Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеристика молекулярных механизмов

9.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4016

⸱

28 ноября 2012 г.

 ,  , 
1St. Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, 2Gullstrand lab, Section for Ophthalmology, Department of Neuroscience, Uppsala University

В этой статье

Краткое содержание

Катаракта является ведущей причиной слепоты в мире. Солнечное ультрафиолетовое излучение (УФО) является основным фактором риска развития катаракты. Животной модели пока УФО-B индуцированной катаракты была разработана. В этой статье мы опишем методы исследования катаракты: воздействие ультрафиолетового излучения, количественный RT-PCR и иммуногистохимии.

Аннотация

Катаракта является ведущей причиной слепоты в мире 1. Всемирная организация здравоохранения определяет катаракты, помутнение хрусталика глаза, который препятствует передаче света. Катаракта является многофакторное заболевание, связанное с сахарным диабетом, курением, ультрафиолетовым излучением (УФО), алкоголь, ионизирующая радиация, стероиды и гипертонии. Существует сильная экспериментальная 2-4 и эпидемиологических данных 5,6, что ультрафиолетовое излучение вызывает катаракту. Мы разработали модель животных для UVR B индуцированной катаракты в обоих наркозом 7 и без анестезии животных 8.

Единственное лекарство от катаракты является операция, но это лечение не является доступным для всех. Было подсчитано, что задержка наступления катаракты в течение 10 лет может уменьшить необходимость для хирургии катаракты на 50% 9. Чтобы задержать заболеваемости катарактой, это необходимо для понимания механизмов формирования катаракты и найти эффективную стратегию профилактикигий. Среди механизмов развития катаракты, апоптоз играет важную роль в инициировании катаракты у человека и животных 10. В центре нашего внимания в последнее время апоптоза в объектив, как механизм для развития катаракты 8,11,12. Предполагается, что лучшее понимание влияния ультрафиолетового излучения на пути апоптоза обеспечит возможности для открытия новых фармацевтических препаратов, чтобы предотвратить катаракту.

В этой статье мы расскажем, как катаракта может быть экспериментально индуцированной в естественных условиях воздействия УФО-B. Далее RT-PCR и иммуногистохимии представлены как инструменты для изучения молекулярных механизмов УВР-B индуцированной катаракты.

Протокол

1. Воздействия ультрафиолетового излучения

  1. 15 мин до облучения, обезболить женщины Sprague-Dawley крыс смесью 90 мг / кг Ketalar (кетамин) и 10 мг / кг Rompun (ксилазина) путем внутрибрюшинного введения.
  2. Поместите животных в крысу фиксатор и затянуть пояса до иммобилизации крыс, не вызывая сжатие ствола 13.
  3. Привить Mydriacyl (тропикамид), 10 мг / мл, в оба глаза крыс, чтобы вызвать расширение зрачков.
  4. Поместите животное так, что один глаз находится напротив узкого луча ультрафиолетового излучения при 300 нм 14 с 10 нм полная ширина на половине максимальной и оградить контралатерального глаза с черной лентой.
  5. Expose крыс в одностороннем порядке суб-пороговая доза 1 кДж / м 2 УВР-B при 300 нм в течение 15 мин 15.

2. Диссекция

  1. После предопределенного после воздействия интервала (1, 5, 24 и 120 ч), пожертвовать шесть недельных крыс (вес <200 г) с карбоп удушения газом и вывих шейных позвонков.
  2. Выяснять глаза. После этого положить роговицы глаза вниз, задняя сторона. Затем удар минимальным отверстием, применив 27-калибровочного канюли и нажмите касательной к склере, чтобы избежать повреждения линзы, которая очень близка к склере. Затем с помощью ножниц глазной хирургии, чтобы сократить окружности позади лимба до задней части склеры могут быть сняты. Затем поднимите объектив с тупым изогнутым пинцетом.
  3. Удалите остатки цилиарного тела от объектива экватору под микроскопом, сохраняя линзы в сбалансированном солевом растворе не более чем на 5-10 мин.

3. Количественная RT-PCR

  1. Поместите линзу в смесь 350 мкл буфера для лизиса RA1 (NucleoSpin РНК II общей РНК изоляции комплект) и 3,5 мкл β-меркаптоэтанола в 2 мл трубки Эппендорф.
  2. Храните линзы в эту смесь в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Однородный объектив сиглу, пока только жесткие ядро ​​хрусталика, что осталось от объектива (кора и капсулы хрусталика лизируют в буфере для лизиса). Удалите ядро ​​из смеси.
  4. Магазин образцы сразу же при -70 ° C.
  5. Разморозить образцы и следовать протоколу "Total очистки РНК из культивируемых клеток и тканей" (NucleoSpin РНК II общей РНК изоляции комплект).
  6. Магазин РНК образцы при -70 ° C.
  7. Чтобы убедиться в достаточном удалении ДНК из каждого образца, запустить ПЦР при следующих условиях (шаг 1: 95 ° C в течение 2 мин; шаг 2 для 40 циклов: 95 ° C в течение 20 сек, 55 ° C в течение 20 сек, 72 ° C в течение 20 сек; шаг 3: 72 ° C в течение 7 минут) с p53 ДНК специфических праймеров, вперед 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 'и обратный 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' и Taq ДНК-полимеразы (dNTPack), по производству протокол. Ожидаемый продукт ПЦР составляет 243 пар оснований.
  8. Выполнить 1,5% агарозном гель-электрофореза для выявления ДНК конкретного продукта ПЦР из 243 пар оснований. Для подготовки1,5% агарозном геле в буфере TBE принять 3,75 г агарозы и решить ее в 250 мл буфера TBE. Добавить бромид этидия (0,5 мг / мл) 500 мкл в 500 мл 1,5% раствора агарозном геле. Нагрейте смесь в микроволновой печь и размешать, чтобы решить агарозы.

Ни один из образцов должен раскрыть любую ДНК специфических продуктов ПЦР на 1,5% агарозном гель-электрофореза.

  1. Измерение концентрации образцов РНК (1 мкл) и соотношение образца поглощения при 260 нм (РНК) и 280 нм (белок) в NanoDrop ND-1000 спектрофотометр. Если отношение РНК к белку поглощения образца РНК составляет 2,0 или более образцов РНК чисто. Если коэффициент поглощения образца РНК ниже, чем 2.0, повтор РНК стадии очистки 3.5.
  2. Возьмите объем пробы РНК, соответствующей 1 мкг и синтезировать ДНК в соответствии с протоколом 1-й Strand набора для синтеза кДНК (1-й Strand набора для синтеза кДНК для RT-PCR).
  3. Храните образцы ДНК при температуре -20 ° C(На срок от 1 и более лет, хранят при температуре -70 ° C).
  4. Выполнить количественного ПЦР в реальном времени на iCycler MyiQ одноцветные системы реального времени обнаружения ПЦР. Нагрузка трех повторах на 96-луночный планшет с 1 мкл кДНК образца, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Анализ на каспазы 3, по производству инструкции. Нагрузка трех повторах на другой 96-луночный планшет с 1 мкл кДНК образца, TaqMan Gene Expression Master Mix, TaqMan Gene Expression Анализ на 18 лет, в соответствии с инструкциями производство (TaqMan Gene Expression Анализ протокола). Развести в ряды фракции кДНК из трех случайно выбранных, не подвергавшихся воздействию линзы. Выполнить серийные разведения вместе с ДНК из образцов в 96-луночный планшет.
  5. С помощью стандартного метода кривой для количественного определения результатов. Число циклов на пороге флуоресценции используется в качестве измерений в программное обеспечение MyiQ. Стандартная кривая выражении число циклов на пороге как функция относительной концентрации калибратора эс-лено для серийных разведений в каждой пластины. кДНК из трех не обработанные образцы объектив был использован для калибровки. Соотнесите пороговое число циклов для каждого образца в стандартной кривой для получения относительной концентрации образца кДНК измерить. И наконец, получить уровень экспрессии генов-мишеней, связывая относительной концентрации целевой ДНК к внутреннему контролю 18s кДНК.

4. Иммуногистохимического окрашивания

  1. Фиксация
    1. Проанализируйте глаза в PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4).
    2. Положить глаз в трубке, заполненной 4% параформальдегида (PFA) в ледяной течение 20 мин. Подготовка PFA 4% накануне. Хранить при температуре от +4 ° C до использования. PFA свежее течение примерно одной недели.
    3. Удалить PFA с микропипетки. Затем промыть ледяной PBS в течение 20 мин.
    4. Положить глаз сахарозы 30% при +4 ° С в течение ночи.
    5. Положить глаз в чашу с оптимальной температурой для резки (октябрь)-среде (ткани-Tek). Положить глаз в подходящем положении для секционирования.
    6. Заморозить в октябре-среды в течение сухого льда.
    7. Хранить при температуре от -70 ° C до использования.
  2. Секционирование
    1. Установите глаз крио-секционирования в соответствующей плоскости.
    2. Нарезать три толщиной 5 мкм середине сагиттальных срезах из центральной части каждой линзы. Откажитесь по крайней мере, 6 секций между последовательными разделов, чтобы избежать окрашивания же ядер в разных разделах.
    3. После того, как раздел был сокращен, осторожно положите слайд на нем. В этом разделе следует затем прилипают к слайду.
    4. Оставьте слайды в воздушно-сухой перед использованием. Слайды можно хранить при температуре от -20 ° C до необходимости.
  3. Флуоресценция иммуногистохимии
    1. Пусть образцы достичь комнатной температуры (5-10 мин).
    2. Ничья края в образцах с PAP-ручка (Invitrogen).
    3. Пусть граница сухих некоторое время (10 мин).
    4. Этикетка микроскопом.
    5. Увлажняет в 1 × PBS течение 15 мин.
    6. Permeabilize в стандартном решении блока в течение 30 мин.
    7. Добавить первичных антител (кроличьих поликлональных, дрова каспазы-3 антител Asp175 9661; технологии Сотовые сигнализации, Inc), разведенного 1:3000 в стандартных решений блока.
    8. Хранить во влажной камере при температуре +4 ° С в течение ночи.
    9. Стирать в PBS с помощью пипетки (3 × 5 мин) или путем погружения в большой ванне (> 15 мин, 1-2 изменениями).
    10. Добавить вторичные антитела (анти-кролик вторичные антитела с конкретным поглощением / спектра излучения), разбавленной 1:300 в стандартном решении блока.
    11. Стирать в PBS с помощью пипетки (3 × 5 мин) или путем погружения в большой ванне (> 15 мин, 1-2 изменениями).
    12. Протрите PAP-мазки пера.
    13. Хранить во влажной камере при комнатной температуре в течение 3 часов. Избегайте воздействия света.
    14. Добавить каплю Vectashield и поместите крышку скольжения на слайде. Избегайте пузырей.
    15. Пусть Vectashield затвердевают (~ 20 мин).
    16. Держите разделы Iп темноте, пока анализ.
    17. Все управляющие разделы обрабатываются в отсутствие первичного антитела.
    18. Посмотрите на результаты в течение нескольких часов под флуоресцентным микроскопом.
    19. Граф ядра эпителиальной клетки ", с одной стороны ядерной лук на другую сторону ядерной носовой части каждого объектива. Применение стандартных синим фильтром, чтобы увидеть все эпителиальных ядер в синих и стандартный фильтр, который соответствует излучению вторичные антитела, чтобы увидеть каспазы-3 положительных ядер в зеленый цвет.
    20. Запись числа всех эпителиальных ядер и число положительных ядер. Подсчет клеток в три раза для каждого раздела.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Различных источников вариации в измерениях были оценены с дисперсионного анализа и было установлено, что с учетом трех измерений на одно животное дисперсии для измерения составляла порядка 15%, что для животных. Таким образом, учитывая весь анализ линзы, это не возможно увеличить точность. Ортогональные тестирования выяснить статистически значимых контраст для каспазы-3 сообщении между 120 ч. Интервал задержки по сравнению с более короткими интервалами задержки.

В естественных условиях

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Эта статья описывает методы, позволяющие изучения молекулярных событий, происходящих во время УВР-B индуцированной катаракты.

Учитывая, что большая часть информации доступна в естественных UVR индуцированной катаракты была получена из опытов на белых Sprague-Dawley крыс 7, 16, 17, 18, ​​19, мы решили использовать альбиноса Sprague-Dawley крыс в данном исследовании. Возраст крыс было шесть недель назад. Пол был выбран, чтобы быть женщиной, потому что, в отличие от му...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана Каролинского института KID финансирования, Шведское управление по радиационной защите, Каролинского института глаз Research Foundation, Gun оч Бертиль Stohnes Stiftelse, Санкт-Эрик Eye Hospital Research Foundation, Ögonfonden, Konung Густав V: с оч Drottning Viktorias Frimurarstiftelse.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Ketalar Pfizer 150086 50 мг / мл
Rompun Bayer 022545 20 мг / мл
Глазная мазь Simplex Apoteket, Швеция 336164 5 г
Mydriacyl Alcon 00352 10 мг / мл
Сбалансированный солевой раствор Alcon 0007950055
3,5 ул β-меркаптоэтанола
NucleoSpin РНК II общей РНК изоляции комплект Macherey-Nagel GmbH & Co, Дюрен, Германия 740955,50
p53 ДНК специфических праймеров biomers.net GmbH На заказ
Taq ДНК-полимеразы, dNTPack Roche 04 728 866 001
Агароза Сигма A5093
Этидия бромид раствор 0,5 мг / мл Сигма E1385
Nano-Drop ND-1000 спектрофотометр NanoDrop продукты
1-й Strand набора для синтеза кДНК для RT-PCR (AMV) Roche Diagnostics GmbH 11 483 188 001
iCycler MyiQ одноцветные ПЦР в реальном времени система обнаружения Bio-Rad Laboratories
96-луночный планшет Sarstedt 72.1979.202
TaqMan Gene Expression Master Mix Applied Biosystems 4369016
TaqMan Gene Expression Анализ на каспазы 3 Applied Biosystems Rn00563902_m1
TaqMan Gene Expression Анализ на 18 лет Applied Biosystems Hs99999901_s1
MyiQ программного обеспечения Bio-Rad Laboratories
Расколотая каспазы-3 (Asp175) Cell Signaling Technology 9661
Анти IgG кролика Abcam Ab6798
Сахароза Sigma Aldrich 84097
Vectashield Vector Laboratories
Универсальный Микроскоп Axioplan 2 Imaging Carl Zeiss
Параформальдегид Sigma Aldrich 441244
TBE буфер 10x Promega V4251

Ссылки

  1. Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
  2. Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
  3. Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
  4. Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
  5. McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
  6. Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
  7. Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
  8. Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
  9. McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
  10. Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
  11. Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
  12. Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
  13. Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
  14. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
  15. Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
  16. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
  17. Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
  18. Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  19. Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
  20. Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
  21. Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

3
Характеристика молекулярных механизмов
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.