Здесь мы опишем метод выделения, культура и манипуляция мышиных эмбриональных поджелудочной железы. Это представляет собой отличное Бывших естественных условиях Система для изучения различных аспектов развития поджелудочной железы, в том числе морфогенез, дифференцировку и рост. Эксплантов поджелудочной бутон можно культивировать в течение нескольких дней и используются в диапазоне различных приложениях, включая все крепления иммунофлюоресценции и живые изображения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поджелудочная железа контролирует жизненно важные функции нашего организма, включая выработку пищеварительных ферментов и регуляцию уровня сахара в крови1. Хотя за последнее десятилетие многие исследования заложили прочный фундамент для понимания органогенеза поджелудочной железы, в наших знаниях о ранних этапах ее формирования все еще сохраняются значительные пробелы2. Полное понимание этих ранних событий позволит получить представление не только о развитии этого органа, но и о неизлечимых заболеваниях, поражающих поджелудочную железу, таких как диабет или рак поджелудочной железы. В конечном итоге эта информация послужит основой для разработки методов клеточной заместительной терапии при диабете.
В процессе эмбриогенеза поджелудочная железа развивается из отдельных эмбриональных выростов дорсальной и вентральной энтодермы передней кишки на 9,5 эмбриональный день (E) у зародыша мыши3,4. Оба выроста выпячиваются в окружающую мезенхиму в виде сплошных эпителиальных почек, которые подвергаются пролиферации, ветвлению и дифференцировке для формирования полностью зрелого органа2,5,6. Последние данные свидетельствуют о том, что рост и дифференцировка клеточных линий поджелудочной железы, включая инсулин-продуцирующие β-клетки, зависят от правильной архитектуры ткани, эпителиального ремоделирования и позиционирования клеток внутри ветвящегося эпителия поджелудочной железы7,8. Однако механизмы протекания морфогенеза ветвления и его координации с пролиферацией и дифференцировкой в поджелудочной железе остаются в значительной степени неизвестными. Отчасти это связано с тем, что современные знания об этих процессах развития основывались почти исключительно на анализе фиксированных образцов, в то время как морфогенетические события носят высокодинамичный характер.
В данной работе мы описываем метод препарирования и культивирования зачатков поджелудочной железы эмбрионов мыши ex vivo в чашках с стеклянным дном, что позволяет осуществлять прямую визуализацию развивающейся поджелудочной железы (Figure 1). Эта система культивирования оптимально подходит для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и, в частности, для имиджинга живых клеток. Эксплантаты поджелудочной железы могут быть получены не только из эмбрионов мышей дикого типа, но и из генетически модифицированных линий мышей (например, трансгенных или нокаутных), что позволяет изучать мутантные фенотипы в режиме реального времени. Кроме того, данная система культивирования ex vivo представляет ценность для изучения влияния химических соединений на развитие поджелудочной железы, позволяя получать количественные данные о пролиферации и росте, удлинении, ветвлении, тубулогенезе и дифференцировке. Таким образом, разработка метода культивирования эксплантатов поджелудочной железы ex vivo в сочетании с визуализацией высокого разрешения обеспечивает надежную платформу для наблюдения за морфогенетическими процессами и событиями дифференцировки, происходящими в развивающемся эмбрионе мыши.
Протокол
В протоколе описаны здесь была заимствована из метод, первоначально описанный в Персиваль и Slack 9 и оптимизирован для конфокальной микроскопии.
1. Покрытие стеклянной посуды Нижний культуры
Следующие шаги должны осуществляться в стерильных условиях в ламинарном боксе.
- Рак поджелудочной эксплантов культивируют в 35-мм чашки Петри с 20-мм стекла микролуночные нижней (например Маттек Corporation). Используйте один со стеклянным дном блюдо на эксплант культуры и на протяжении всего периода культуры. За день до вскрытия и изоляции поджелудочной почки, пальто со стеклянным дном лунок с фибронектина.
- Развести стерильной фибронектина в культуре клеток-класса воде до 50 мкг / мл конечной концентрации и добавить Минимальный объем его (~ 150 мкл) в 20-мм микролуночные пластин Маттек покрывающий всю поверхность стекла (рис. 1E). Поместите блюдВ 4 ° C холодильник для инкубации в течение ночи.
- В день вскрытия, аспирации фибронектин, промыть микролуночные с культурой клеток-класс воды и добавить минимальным объемом 150 мкл BME (базальной среде Игла) среде с добавлением Pen / Strep (1%), глютамин (1% ) и 50 мкг / мл гентамицина [Dissection Средний]. Оставьте покрытием блюд в ламинаре до готовности пластины эксплантов.
