Методическая статья

В ово Электропорация в Chick мозга для изучения функции генов в развитии дофаминергической Нейрон

DOI:

10.3791/4017

⸱

3 августа 2012 г.

 ,  , 
1Northwestern University Feinberg School of Medicine, Children's Hospital of Chicago Research Center, 2Departments of Pediatrics, Neurology and Physiology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для оценки функции и регуляции генов во время развития мозга дофаминергических нейронов, мы опишем метод, который включает в себя В ово Электропорации плазмидной конструкции ДНК в эмбриональных куриных вентральной предшественников мозга дофаминергических нейронов. Этот метод может быть использован для достижения эффективной экспрессии генов, представляющих интерес для изучения различных аспектов развития мозга и дофаминергической дифференциации нейронов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дофаминергических нейронов расположены в брюшной управления движением мозга, эмоциональное поведение и механизмы вознаграждения 1-3. Дисфункция мозга вентральной дофаминергических нейронов вовлечено в болезнь Паркинсона, шизофрения, депрессия и слабоумие 1-5. Таким образом, изучение регуляции дифференциации мозга дофаминергических нейронов не только обеспечивают важное понимание механизмов, регулирующих развитие мозга и нервной спецификации судьба предшественников, но и помочь в разработке новых терапевтических стратегий в лечении различных неврологических заболеваний человека.

Дофаминергических нейронов отличить от нейронных предшественников, выстилающих желудочковой зоны эмбрионального вентрального среднего мозга. Развитие нейронных предшественников контролируется экспрессия генов программы 6,7. Здесь мы сообщаем о методах использования электропорации выразить генов, в среднем мозге Гамбургера Гамильтон (HH) этап 11 (йirteen сомитов, 42 часов) куриных эмбрионов 8,9. Внешний развитие куриных эмбрионов позволяет удобно экспериментальных манипуляций в определенных эмбриональной стадии, последствия определяются на более позднем времени развития пунктов 10-13. Чик эмбриональной нервной трубы раньше, чем HH стадии 13 (девятнадцать сомитов, 48 часов) состоит из мультипотентных нейронных предшественников, которые способны дифференцироваться в различные типы клеток нервной системы. Вектор pCAG, который содержит промотор CMV и куриных β-актина усилитель, позволяющий для надежной выражение флаг или другой эпитоп с метками конструкций в эмбриональных куриных нейронных трубы 14. В этом докладе, мы подчеркиваем, специальные меры для обеспечения региональной ограниченной экспрессии генов в эмбриональных дофаминергических мозга предшественников нейронов, в том числе, как вводить ДНК создает в частности в области эмбрионального мозга и как определить электропорации с небольшой заказ электроды. Анализируя сзахолустный мозга на более поздних стадиях обеспечивает превосходную в естественных условиях система плазмиды вектор-опосредованного усиления из-функции и потерей функции исследования мозга развития. Модификация экспериментальная система может продлить анализа в других частях нервной системы, для проведения анализа и отображение судьбы для изучения регуляции экспрессии генов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поставка Подготовка (не видео)

  1. Подготовить новую 1X разведения пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep) в 1X PBS. Не более 50 мл необходимо. Фильтр с 0,22 мкм фильтр шприца.
  2. Подготовка инъекций конструкции путем объединения желаемого плазмиды конструкций. Ставим все конструкции в pCAG-Flag вектор с соответствующими стехиометрии до конечного объема ~ 10 мкл. Кроме того, pCAG-GFP 14 или pCAG-mCherry следует добавить для отслеживания эффективности электропорации и электропорации клеток. Мы используем pCAG-mCherry для этого эксперимента. Наконец, добавьте 0,22 мкм фильтрацией Быстрый зеленый краситель в смеси ДНК плазмиды в конечной концентрации 0,05% для визуализации эффективность инжекции в эмбриональном midbrains цыпленка.

2. Подготовка яиц (в видео)

  1. Для того чтобы получить HH этап 11 эмбрионов, яйца должны быть инкубировали при 100 ° F (37,8 ° C) в течение 41 часов после оплодотворения с 25-40% влажности. Местояйца на их стороне и отметьте в верхней части каждой карандашом тире. Поместите лотки в предварительно нагретой, увлажненном инкубаторе. Медленно рок яйца, установив поворотный функции инкубатора платформы "Автоматически". Проверьте влажность и уровень воды каждые 24 часа.
  2. Перед запуском эксперимента, удалите яйца из инкубатора и оставить при комнатной температуре. Это поможет замедлить развитие и не допустить на развитие.
  3. Очистить поверхность каждого яйца с 70% этанола и протереть с Kimwipe.
  4. Возьмите два 4 см куски скотча и прикрепить их бок о бок на яйцо, чтобы сделать большой прямоугольник поверх карандаша тире. Гладкие ленты с яйцом. Это где окна не будет. Лента будет препятствовать небольшие кусочки скорлупы от падения, когда окно разрезать.
  5. Используйте шприц 10 мл и 18 ½ иглы привлечь 5 мл альбумина из яйца. После прокалывания оболочки, угол иглы от желтка, чтобы не беспокоитьили повреждение эмбриона при удалении альбумина. Очистите иглу с 70% этанола между яйцами, но убедитесь, что игла сухая до прокалывания следующее яйцо.

3. Стеклянный иглу подготовка (в видео)

  1. Инъекция иглы с использованием следующих параметров Горячие / коричневый микропипетки Puller (Саттер инструмент Модель P-97): тепло 670, тяга 120, Vel 40, время 165. Всемирный точных приборов (API), 4 дюйма 1,0 мм тонкими стенками капиллярных стекла (API TW100F-4) используется для игл.
  2. Загрузка вытащил стекло иглой помощью пипетки P10 и давно кончик капиллярной загрузки пипетки (Eppendorf 5242956,003). Загрузка 5-10 мкл, в зависимости от того, сколько яиц для инъекций. Заполните стеклянную иглу медленно, создавая непрерывный столбец плазмиды решение отсутствует пузырьков воздуха.
  3. Поместите загруженный иглу в иглодержатель прикреплены к микроманипулятор (Narishige MM3) и Picospritzer III microinjector. Просмотр иглы под dissectiна микроскоп и обрезать иглы в точке, где зеленая жидкость останавливает. Это позволяет использовать темный фон, чтобы лучше представить себе иглу. Правильная обрезка игла приходит с практикой.

4. Мозга / Нейронные инъекций труб (в видео)

  1. Используйте весной ножницы для резки 2-2,5 см в диаметре окна в яйце. Запустите окно от предыдущего отверстия иглы сделаны при составлении альбумина, и вращать яйцо в руке, как бы Вы. Будьте уверены, чтобы счистить с ножницами Kimwipe насыщенный в 70% этаноле между яйцами.
  2. Просмотр куриных эмбрионов при вскрытии микроскопом. Это может быть необходимо для тренировки глаз. Это может помочь визуализировать эмбрион путем инъекции 0,22 мкм-фильтром на 20% тушь в PBS в куриных эмбрионах. Тем не менее, мы обнаружили, что этот шаг следует избегать, если возможно, так как она имеет тенденцию к снижению выживания.
  3. Инъекция работает лучше, если эмбрион помещается в параллельном пути иглы, с головой от иглы.Медленно пробить нервной трубки на 45 градусов в среднем мозге, задний мозг перехода. Это очень важно для только заполнить нервной пузырь представляет мозга плазмидной ДНК и быстрый зеленый краситель, без существенных диффузии в передний мозг и задний мозг регионах. Начать инъекции продолжительность набора Picospritzer microinjector при 25 мс; это возможно, должны быть изменены в зависимости от иглы отделкой. В целом, использование 10-50 мс.

