$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. КТ Солюбилизация
Этот метод подходит для CdTe. Подобные методы могут быть использованы и другие типы квантовых точек, таких как InP / ZnS 20 и CdSe / ZnS 21.
- Приготовьте раствор CdTe квантовых точек в толуоле при 15 мкм (оптическая плотность = 2,5 в первом экситонного пика).
- Передача 200 мкл этой акции в стеклянный флакон. Не используйте пластиковые!
- Добавить 800 мкл толуол, 1 мл 200 мМ боратного буфера (рН 9) и 2 мкл 11,5 M меркаптопропионовой кислоты (MPA).
- Закройте флакон и энергично встряхните его в течение 30-60 секунд.
- Водных и органических растворителей фазы будет отделить спонтанно. Водная фаза станет цвет КТ. Чтобы избежать толуол слой, удалите его и отбросить его. Затем перенесите в водную фазу в чистый флакон.
- Очисти растворяются КТ промывкой / фильтрации в четыре раза использовании 500 мкл, 10000 молекулярная масса отсечки центрифугу фильтром. Фильтры должны бытьнити при 3000 мкг в течение 13 минут. По крайней мере, последние два моет, промыть желаемого буфера.
- После последней промывки, приостановить промытый КТ в 50 мМ буфере бората в нужной рН и хранить при 4 ° C. Они будут стабильными в течение 1-2 недель.
- Измерение поглощения и спектры излучения для оценки концентрации основан на опубликованной формулы 22.
Представитель результаты: На рисунке 1 показаны изображения КТ CdTe под действием УФ-лампа подсветки, а также спектры излучения до и после растворения воды, показав незначительное изменение с крышкой обмена. Размер значения диаметра сердцевины измеряется с помощью электронного микроскопа.
2. КТ сопряжения с антибиотиком
Эта часть протокола применима к любой отрицательно заряженные воде растворенного наночастиц, в том числе большинство коммерческих КТ, металлические частицы и т.д. 19.
- Любая молекула будет работать, что eithэ самостоятельно собирает в отрицательно заряженные растворяются КТ, или что есть реактивная группа, которая может быть сопряжена, например, первичные амины. В этом примере мы используем полимиксина (PMB), которая заряжена положительно и самостоятельно собирает без необходимости сопряжения реагентов. Растворите PMB в H 2 O при 60 мкМ. (Если выбранный антибиотик не растворяется в H 2 O, растворяется в ДМСО или этанол в концентрации 0,1-1 мм). Это будет 10-кратным решения (в H 2 O) или 100x раствора (растворителя).
- Посчитайте, сколько КТ решение необходимо для бактериальной экспериментов токсичности. Для 96-луночный планшет с 0,3 мл на лунку в quadruplicates, 0,5 мл 200 нМ сопряженных необходимо. Приготовьте два пробирки, содержащие по 100 мкл 1 мкМ квантовых точек в 50 мМ буфере бората.
- Если связь с первичным амином, подготовить 19 мг / мл (100 ммоль) раствора 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимида гидрохлорид (EDC) в H 2 O. EDC в решение не является устойчивым, Немедленно использовать и выбросить остальное же.
- Добавить 50 мкл 10x раствор антибиотика (в H 2 O) или 5 мкл 100x решения (в растворителе) сопряженной трубы. Для PMB: CdTe сопряжения в молярном соотношении 30:1, добавить 50 мкл 60 мкМ PMB. Добавить H 2 O или растворителем для КТ только трубки контроля.
- Если необходимо, добавьте 1 мл раствора EDC акции сопряженных трубку.
- Вызовите сопряженных объем до 0,5 мл соответствующего буфера (боратный буфер или PBS, не содержащие амины, такие как буфер Трис, как они будут препятствовать EDC).
- Щит труб от света алюминиевой фольгой, и место на nutator или рокер в течение 1 часа. Если агрегация происходит, повторите сопряжение с более низкими концентрациями антибиотика. Титруйте концентрация вверх, пока частиц не агрегат.
- Вымойте конъюгатов, проходя через соответствующий фильтр. 10000 молекулярный вес отсечка работает для большинства антибиотиков, но не для белков или антител.
В зависимости от молекулы, различные методы могут быть использованы для оценки количества антибиотиков молекул в КТ: поглощение или флуоресцентной спектроскопии, гель-электрофорез, или преобразование Фурье ИК-спектроскопии (ИК).
Представитель результаты. В этом примере PMB сопряжения характеризуется изменениями в КТ спектра излучения. На рисунке 2 показаны спектры CdTe КТ с PMB дополнение.
3. Подготовка бактерий в течение 96-и экрана, определения антибиотиков IC 50
Это относится практически к любой штамм бактерий, выращенных в соответствующей среде 18. Точная продолжительность записи следует продолжать зависит от бактериального роста. В нашем примере мы используем кишечной палочки, выращенные в лизогении бульон (LB) среды.
- Для того, чтобы выбрать подходящий КТ концентрации сопряжены, важно знатьIC 50 антибиотик быть сопряжены и, если КТ сами по себе токсичны. Это должно быть начато за 2 дня до сопряжения эксперимента. Вечером, семян 10 мл бактериальной питательной среде из свежих колонии, используя правильный стерильные и биологической техники.
- На следующий день за 1-2 часа до эксперимента, заполнить каждую из скважин ясно дно 96-луночного планшета с почти-максимальное количество питательной среде. Используя многоканальную пипетку, семян в каждую лунку с 1-50 мкл бактериальной культуры (концентрация будет зависеть от того, как быстро конкретный штамм растет и нужно будет калибровать вашей лаборатории).
- Поместите пластину на ридер и установить его для чтения каждые 10 минут в течение 2 часов при определенной длине волны (обычно 600 нм). Следить за тарелку так, чтобы бактерии не растут слишком плотно слишком быстро.
- Когда клетки все достижения OD = 0,1-0,15, удалить пластину из ридер и остановить запись.
- Добавить наркотиков в одиночку и только в КТразличной концентрации, по крайней мере triplicates. Используйте одну сторону пластинки, как "темный" контроль и половина для освещения. Предлагаемая схема приведена на рис 3. Концентрация должна охватить достаточно широкий диапазон включить один концентрации, подавляет бактерии, очень мало, и тот, который убивает их всех.
- Щит "темной" стороне пластины с алюминиевой фольгой. Вынести другой стороны, чтобы лампа на нужную длину волны. Мы используем пользовательский 96-а, 440-нм лампы из светодиодов 2,4 мВт (рис. 4) и облучают в течение 30-60 мин. Черные пластины с четко днища помочь защитить неэкспонированные бактерий из рассеянного света. Пустая колонка также может быть использована между экспозицией и ООН, подвергшихся воздействию сторон.
- После того, как освещенность, поставил пластинку в планшетов и запись OD 600 каждые 10 минут на 5-12 часов в зависимости от темпов роста. Держите температура <32 ° C, если возможно, чтобы избежать высыхания культур.
- Постройте кривые ростав выбранной точке времени по сравнению журнал [концентрации] и определения IC 50 антибиотиков с помощью уравнения Hill:

где Н-коэффициент Хилла, у макс является самой высокой точкой роста (в идеале на плато), и у мин является нулевым, и в идеале на плато. Маловероятно, что КТ только покажет гораздо токсичности для клеток в используемых концентрациях, поэтому значение не будет определено.
Представитель результаты. В конце периода записи, ясно скважин показывают полную гибель клеток, и градиент плотности клеток должны появиться по повышению концентрации препарата. Бактерии должны показать S-образный рост кривых (рис. 5), положение максимума плато будут существенно отличаться от штамма к штамму, а также зависит от температуры. Данный момент времени может бытьвыбрана в качестве представителя и значения нанесены против Вход [антибиотик], чтобы дать IC 50 (рис. 5 б). Для оценки токсичности КТ, выживание против Вход [QD] также могут быть построены, но достижение значительных бактериальных убийства с КТ только редко (рис. 5 С).
4. Подготовка бактерий в течение 96-и экран с антибиотиками / КТ
- За день до эксперимента, семян 10 мл культуры с новой колонии в соответствующие богатой среде, используя правильный стерильные и биологической техники. QD-антибиотик сопряженных должны быть готовы в этот день, если это крайне нестабильной.
- 1-2 часа до начала эксперимента, заполнить каждую из скважин ясно дно 96-луночного планшета с почти-максимальное количество питательной среде. Используя многоканальную пипетку, семян в каждую лунку с 1-50 мкл бактериальной культуры.
- Поместите пластину на ридер и установить его для чтения каждые 10 минут в течение 2 часов при той же длине волны, как в части 3.
- Когда клетки все достижения OD = 0,1-0,15, удалить пластину из ридер и остановить запись.
- Добавить КТ конъюгатов при различных концентрациях по крайней мере в четырех экземплярах. Используйте одну сторону пластинки, как "темный" контроль и половина для освещения. Предлагаемая схема приведена на рис 6. Бактерии только контрольная полоска должна всегда быть включен в случае проблем, связанных с культурой, температура и т.д. влияют на условия роста. Одной полосой наркотиков только и только КТ также должны быть включены, чтобы они соответствовали контроль пластина сделана ранее. Остальные скважины предназначены для конъюгатов для того, чтобы обеспечить хорошую статистику.
- Щит "темной" стороне пластины с алюминиевой фольгой. Вынести другой стороны, чтобы лампа на нужную длину волны.
- После того, как освещенность, поставил пластинку в планшетов и запись OD 600 каждые 10 минут на 5-12 часов. Держите температура <32 ° C, по возможности, избежать др.инь культур.
Представитель результаты. Сочетание КТ и антибиотиков может быть менее токсичен, чем антибиотик в одиночку, одинаково токсичны, или более токсичны. Это может быть количественно, используя кривые роста и IC 50 измерений. На рисунке 7 показан пример конъюгатов, одинаково токсичны как антибиотик в одиночку, и пример конъюгатов, которые являются более токсичными.
5. Пластина графа
- Выберите один или несколько скважин обработанных 96-луночного планшета, который будет использоваться для последовательного разведения и колонии счета.
- Сделать серийного разведения каждого из выбранных бактериальные образцы с PBS или физиологическим раствором (0,9% NaCl). Трансфер 20 мкл бактериальной решения и развести его с 180 мкл физиологического раствора, изменить кончик пипетки, перемешать и перенести 20 мкл разбавленного бактериальных решение до 180 мкл физиологического раствора. Повторить 6 раз.
- Возьмите 10 мкл из каждого разведения и пластины на соответствующие твердые пластины СМИ. Все 8 концентрации одного образца могут быть покрыты на 10 см вокруг чашки Петри, хотя прямоугольные блюда предпочтительнее, так как легче выстроить вещи.
- Дайте высохнуть на скамейке запасных в течение 15 мин. затем инкубировать в соответствующей температуры для бактерий в течение 16 часов.
- Граф колоний и рассчитать колониеобразующих единиц (КОЕ) в соответствии с (# колоний х коэффициент разбавления) / объем покрытием = КОЕ / мл.
На рисунке 8 показан пример пластины КОЕ.
6. Представитель Результаты