Если не все, покрытой фибронектином блюд используются, они могут храниться до 1 недели при температуре 4 ° C. Не дайте высохнуть блюд, наполнить их Dissection среднего и поместить их в холодильник.
В дополнение к фибронектин, поджелудочной железы эксплантов были успешно культивировать на различных подложках, таких как ламинин 9, 10,11 матригель или микропористых мембран 12. Из-за его воздействия на ветвление, мы используем 9 фибронектина в качестве субстрата.
2. Препарирование Dorsal Bud поджелудочной железы от E11.5 - E12.5 эмбрионов мышей
- Временный беременных самок мышей в эмбриональный день (E) 11,5 или 12,5 приносятся в жертву и эмбрионов собираются с использованием инструментов рассекает предварительно очищенную с 70% этанола. Поместите расчлененный матки в 10-см пластины, содержащие ледяной PBS, дополненной 50 мкг / мл гентамицина.
- В стереомикроскопа с подсветкой сверху, отдельные матки на отдельные сегменты эмбриона с помощью небольших ножниц или щипцов Дюмон, осторожно удаляйте мышц матки и удаление отдельных эмбрионов, которые окружены децидуальной. Используйте стандартные методы рассечения эмбриона от 13 до подвергать эмбрионов и удалить желточный мешок и амнион. Впоследствии, удалить верхнюю часть тела зародыша (на печени) и хвостовой области. Это позволит воздействием внутренних органов (рис. 1б). Передача середины тела эмбрионов в 10-см пластины, содержащие ледяной BME рассечение среды.
- Сейчасиспользовать только просвечивание снизу, визуализировать и анализировать спинной поджелудочной зародыше под стереомикроскопа. Аккуратно откройте середины тела эмбриона, сделав боковой разрез щипцами. Найдите желудка и селезенки. Спинной поджелудочной зародыше крепится сбоку на заднем области желудка (рис. 1С). Использование щипцов Дюмон, рассекают от спинной поджелудочной зародыше от смежных структур, таких как желудок и селезенка, но оставляя некоторый мезенхимы вокруг эпителия (рис. 1D). Использование стеклянной пипетки Пастера перенести изолированные почки в 35-мм чашки Петри содержащий холодную среду рассечение BME с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки [Культура Средний]. Повторяйте эти действия, пока все pancreata изолированы. Если pancreata различных генотипов изолированы, храните их отдельно использовании Nunc 4-луночные планшеты.
3. Покрытие и культуры поджелудочной Экспланты
Final платформыING эксплантов осуществляется в комнатной культуре ткани и / или в непосредственной близости к культуре ткани инкубатора свести к минимуму физическое движение культур.
- В стерильных условиях в ламинаре заменить BME Средний Dissection в покрытой фибронектином блюда Маттек с ~ 150 мкл культуральной среды BME предварительно нагревают при 37 ° C.
- Осторожно, передает поджелудочной железы эксплантов в покрытых блюд Маттек (один эксплантов за блюдо) для долгосрочного культуры с помощью стеклянной пипетки Пастера. Для обеспечения распространения в культуре, окружающей мезенхимы эксплантов может быть слегка разорван, если необходимо, с помощью тонкой иглы.
- Аккуратно поместите культуры в культуре ткани инкубатора (37 ° C, 5% CO 2) в течение нескольких часов, чтобы эксплантов приложить к лунки со стеклянным дном. Как только они присоединены, заполните Маттек блюда с 1,5 мл до 2 мл культуральной среды BME предварительно нагревают при 37 ° C. В день вскрытия называют день 0.
- Человекipulation культур эксплантов поджелудочной железы проводят в стерильных условиях в ламинарном боксе. BME культуральной среде меняется каждый день, если экспериментальные требования диктуют различные сроки (например, инкубационный эксплантов с химическими агентами). Эксплантов можно культивировать в этом состоянии в течение 5 дней до одной недели.
4. Всего крепления иммунофлуоресценции протокола окрашивания для поджелудочной Экспланты
Все шаги иммунофлюоресценции протокола (от фиксации изображения) осуществляется в том же блюдо Маттек, которая дает лучшее изображение, чем пластиковые дном блюдо. После фиксации культур поджелудочной железы эксплантов не нужно хранить в стерильных условиях.
- Аспирируйте BME культуральной среды и промыть эксплантов раза с 2 мл 1X PBS.
- Для эксплантов фиксации заменить PBS с 2 мл ледяной 4% параформальдегида (PFA) и поместить блюдо на льду в течение 20 мин. Swirl планшет слегка время отвремени, но избежать качания платформы, а эксплантов может отсоединить.
- Удалить PFA и мыть эксплантов в три раза с 2 мл 1X PBS в течение 10 минут каждый при комнатной температуре (RT).
- Блок с 2 мл блокирующий раствор (1X PBS + 0,1% Triton-X + 3% Donkey сыворотки) в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Развести первичных антител в блокировании решения и добавить ~ 150 мкл разведения непосредственно в 20-мм микролуночные пластин Маттек покрывающий всю поверхность эксплантов для инкубации в течение ночи при 4 ° C. Чтобы свести к минимуму физические движения, добавить первичные антитела к эксплантов непосредственно в холодной комнате (4 ° C). Для предотвращения испарения, перед добавлением антител, разместите Маттек пластин во влажной камере.
- На следующий день удаления раствора антител и вымыть три раза с 2 мл 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
- Развести вторичные антитела в блокирующем растворе [в соответствии с рекомендациями производителя, мы используем осла Alexa Fluor красителей вторичных антиорганов на разведении 1:750] и добавить ~ 150 мкл разведения непосредственно в 20-мм микролуночные пластин Маттек, покрывающий всю поверхность эксплантов, в течение 1-2 ч инкубации при комнатной температуре в темноте. Для ядерных counterstaining, включают Hoechst вместе с вторичным разведения антител. Для предотвращения испарения, перед добавлением антител, разместите Маттек пластин во влажной камере.
- Вымойте три раза с 2 мл 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
- Перед монтажом, мыть один раз 1X PBS, чтобы удалить Tween-20. Установить, добавив одну каплю водной среде монтаж (с защитой от выцветания) в 20-мм микролуночные пластин Маттек. Осторожно, накройте эксплантов с бокалом покровное. Избегайте пузырьков воздуха.
- Эксплантов на пластинах Маттек можно рассматривать под микроскопом стандартного фазового контраста или конфокальной микроскопии, в зависимости от целей эксперимента. Для конфокальной микроскопии анализа мы используем Zeiss LSM 700 перевернутой настройки. Установите соответствующие лазеры для флуорофоров насиздание Выберите цель, которая будет изображение нужной области поджелудочной эксплантов. 10X воды погружения цели подходят чтобы держать весь эксплантов в поле зрения. 40X целей воду или масло-погружение подходит сосредоточить внимание на конкретных регионов поджелудочной железы эксплантов с большим разрешением. Эксплантов может быть оптически разрез, а затем приобрела Z-стеки реконструирован в 3D, с использованием соответствующего программного обеспечения.
5. Онлайн-клеточной изображений протокол поджелудочной Экспланты
- Экологические настройки камеры: использовать экологические корпус и небольшой камере инкубации [с температурой и контроля CO 2], который сидит на столик микроскопа. Правильное культивирования эмбриональных поджелудочной железы требует стабильной температуре 37 ° C и контролируемой атмосфере увлажненного 5% CO 2. Подходит камерах имеются у нескольких поставщиков (Например, Zeiss, Nikon, Olympus). Соберите обогреватель окна и включите егоПо меньшей мере 1 час до начала изображения, чтобы позволить оборудования для разогрева и равновесие содержания СО 2 до 5%.
- Для покадровой визуализации поджелудочной железы культур эксплантов, мы используем Zeiss LSM 700 инвертированного микроскопа. Для лазеров и объективного выбора см. пункт 4.10.
- Пусть поджелудочной железы эксплантов приложить хорошо стеклянным дном блюдо перед началом живого изображения. [Мы обычно выполняют живые изображения, начиная с дня 1].
В ламинаре, аспирации и заменить эксплантов среде со свежей питательной среды BME, чтобы начать с оптимальными питательными условиях. - Аккуратно передачи эксплантов к микроскопу комнату и поместить блюдо Маттек в инкубационной камеры в держатель образца из конфокальной микроскопии.
- Подготовка цели (например, добавить масло или вода среды в соответствии с выбором погружения цели) и сосредоточить внимание на область интереса в эксплантов. Закройте экологической камеру правильно. Для предотвращения испарения при покадровойПриобретение водой погружения цели, вместо воды рекомендуется использовать вязкие жидкости погружения, которые являются коммерчески доступными (например, Zeiss Immersol W).
- Настройка интенсивности лазерного излучения, Z-стек параметры приобретение и временной интервал (см. также обсуждение для устранения неполадок). Начать эксперимент.
- После обработки изображений, экспорта Z стеки и все моменты времени и анализировать их с помощью соответствующего программного обеспечения (например, ImageJ, Volocity, Imaris, Гюйгенс).
6. Представитель Результаты
Спинной почек поджелудочной железы (вместе с окружающей мезенхимы) были вскрыты из мышиных эмбрионов между E11.5 и E12.5 и высевают непосредственно на стеклянное дно чашки для культивирования (рис. 1). Кровеносные сосуды присутствуют в окружающей мезенхимы и эпителия могут быть визуализированы иммунным для эндотелиальных маркеров PECAM 12 (данные не представлены). После двух дней культуры, поджелудочной железы унд эксплантовerwent значительный рост и начали объединяться в разветвленных эпителиальных структур, ядра которых были положительными на транскрипционный фактор, поджелудочной железы, Pdx1 (рис. 2A-C). Средняя г-толщина поджелудочной железы эксплантов на 3 день культуры составляет 60-80 мкм. Поверхности и объема эксплантов может быть измерена с помощью соответствующего программного обеспечения (например, Гюйгенс). Морфология и иммунофлюоресценции анализ показал, что поджелудочной железы эксплантатов культивировались с использованием этого протокола воспроизводятся в естественных условиях ранней дифференциации поджелудочной железы и морфогенетических событий 5,10,11,14 (рис. 2). Рак поджелудочной эксплантов на 4-й день культуры прошли типичный "наконечник и ствол" сегрегация эпителия 8 отображение cpa1 + клеток-предшественников на концах эпителиальные ветвей (рис. 2С) и дифференцированные + инсулин и глюкагон +-клеток организованы в кластеры внутри ствола (рис. 2D ). Кроме того, pancreatiС эпителия в бывших культур естественных условиях показали, правильную организацию цитоскелета и клеточной полярности, с апикальной локализации F-актин (рис. 2E, в зеленом) и b1-интегрина в базальных мембран (рис. 2E, красного цвета).
Для изучения поджелудочной железы ветвление в реальном времени, эмбриональной поджелудочной железы эксплантов были изолированы от двойного цвета флуоресцентных мышей штамма репортер membrane-Tomato/membrane-Green 15 (мТл / мг; мыши штамма доступен в Jackson Laboratory) (рис. 3). Кадры из покадровой фильм мТл / мг поджелудочной железы эксплантов, выращенных в культуре показано на рисунке 3. Локализация мТл флуоресцентного белка с мембранными структурами общих чертах морфологии клеток и позволяет разрешение штрафа клеточные процессы, позволяющие отслеживать реконструкции и миграции клеток с течением времени.
После 12-часов покадровой эксперимента сигнал мТл флуоресценции остается жизнеспособной и детеCTable, хотя его интенсивность снижается, скорее всего, из-за фотостарения (рис. 3). Технические решения, чтобы избежать или уменьшить фотостарения и фототоксичности обсуждается в разделе обсуждения.
Рисунок 1. Схематическое изображение спинного рассечение почки поджелудочной железы E12.5 эмбрионов мыши. (A) Светлое изображение E12.5 эмбрионов мыши. Верхняя часть тела зародыша (на печени) и хвостовой области удаляются, чтобы изолировать середины тела (B). Разрезы показаны красными пунктирными линиями. (C) Дальнейшие результаты рассечение в воздействии на желудке и двенадцатиперстной кишке область (показано пунктирной рамке). Спинной поджелудочной зародыше (см. красная пунктирная окружность) на базе живот и рядом с селезенкой зачатке. Расчлененный бутон спинной поджелудочной железы (D) переносится с пипетки Пастера в микролуночные в блюдо со стеклянным дном содержащие BME культуральной среде (E, F). Сокращения: СТО (желудок), SP (селезенка), DP (спинной поджелудочной зародыше), дуэт (двенадцатиперстной кишки). Шкала баров, 1000 мкм (A, C).