5. Электропорация (в видео)

  1. Получить инъекционной иглой. Место 3 капли 1X Pen / Strep в PBS решение в яйце на эмбрион.
  2. Проверьте настройки электропоратора BTX EMC830:
    НАПРЯЖЕНИЕ: 20 В
    Длительность импульса: 25 мс
    # Импульсов: 3
    INTERVAL: 500 мс
    Полярность:
  3. Поместите 2 мм L-формы платиновыми электродами на одном горизонтальном уровне, что и в нижней части нервной трубки, с эмбрионального мозга сидит в середине между двумя 3 мм друг от друга электроды. Калибровка электродов в нижней части нервной трубки имеет решающее значение для эффективного электропорации брюшного мозга. Для достижения мозга конкретного электропорация, мы заменили оригинальные BTX с двумя электродами на заказ платину Г-образный электроды с короткой длиной 2 мм советы. Эти платиновые электроды изготовлены из платины диаметром 0,5 мм провода (Alfa Aesar). Эти платиновые электроды достаточно долго, чтобы покрыть мозга сцены 11 куриного эмбриона, что составляет около 0,9 мм длины, без ориентации значительной части переднего мозга или задний мозг регионах. Нажмите на педаль BTX раз. Пузырьки воздуха должен быть сформирован вокруг электродов с каждой успешной электропорации. Осторожно снимите электроды из яйца и протрите электрод с с 70% этанола покрытые Kimwipe. Положите еще 3 капли 1X Pen / Strep решение в яйце, на эмбрион.
  4. Закройте окно с 5 см х 5 см кусок ясно лента упаковки. Будьте уверены, чтобы запечатать яйцо и хорошо, что яйца содержание не вступают в контакт с лентой.

6. Инкубируйте и урожай

  1. Положите яйцо обратно в инкубатор. Убедитесь, что поворот платформы инкубатор выключен. Инкубировать яйца до нужной стадии HH 23 достигнута.
  2. Урожай жизни эмбриона и помещать их в общие PBS заполненные чашки Петри для каждого состояния. Экран собран эмбрионов под флуоресцентным микроскопом рассечение, оставив только эмбрионы с выражением mCherry.
  3. Передача эмбриона на отдельные лунки 24-луночных блюдо. Заполните каждую лунку с 1 мл свежеприготовленного 2% параформальдегида (PFA) и позволяют фиксировать 2-3 часов при температуре 4 ° C.
  4. Вымойте фиксированных эмбрионов в три раза по 10 минут каждый в PBS. Место эмбриона последовательно яN 15% и 30% сахарозы, до уравновешенной. Эмбрионы первоначально будет плавать в сахарозу, но снизится на равновесие.
  5. Проверьте эмбрионов под флуоресцентным микроскопом рассечение, заметок по образцу mCherry выражения и уровня для каждого эмбриона. Вставить каждого эмбриона в октябре Это очень важно ориентироваться правильно эмбрионов для получения оптимального сечения среднего мозга для последующего анализа (рис. 1).
  6. Подготовить 18 мкм разделы мозга использовании криостат Leica CM3050S. Анализ развития мозга и дофаминергических нейронов дифференциация по иммунной соответствующие маркеры типа клеток.

7. Представитель Результаты

Схематическое изображение electroporating и анализа эмбрионального мозга куриных показано на рисунке 1. Успешно введены и электропорации куриных эмбрионов, mCherry выражения должны быть видны в области среднего мозга после того, как дальнейшее развитие ( (рис. 2D). Вообще, около 50% брюшного мозга нейронных предшественников можно эффективно трансфицированных выше протокол. Спецификация дофаминергических судьбу электропорации нейронных предшественников могут быть рассмотрены совместно локализации mCherry, флаг с метками гена с маркерами дофаминергических нейронов, таких как тирозин гидроксилазы (ТН) (рис. 3). Структурирование предок доменов в вентральной мозга могут быть исследованы путем совместного immnostaining cryosections с различными маркерами области предшественников.

