганглиозных клеток или в качестве маркеров различных популяций клеток амакринные 2,4.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Блок-схема одного метода профилирования клетки. Первая сетчатка изолированы и распадается на отдельные клетки, используя папаин. Во-вторых, отдельные клетки собирают с вытащил стеклянную иглу и хранение труб в ПЦР. Клетки лизируют и кДНК амплифицировали с использованием обратной транскрипции следует с помощью ПЦР. В результате кДНК качества оценивается на агарозном геле такой как показано на рисунке. После того, как ДНК лестнице в первой полосе, полосы показывают кДНК мазков из одной клетки (отмечены красным скобках), чередующихся с усилением контроля изделий из средств массовой информации. Мазки этого качества (красный скобках) гибридизации с Affymetrix микрочипов.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Фотографии иглы и сборка аспиратор трубку. Отдельные клетки выделяют помощью капиллярного действиявытащил стекло микропипетки (внутренний диаметр 0,5 мм, внешний диаметр 1,04 мм) и передаются под давлением дует в аспиратор. Важно, что аспиратор трубки и достаточно долго, чтобы легко манипулировать и достаточно коротким, чтобы надежно выполнять отдельные клетки. Крупным планом капилляра втягивается в иглу показано на B.

figure-protocol-3
Рисунок 3. Представитель примере одной ячейки кДНК мазков и конкретных генов ПЦР. Для определения качества одной клетки кДНК после усиления, 10 мкл каждого отдельного кюветы были выполнены на 1% агарозном геле, а также отрицательного контроля (A). Мазок должен появиться между 500-2000 пн. Дополнительная ПЦР-скрининга на определенных генов может помочь выявить / подтвердить тип клеток, который был изолирован и количество загрязнений в образце (B). Праймеров, специфичных для ганглиозных клеток сетчатки маркеры Brn3bи Pax6 были протестированы, чтобы подтвердить идентичность этих ячеек (строки 1 и 2). Чтобы оценить количество фоторецепторов загрязнения в подготовке праймеров, специфичных для фоторецепторов маркер CRX были использованы (строка 3). Подмножества ганглиозных клеток могут быть определены в ходе обследования на маркеры, такие как Tachykinin1 (строка 4).

figure-protocol-4
Рисунок 4. Одноместный экспрессии в клетках маркеров генов. Микрочипов результаты для отдельных генов, в 22 различных одиночных клеток показаны на Тепловая карта формата. Интенсивности от сигналов микрочипов были расширены, чтобы соответствовать интенсивности красного цвета. Черный свидетельствует об отсутствии сигнала на микрочипов. Ганглиозных клеток сетчатки (РГК) предшественники показали, выделенных из эмбриональных моменты времени, в то время как другие клетки были изолированы от взрослых сетчатки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Постоянно расширяющийся ряд исследований выявления надежных клетки к клетке изменчивость в популяциях, которые считались более однородными с точки зрения их экспрессии гена 6,8. По крайней мере в одном случае, это экспрессия генов "шум", как было показано, играют важную биологическую функцию 13. Экспрессия генов различия между отдельными клетками закрыты с использованием традиционных целом тканей методами. Эти опыты создания профиля экспрессии генов "средний" клетки, которая не ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Ссылки

  1. Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
  2. Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
  3. Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
  4. Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
  5. Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
  6. Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159(2006).
  7. Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
  8. Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588(2008).
  9. Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
  10. Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
  11. Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
  12. Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
  13. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
  14. Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
  15. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
  16. Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
  17. Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247(2004).
  18. Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
  19. Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
  20. Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
  21. McEvoy, J. F. -O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
  22. Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
  23. Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
  24. Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
  25. Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18(2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи