Планарии иммобилизации, частичное облучение, и тканей

Краткое содержание

Эффективный метод для пересадки ткани определенной и последовательной размер между планарии описано. Также имеется описание того, как иммобилизация метод, используемый для трансплантации могут быть адаптированы в сочетании с ведущим щиты, для частичного облучения животных.

Аннотация

Планарий, пресноводный плоский червь, оказался мощной системой для анализа регенерации многоклеточных и биологии стволовых клеток^1,2. Планарная регенерация любых отсутствующих или поврежденных тканей становится возможной благодаря взрослым стволовым клеткам, называемым необластами³. Несмотря на то, что было окончательно доказано, что эти стволовые клетки являются плюрипотентными и единственно способными восстанавливать целое животное⁴, гетерогенность в популяции стволовых клеток и динамика их клеточного поведения остаются в значительной степени нерешенными. В связи с большим количеством и широким распределением стволовых клеток по всему планарию тела необходимы передовые методы манипулирования субпопуляциями стволовых клеток для молекулярного и функционального исследования in vivo.

Трансплантация тканей и частичное облучение - это два метода, с помощью которых можно выделить субпопуляцию планарийных стволовых клеток для дальнейшего изучения. Каждый метод имеет явные преимущества. Трансплантация тканей позволяет вводить стволовые клетки в наивного хозяина, которые либо по своей природе генетически отличаются, либо ранее лечились фармакологически. В качестве альтернативы, частичное облучение позволяет изолировать стволовые клетки в организме хозяина, сопоставленные с тканями, лишенными стволовых клеток, без введения раны или нарушения целостности тканей. Используя эти два метода, можно исследовать автономные и неавтономные факторы клеток, которые контролируют функции стволовых клеток, такие как пролиферация, дифференцировка и миграция.

Как трансплантация тканей^5,6, так и частичное облучение⁷ исторически использовались для определения многих вопросов регенерации планарий, которые остаются изучаемыми и сегодня. Тем не менее, эти методы остаются недостаточно используемыми из-за трудоемкого и непоследовательного характера предыдущих методов. Представленные здесь протоколы представляют собой большой шаг вперед в сокращении времени и усилий, необходимых для воспроизводимого получения большого количества привитых или частично облученных животных с эффективностью, приближающейся к 100 процентам. Мы охватываем выращивание крупных животных, иммобилизацию, подготовку к частичному облучению, трансплантацию тканей и оптимизацию восстановления животных. Кроме того, описанная здесь работа демонстрирует первое применение метода частичного облучения для использования с наиболее широко изученной планарией Schmidtea mediterranea. Кроме того, эффективная трансплантация тканей в планариях открывает двери для функционального тестирования субпопуляций наивных или обработанных стволовых клеток в анализах на репопуляцию, что уже давно является золотым стандартом метода анализа потенциала взрослых стволовых клеток у^{млекопитающих.} Широкое внедрение этих методов, несомненно, приведет к лучшему пониманию клеточного поведения взрослых стволовых клеток во время гомеостаза и регенерации тканей.

Протокол

Примечание: этот протокол предполагает использование потенциально опасных материалов (свинец и chloretone). Приобретать, читать и следовать MSDS для всех потенциально опасных материалов.

1. Животное культуры, селекция и подготовка

1. Для культуры животных и обращения с использованием планарий воды (1X Монжуик соли ⁹⁾ и пластиковые пипетки передачи.
2. Сексуальные биотип Schmidtea Mediterranea могут быть использованы при поднятых в лаборатории при нормальных условиях культуры ^10. Для получения бесполого образцы необходимого размера, С. Mediterranea подняты при комнатной температуре при нормальных условиях ⁹ должны быть поданы в двойной утроить нормальной частоты (2-3 раза в неделю) в течение одного-двух месяцев до начала использования. Кроме того, бесполое животных, которых кормили при нормальной частоте может быть в 10 градусов по Цельсию на неопределенное время в целях увеличения их среднего размера.
3. Выберите животных, от 1 до 2 смДлина и шире, чем 2 мм, то голодать животных 3-7 дней до начала использования.
4. При выполнении любых фармакологических или радиологического лечения от предполагаемого хостов, доноров или частично облученных животных, выполнять лечение (ы) в этой точке.
5. Если фармакологическое лечение было проведено, что требуется кормление животных, животные голодают дополнительные 3 до 7 дней до начала использования.

2. Подготовка решений и материалов

1. Подготовить chloretone решение, мягкий местной анестезией, при растворении 0,1-0,2% вес / объем chloretone в планарии воды и охлаждения раствора на лед.
2. При выполнении частичного облучения только, переходите к шагу 2.7. Для трансплантации тканей продолжают на шаг 2.3.
3. С помощью горелки Бунзена, согните 0,75 мм внутреннего диаметра, используемых для резки ткани трансплантата, и 0,7 мм внешний диаметр, используются для создания отверстий в принимающей который получит трансплантата, капиллярных трубок на 90 градусов на 1-2 см С конца еч трубку. Для экономии материалов, согните оба конца каждого капилляра и разорвать их пополам, чтобы производить два разных инструмента. Будьте осторожны, не пламя самого конца трубы.
4. Вырезать следующие документы указанного размера:
   • Черный фильтровальной бумаги (нарезать прямоугольниками примерно. 2,5 см х 1,5 см)
   • Ватман № 3 фильтровальной бумаги (нарезать прямоугольниками примерно. 2 см х 0,5 см)
   • Kimwipe (в сложенном и нарезать около пачки. 3 см х 0,5 см х 4-слойные)
   • Сигареты прокатки бумаги (убрать резинку полосу и нарезать прямоугольниками примерно. 3 см х 2 см)
5. Подготовить изменения в решение Holtfreter (3,5 г / л NaCl, 0,2 г / л NaHCO _3, 0,05 г / л KCl, 0,2 г / л MgSO _4, 0,1 г / л CaCl _2, рН 7,0-7,5) и казеина насыщенный раствор Holtfreter и холод и до 4 ° C.
6. Прикрепите сложенную Kimwipe на площади парафильмом и место на пластинчатый охладитель Пельтье или другое устройство охлаждения, расположенные под микроскопом рассечения. Пропитайте Kimwipe с охлажденной Holtfreter в растворе и место две черные прямоугольники фильтр бумаги на Kimwipe.
7. Линия чашки Петри с Ватман № 2 фильтровальной бумаги. Смочите фильтровальную бумагу с решением Holtfreter и охладить посуду на лед. Для частичного облучения большие блюда и фильтр лайнер бумага может быть использована.

3. Обезболивания и иммобилизации

1. Наполните чашку Петри с охлажденной решение chloretone и пипетки червей в блюдо. Для пересадки только обезболить одного хозяина и одного донора за один раз. Для частичного облучения числа (п> 10) животные могут быть под наркозом сразу.
2. Позвольте червям, чтобы впитать в chloretone решение пока они не становятся неподвижными (5-10 мин).
3. Промыть червей с помощью пипетки их в блюдо заполнены раствором охлажденного Holtfreter в.
4. Остановите животных с помощью пипетки их на черный бумажный фильтр насыщенный раствор охлажденной Holtfreter и ориентировать их вентральной стороной вниз щипцами. Если животные способны LOCомотэ, впитывают избыток Holtfreter решение, в немного снизить температуру вашего Пельтье или холодной пластины, или увеличить длину chloretone лечения.

4. Частичные облучения

Примечание: Выполните следующие действия для подготовки животных для частичного облучения. При выполнении трансплантации вместо этого перейдите к разделу 5.

1. Поместите охлажденные чашки Петри с шагом 2.7 на лед в ведерке со льдом, который будет соответствовать внутри верхнего источника рентгеновского излучателя.
2. Упорядочить анестезии животных в чашке Петри, двигаясь черный фильтровальную бумагу, на которой они закреплены. Используя пинцет для перемещения под наркозом червей непосредственно может повредить им.
3. Транспорт расположены животных верхней источник рентгеновского излучателя и расположить ведерко со льдом, что расстояние от катода трубки животных сведена к минимуму, при этом максимально эффективной дозы.
4. Позиция свинцовый экран (ы) (рис. 1) между животными и катодом тВБО как хотелось бы. Щиты должны быть от 4,5 до 6 мм, чтобы обеспечить от 97 до 99% ослабление 325kV рентгеновского пучка ^11.
5. Доставка дозу рентгеновского облучения. Если полное удаление стволовых клеток из неэкранированных регионов желании поставлять в дозе 30 Гр и более использованием рентгеновского излучателя. Для сравнения, 30 Гр эквивалентно 3,6 минуты при 320 кВ и 10 мА в точности X-Ray Инк XRAD320 с полем-исток расстоянии 30 сантиметров.
6. Сразу после приема завершения обработки черви черные фильтровальной бумаги, передача животных в охлажденную воду планарии. Позвольте планарии вода нагреться до комнатной температуры и животных, чтобы выбить себя из черного фильтровальной бумаги. Процедура частичного облучения завершена.