Рисунок 1. CdTe квантовых точек. (A) Восемь препаратов КТ CdTe освещается УФ палочка (365 нм). (B) поглощения и испускания из пяти выбранных размеров до и после растворения воды. Пунктирные линии спектра в толуоле, сплошные линии находятся в воде.
files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Спектральные и гель анализа КТ-PMB конъюгатов. Оранжево-излучающих КТ CdTe были использованы для этого примера влияния на другие типы квантовых точек нужно будет оцениваться для каждого эксперимента. (А) Типичное абсорбции (серая линия) и спектры излучения (черная линия) КТ до сопряжения PMB и излучения (пунктирная линия) после добавления 160 молярных эквивалентов PMB. (Б) отношения между отношением PMB и КТ интенсивности излучения (квадраты) и пик волны месте (треугольники).

Рисунок 3. Предлагаемое расположение пластин для контроля пластин роста. Широкий спектр PMB и КТ концентрации представлена. Одна половина пластинки облучают (выделены синим цветом), и такая же половина защищенном от света месте. Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.

Рисунок 4. Пользовательские 96-светодиодные лампы для равномерного облучения пластины, показывающий появление время от времени. Типичный ручной УФ-лампы также могут быть использованы, но не покроет всей пластинки равномерно.

Рисунок 5. Пример результатов для контроля пластин роста. (А) представитель бактериальной кривых роста с различной концентрацией препарата, от 0 до завершения гибели клеток. Открытые символы PMB только с концентрацией данного; твердой символы CdTe-PMB без облучения, а наполовину заполненной символы CdTe-PMB с облучением. Облучение не влияло на PMB только образцы, так что эти кривые были опущены для ясности. Все PMB-CdTe сопряженные 30:1 PMB: КТ отношений. (B) Участки значений кривой роста на 200 мин против Вход [PMB] и соответствует формуле. (1). В продолжениеРОЛ эффектов света, кривой осуществляется с помощью антибиотиков только 30 минут освещенности. (C) Бактериальный выживания на 200 минут по сравнению с КТ концентрации, используя CdTe квантовых точек. Некоторые токсичности наблюдается с освещенности, но слишком мало, чтобы определить значение IC 50. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 6. Предлагаемая схема для сопряженных пластинка теста. Сине-подчеркнул половина пластины должны подвергаться воздействию света, а unhighlighted половина защищены. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 7. Пример результатов для сопряженных пластинка теста. Кривая роста стоимости на 200 мин были плotted и подходит к уравнению. (1). (А)-CdTe PMB конъюгатов шоу увеличилась токсичность по PMB в одиночку. (B) наночастиц золота Au-PMB конъюгаты не проявляют токсичность увеличился на PMB в одиночку.

Рисунок 8. Пример пластины КОЕ. Е. палочки посеяны в 96-луночного планшета обрабатывали QD-PMB с или без облучения в течение 30 мин. Затем инкубировали при 32 ° C в течение 4 часов. Серийные разведения каждого бактериальных образцов были сделаны с физиологическим раствором, и 10 мкл 100 X 10 X 7 разведения высевали на агар пластин. Пластины инкубировали при 37 ° C и колонии были подсчитаны после 16 часов. Пластина показывает разведения по рядам, как указано, столбцы: (A) 0,06 мкм PMB + 2 нм CdTe, (Б) 0,12 мкм PMB + 4 нМ CdTe (C) 0,2 мкМ PMB + 6,7 нМ CdTe, (D) 0,06 мкм PMB + 2 нм CdTe облучении (E) 0,12 мкм PMB + 4 нМ CdTe облучении (F) 0.2 мкм PMB + 6,7 нМ CdTe облучениянеоблученных.