Недостаточная выражение mCherry о том, что внематочная гены, вероятно, не эффективно выражена. Эмбрионы при этом условии не должны быть использованы для дальнейших исследований. Кроме того, эмбрионы,не дожить до конца экспериментальной процедуры не могут быть использованы для сбора и анализа данных.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Иллюстрация эмбрионального мозга цыпленок в ово анализа электропорации. HH стадии эмбрионального 11 куриных эмбрионов вводят pCAG-mCherry вместе с генами интерес смешать с зеленым быстро визуализировать процесс инжекции (A). После того, как заполнены конструкции ДНК, которые midbrains электропорации с квадратным электропоратора волны. Эмбрионы далее инкубировать до желаемой HH этап 23 достигнута. Затем mCherry-положительных эмбрионов собираются, фиксированы, и встроенный (B). Мозга cryosections готовятся секущих указывает белая линия на рисунке 1b, и анализируется с иммунной мозга маркеров, таких как тирозин гидроксилазы (TH) (С). нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Подготовка cryosections из эмбриональных мозга цыпленка. После 41 часов инкубации, HH этап 23 куриных эмбрионов выражения mCherry и гены, имеющие интерес собирают (A, B и C), установленный с PFA, обработанные с сахарозой, а также встроенных в октябре для cryosectioning. Куриных эмбрионов тщательно ориентированы на обеспечение подготовки мозга разделов. Типичная морфология эмбриона и плоскости резания для получения среднего мозга секций показано на рисунке (D). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

figure-protocol-3
Рисунок 3. Анализ электропорации разделов мозга. Cryosections из эмбрионов с высоким уровнем экспрессии mCherry (А) готовят и окрашивают антителх годов, которые признают флаг с метками гена (B) и дофаминергических нейронов мозга маркером TH (C). Эмбриональные midbrains электропорации с pCAG-mCherry и pCAG-Flag пустой вектор служить в качестве контроля. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ово электропорации эмбриональных мозга куриных предлагает недорогой и быстрой альтернативой поколение трансгенных животных или нокаут выполнять в естественных условиях изучения функций генов в мозге развития дофаминергических нейронов. Используя короткие длиной 2 мм L-формы платиновыми электродами вместе с эмбриональными мозга конкретного ДНК инъекций является ключевым для достижения эффективной экспрессии гена интерес мозга дофаминергических предшественники нейронов. Кроме того, используя правильный...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют потенциал конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Такахико Мацуда для обеспечения pCAG-mCherry построить. YCM поддерживается премии развития карьеры от Швеппе фонда и грант от фонда Whitehall.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
Оплодотворенные яйца куриные Charles River лаборатории
Яйцо инкубатор Производство GQF Спортсмен 1502
BTX электропоратора BTX Гарвардского аппарата ECM830
Электроды BTX Гарвардского аппарата 45-0162 Г-образный genetrodes Для использования с ECM830 электропоратора
Платиновой проволоки, иридий Alfa Aesar # 10056 Диаметром 0,5 мм
Для приготовления 2 мм в длину электродов
Стеклянный капилляр Инструмент Всемирной Precision TW100F-4
Microloader пипетки Эппендорф 5242 956.003
Тушь Скобы Фильтр 20% до использования
Microinjector Паркер автоматизации,
Parker Hannifin сотрудничества 		Picospritzer III
Флуоресцентный микроскоп вскрытия Leica MZ16F
Микропипетки съемник Саттер инструмент D-97

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
  2. Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
  3. Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson's disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
  4. Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
  5. Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
  6. Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
  7. Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
  8. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49(1951).
  9. Bellairs, R., Osmond, M. The atlas of chick development. , 2nd edn, Elsevier. (2005).
  10. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. 'Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
  11. Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
  12. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
  13. Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
  14. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
  15. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408(2007).
  16. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

mCherry

Похожие статьи