5. Трансплантации тканей

1. С помощью пипетки передачи и щипцы, организовать анестезии хозяина и донора червей на отдельные прямоугольники черного фильтровальную бумагу на Kimwipe который был охлажден на шкуркиэ или холоднее пластины под микроскоп рассечения.
2. Использование 0,75 мм внутреннего диаметра капилляра вырезать трансплантат вилку из доноров и с помощью пинцета, поместить его на в сторону часть хоста. Если привитой материал застревает в капиллярной трубке, выбить щипцами.
3. Использование 0,7 мм наружный диаметр капилляра удалить заглушку с хозяином и с помощью щипцов позицию трансплантата в отверстие, которое осталось позади.
4. Передача пересаженных хозяин на черном прямоугольнике фильтр бумагу в чашке Петри, подготовленный в шаге 2.7.
5. Смочите кусочек прокатки бумаги с решением казеин насыщенных Holtfreter и поместите его на верхнюю часть пересаженных хост схематически на рисунке 2А.
6. Замочите четыре части фильтровальной бумаги в насыщенный раствор казеина Holtfreter и заключите пересаженной хост схематически на рисунке 2Б.
7. Замочите четыре пачки разреза Kimwipe в насыщенный раствор казеина Holtfreter и положите их нафильтровальная бумага с шагом 5.6 (рис. 2В). Замените крышку и поставил чашку Петри на льду.
8. Передача доноров червей планарий в воде, чтобы оправиться, лечить и восстанавливать.
9. Когда все пересадки будут завершены, разместить пересаженных червей на 10 ° C инкубатор ночь.
10. На следующее утро, стараясь не нарушить трансплантата, обнаружить червя и передать его (на черном фильтровальной бумаги) в чашке Петри наполненный водой планарии.
11. Либо позволить червь выбить себя из фильтровальной бумаги или аккуратно удалить пинцетом.
12. Изменение планарии воды раз в 2-3 дней.

6. Представитель Результаты

Сразу же после частичного облучения планарии появится нормальный и не влияет. В зависимости от введенной дозы и геометрии щит используется, облученной ткани может регрессировать и даже распадаются ^7. Экранированный ткани должны оставаться нетронутыми. Фолляблагодаря регрессии ткани и потере целостности тканей, бластемы образуют структуры и пропавших без вести будут восстановлены (рис. 3А). Если ампутация производится в частично облученные области, облученных тканей будет спасен (т.е. помешали регресс или распадающейся) (рис. 3В). В обоих неповрежденной и ампутировали случае регенерация будет отложено, по сравнению с ампутированной необлученных планарии (рис. 3). Если дозу рентгеновского облучения в дозе 30 Гр была поставлена ​​и частично облученных животных была неповрежденной, успешное удаление стволовых клеток в образце, соответствующих ведущим щит использовали могут быть подтверждены 2 до 3 дней после частичного облучения в гибридизация для стволовых клеток Маркер SMED-Piwi-1 ¹² (ака smedwi-1) (рис. 4).

Утром после трансплантации, успешный трансплантата из пересаженной ткани должно быть очевидно, Within ткани хозяина, привязав как спинной и брюшной поверхности хозяина (рис. 5а). Иногда, взяточничество будет придерживаться только передние или задние поверхности. Если трансплантация была полностью неудачной, никаких признаков трансплантат будет виден из любой спинной и брюшной поверхности хозяина (рис. 5б). Вскоре после успешного трансплантат из необлученных тканей в хозяина, которая была удалена из стволовых клеток летального облучения ^13,14, в гибридизация для SMED-Piwi-1 показали, что стволовые клетки присутствуют в основном в трансплантат (Рис. 5C ). Кроме того, успешные пересадки необлученных тканей в летально облученных узлов приведет к спасению тканей хозяина и выживания в долгосрочной перспективе принимающей ^15.

Рисунок 1. Общее расположение основных компонентовс частичной облучения. В рентгеновского излучателя с верхней расположен источник рентгеновского излучения (катод трубки) планарий под наркозом расположена непосредственно под источником рентгеновского излучения в пределах поля облучения. В целях максимального рентгеновского дозы, расстояние между планарии и источник рентгеновского излучения должны быть минимизированы. Свинцовый экран должен быть расположен между трубой катода и под наркозом червя, как можно ближе к червь, как практический. Свинцовой защиты должны быть разработаны, изготовлены и расположены так, что он защищает желаемой ткани, но полностью раскрывает остальных червя. Многие коммерческие производители будут производить пользовательские щита провод от простой схемы разработки, и мы успешно использовали Альфа системы корпорации (Bluffdale, UT). Ведущий должен быть достаточно толстым, чтобы обеспечить нужное количество экранирования. Например, если почти полное экранирование 320 кВ рентгеновского луча желательно, ведущего должно быть от 4,5 до 6 мм. Планарии и щитом расположены нафильтровальная бумага пропитанная Holtfreter, выровненный чашки Петри, которая опирается в ведерке со льдом. Учитывая достаточно большой рентгеновский поле облучения, а также ряд одинаковых щитов свинца, многие образцы могут быть частично облученных в одно время (не показан).