Рисунок 2. Всего крепления конфокальной иммунофлуоресцентного анализа культур поджелудочной железы эксплантов. (A) Светлое изображение поджелудочной железы эксплантов в день 1 и день 2 бывших культуры естественных условиях. Красная пунктирная линия показывает начало ветвления эпителия. (B) 3D-реконструкция целого крепление для иммунной Pdx1 на 3 день поджелудочной железы культуры. Рак поджелудочной эксплантов показал канальцев Pdx1 + клеток происходят широкие разветвления по 48 часов культур. (C) Всего крепления иммуноокрашивания дня 3 поджелудочной железы эксплантов с антителами против маркера базолатеральной мембраны E-кадгерина (ECAD), маркер чаевые предшественников, карбоксипептидазы 1 (Cpa1) и фосфорно-гистона H3 (pHH3). Большинство из митотического активных pHH3 + клеток локализуются на периферии советы с Cpa1 + клеток. Штриховые лИнес указывают кончик ветки. (D) Всего крепления иммуногистохимическое эндокринной линии маркеров, инсулин (Ins) и глюкагон (Gluca) на 3-й день. Желтые стрелки указывают кластеров Ins + и Gluca + клеток. Врезка (D '), более высоким увеличением одного из кластеров клетки эндокринной системы. (E) Всего крепления иммуноокрашивания дня 3 поджелудочной железы эксплантов для Pdx1, β1 интегрином (β1int) и F-актин (факт). Мезенхимальных клеток (звездочки) перемежаются между Pdx1-позитивных эпителиальных клеток. Показаны изображения в C, D и Е являются одним конфокальной оптической разделы Z-серии. Шкала баров, 100 мкм (A, B); 50 мкм (CE).
Рисунок 3. Представитель живых клеток изображениями бывших естественных условиях культурного эксплантов поджелудочной железы. (AD) Кадры из покадровой фильм поджелудочной железы эксплантов из мТл / мг эмбрионов мышей трансгенными. Время визуализации показан на часы: минуты. Эксплантов была отображаемого начиная с 1 день. Z-стек изображенийбыли приобретены с целью 40X иммерсионного масла каждые 12 мин в течение в общей сложности 15 часов. Пунктирные линии чаевые филиалов и границы между эпителием и мезенхимы. Шкала бар, 50 мкм.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
После поджелудочной железы судьба указано, предшественники клеток поджелудочной железы проходят обширные пролиферации, дифференцировки и морфогенеза, в конечном счете сформировать зрелое и функциональный орган 2,4. В настоящее время, как ветвление происходит в поджелудочной железе, и как это связано с распространением предшественников и дифференциация в значительной степени неизвестными. Культур поджелудочной эксплантов представляют собой идеальное система выяснения этих процессов бывших естественных усло...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Исследования в Spagnoli лаборатории. финансируется за счет Гельмгольца, FP7-IRG-2008-ENDOPANC грантов и ERC-2009-начала HEPATOPANCREATIC Грант.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии |
| Антитела: Карбоксипептидаза E-кадгерина F-актин Глюкагон Инсулин β1-интегрина Pdx1 Pdx1 Фосфо-гистона H3 | Абд Serotec Invitrogen Молекулярные зонды ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma банка Сотовые сигнализации | 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 | |
| Базальная среду Игла (BME) | Сигма | B1522-500ML | Хранится в стерильных условиях |
| Клеточные культуры классе воды | PAA | S15-012 | Хранится в стерильных условиях |
| Культура блюд (со стеклянным дном), 35-мм | Маттек корпорации | P35G-0-20-C | |
| Donkey сыворотки | Chemicon | S30-100 мл | |
| Эмбриональной телячьей сыворотки золото | PAA | A15-151 | Хранится в стерильных условиях |
| Фибронектин | Invitrogen | 330100-8 | Со-Соль. 1 мг / мл в клетку воду, содержащую культуру |
| Гентамицин | Invitrogen | 15750-037 | Хранится в стерильных условиях |
| Глутамин | Invitrogen | 25030-024 | Хранится в стерильных условиях |
| 4-а Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Микроскопы: Перевернутый конфокальный микроскоп (LSM 700) Стереомикроскоп (Discovery V12) | Zeiss Zeiss | Цели: C-Apochromat 10х / 0,45 W M27 (work. расстояние 1,8 мм;. Глубина визуализации ~ 100 мм), C-Apochromat 40X / 1,2 Вт Corr M27 (work. расстояние 0,28 мм;. ~ Изображениями глубиной 50 мкм) Просвечивание снизу и волоконно-оптической подсветкой сверху | |
| Параформальдегид | Рот | 0335,3 | Раствор 20% |
| Пастера Pipet (Glass), 150 мм | VWR | HECH567 / 1 | |
| Пенициллина / стрептомицина | PAA | P11-010 | Хранят в стерильной Сonditions |
| Чашки Петри, 60 мм | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Чашки Петри, 35 мм | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH 7,4 | PAA | H15-002 | Хранится в стерильных условиях |
| Весна Ножницы 8 мм лезвия изогнуты | Средства изобразительных наук | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Рот | 3051,3 | |
| Часовщика анатомические Дюмон # 5 | Рот | K342.1 |
Ссылки
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
- Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
- Hick, A. -C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
- Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
- Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
- Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
- Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