Рисунок 2. Строительство восстановления камеры. (A) в разобранном виде восстановления камеры трансплантации тканей, с указанием всех компонентов, которые накладываются друг на друга после того, пропитанной казеин насыщенный раствор Holtfreter в. (B) почти завершена восстановления камеры, иллюстрирующие блокировки размещения Ватман № 3 фильтра прямоугольники бумаги, плотно закрывать анестезии планарии, препятствуя движению во время заживления. Тщательный строительство восстановления камеры предотвращает перемещение животных и высыхания, способствуя быстрому заживлению и большей эффективности трансплантации тканей.

Рисунок 3. Представитель результаты простых задних частичного облучения. Как Дюбуа описал ^7, (А), когда в задней половине планарий были защищены со свинцом и затем подвергается рентгеновского облучения передней ткани наблюдается регресс к границе между облученным и экранированным ткани, при котором точки непигментированных бластемы образуются и животные начали восстанавливаться. (B) С другой стороны, когда животные были обезглавлены в том же частичное облучение проводится в (A), ткани регрессии не наблюдалось, а остальные облученных тканей передней был спасен. Обезглавлены частично облученных животных регенерировать головы (B), однако, регенерация со значительной задержкой по сравнению с необлученным обезглавленное контроля (С).

Рисунок 4. Представитель outcoМне частичного удаления стволовых клеток после частичного облучения. Всего монтажа в гибридизация (желание) для маркера стволовых клеток SMED-Piwi-1 показывает, что дикие планарии тип стволовых клеток, были распространены по всей их тела, за исключением тканей впереди фоторецепторов (стрелки) и глотки собственных (звездочка) ^14. (A) ЖЕЛАЕМ для SMED-Piwi-1 в облученных, но полностью экранированы контроль планарии фиксированной три дня после облучения показывает распределение стволовых клеток, что не отличается от дикого типа планарии. (B) С другой стороны, желание стать SMED-Piwi-1 у животных, которые были лишь частично экранированы, в результате чего передняя и задняя подвергается, но были также исправлены три дня после облучения показывает, что стволовые клетки удалена из неэкранированных регионах . Масштаб баров 500 мкм.

Рисунок 5. Examples удачных и неудачных тканей. (A) изображения в реальном времени спинной и брюшной виды успешно пересадили планарии трех дней после трансплантации. Трансплантата (указано) отчетливо видна как на спинной и брюшной поверхности и окружен с характерным непигментированных ткани на трансплантат хост-интерфейс. (Б) Соответственно, неудачная трансплантация не отображать видимые ткани трансплантата на месте трансплантации (указанных) и вместо того, чтобы показать, исцелил, непигментированных, боковые раны после неудачной трансплантации. Трансплантат, который придерживается только спинной или брюшной поверхности может напоминать успешной трансплантации (A), если смотреть с одной стороны и неудачной трансплантации (B), если смотреть с другой. (C) Когда дикого типа (WT) тканей привитых в облученных хоста, которая была удалена резидентов стволовые клетки и пересаженные стволовые клетки позже выяснилось, по желанию для SMED-Piwi-1 через два дня после трансплантации,Успех трансплантации четко отображаются конкретные присутствие стволовых клеток только в пределах и вокруг трансплантата место (наконечники стрел). Масштаб баров 500 мкм.

Обсуждение

Важность иммобилизации

Иммобилизация на сегодняшний день является наиболее важным шагом для успешного завершения любой из этих процессов. Если планарии неправильно иммобилизованных до частичного облучения, они могут двигаться под свинцовый экран, производя непоследовательной и смешанные результаты. Кроме того, если животные недостаточно иммобилизованных после трансплантации, принимающих червь, скорее всего, отказаться от привитой ткани, что приводит к недостаточности трансплантата лечить должны...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
General Purpose передачи пипетки	Samco	691
Капиллярные трубки (ID 0,75 мм)	FHC	30-30-0
Капиллярные трубы (диаметр 0,7 мм)	FHC	30-50-08
Парафильмом M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
Черный фильтровальная бумага	Шлейхер и Schuell	10310809
Ватман № 2 фильтровальной бумаги 1002-055	Fisher Scientific	09-810B
Ватман № 3 фильтровальной бумаги 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
Сигареты прокатки бумаги	Zig-Zag, оригинальные	Не Доступно
Петрипосуда	VWR	82050-544
Пинцет Дюмон, INOX # 5	FST	11251-20
Chloretone	Sigma Aldrich	112054
Казеин	Sigma Aldrich	C3400
Ведущий Шилдс	Альфа-системы корпорации, Bluffdale, UT	Нестандартная конструкция
XRAD-320 биологических облучатель	Precision X-Ray, Северном Брэнфорд, CT	Не Доступно